Jméno:
Datum:

Téma 11:                    Kryoprezervace izolovaných meristémů brambor


Kryoprezervace je neletální skladování pletiv při ultranízkých teplotách. Využívá se pro
minimalizace růstu a vývoje in vitro, k uchování životaschopnosti a genetické stability
šlechtitelských materiálů, k zachování plného vývojového a funkčního potenciálu materiálu i pro
šetření pracnosti manipulací. Jednou z používaných metod je kryoprezervace s použitím enkapsulace a
dehydratace (Benson 1993). K enkapsulaci se používá alginát sodný. Touto metodou lze enkapsulovat
izolované meristémy, kalusy, suspenzní kultury apod.


Obecný postup při enkapsulaci/dehydrataci (Benson 1993)
 1. Kultura prýtů


 2. Aklimatizace kultury (nižší teplota, vyšší osmotická hodnota média)


 3. Izolace meristémů


 4. Přenos meristémů do 3% alginátu


 5. Nasátí alginátu s meristémy do špičky pipety


 6. Kapání kapek do roztoku s Ca^2+ ionty


 7. Polymerace alginátu (enkapsulace)


 8. Přenos alginátových kuliček s meristémy do roztoku sacharózy (dehydratace, 1-5 dní)


 9. Vysušení na Petriho misce v proudu vzduchu (laminární box, 1-4 hod)


10. Rychlé zmrazení v tekutém dusíku (-196°C)


11. Rychlé rozmrazení (vodní lázeň 37°C)


12. Testování životaschopnosti materiálu




Testování vlivu izolace a enkapsulace na životaschopnost meristémů Solanum tuberosum


Při používání metody kryoprezervace je nutno pro každý rostlinný materiál otestovat jednotlivé
kroky, aby bylo jisté, zda některý z nich nezpůsobuje ztrátu životaschopnosti materiálu. Tímto
postupem ověříme, zda izolace a enkapsulace meristému nebude pro ně letální.


Materiál:

Kultura prýtů Solanum tuberosum, 3% alginát sodný v médiu bez Ca^2+ iontů, 0,1M Ca^2+Cl[2], Petriho
misky s navlhčeným filtračním papírem, skalpel a pinzeta, kahan, laminární box, preparační
mikroskop, automatická pipeta, sterilní modré špičky se seříznutou špičkou


Postup:

(body 3. – 7. z výše uvedeného pracovního schématu)
 1. Z prýtů sterilní kultury Solanum tuberosum izolujte na navlhčeném filtračním papíru s použitím
preparačního mikroskopu axilární meristémy.
 2. Izolované meristémy vložte do roztoku alginátu sodného.
 3. Pipetou se seříznutou modrou špičkou nasajte alginát s meristémy.
 4. Kolmo postavenou pipetou pomalu odkapávejte alginát do roztoku Ca^2+Cl[2], tak aby se vytvářely
kapky s centrálně umístěným meristémem.
 5. Ponechte 30 minut polymerizovat.
 6. Vytvořené kuličky alginátu obsahující meristém přeneste na povrch M-S media do Petriho misky.


Hodnocení

V následujících týdnech vyhodnoťte růst meristému.


Literatura:
  * Benson E. E. (1993): Cryopreservation. – In Dixon R.A. and Gonzales R.A. /Eds. /: Plant Cell
Culture: A Practical Approach. - ILR Press, Oxford University Press.
  * Kováč J. (1995): The use of in vitro methods for plant genetic conservation (Využití kultur in
vitro k uchování genových zdrojů rostlin). – Zahradnictví, 22: 143 – 148.