Jméno: Datum: Téma 12: Přímá somatická embryogeneze z květních lůžek a listů cinerárie (popelivky) (Senecio x hybridus Hyl.) Materiál: úbory s uzavřenými poupaty a listy cinerárie (Senecio x hybridus Hyl.) Média: iniciační (SE): makro a mikroelementy Murashige a Skoog (1962), s přídavkem: 0,55 mM (1 g.l^-1) myoinositol, 2,9 μM (5 mg.l^-1) thiamin-HCl, 13,5 μM (3 mg.l^-1) 2,4-dichlofenoxyoctová kyselina (2,4-D), μM 4,5 (1 mg.l^-1) benzyladenin, 88 mM (30 g.l^-1) sacharosa, 0,8% (8g.l^-1) agar. kontrolní (MS): makro a mikroelementy Murashige a Skoog (1962), vitamíny B5 (Gamborg et al. 1969), 88 mM (30 g.l^-1) sacharosa, 0,8% (8g.l^-1) agar. Pokus 1. Iniciace somatické embryogeneze Povrchová desinfekce a příprava explantátu. Postup: 1. Lůžka květenství (úborů) 1. Úbory s uzavřenými poupaty s 2 cm stonkem se ponoří do 70% etanolu a ožehnou rychlým protažením plamenem kahanu. 2. Následuje desinfekce v roztoku 20% SAVO + 0,1% Triton X-100 po dobu 10 min. a trojí máchání ve sterilní destilované vodě. 3. Asepticky se odstraní lístky zákrovu a všechny květy a lůžko úboru se rozřízne vertikálně na poloviny. 4. (Při silné kontaminaci poupat se doporučuje použít opakovanou desinfekci (květní lůžko se znovu ponoří do 10% roztoku SAVO na 5 min a 3x máchá ve sterilní destilované vodě). 5. První explantát se položí na SE medium a označí A, druhý explantát na kontrolní médium MS a označí B, pořadovým číslem se pak značí jednotlivé úbory. 2. Listové čepele 1. Listy cinerárie kultivované v in vitro podmínkách se vyjmou sterilně na Petriho misku. 2. Listové čepele se rozříznou na dvě stejné poloviny. 3. První explantát se položí na SE medium a označí A, druhý explantát na kontrolní médium MS a označí se B, pořadovým číslem pak značíme explantáty z jednotlivých listů. 4. Kultivuj kultury ve tmě při teplotě 22 - 25°C. 5. Týdně kontroluj průběh kultivace, vyřazuj kontaminované kultury. 6. Po 2 a 4 týdnech vyhodnoť četnost somatické embryogeneze a zapiš do protokolu. Předpokládané výsledky: Od 2. týdne kultivace se na explantátech kultivovaných na SE médiu se vytvářejí shluky žlutých globulárních embryí. Ve 4. – 5. týdnu kultivace na SE médiu jsou explantáty pokryty žlutými až žlutozelenými somatickými embryi v globulárním až srdčitém vývojovém stadiu. Pokus 2. Dozrávání (maturace) somatických embryí a regenerace rostlin Iniciace a vývoj somatických embryí jsou často ovlivněny výživou a růstovými regulátory. Složení indukčních, udržovacích, maturačních a zakořeňovacích médií se často liší. Např. iniciační média obsahují vysoké koncentrace auxinů a nebo auxinům podobných komponent. Naproti tomu maturační média neobsahují růstové regulátory nebo jen jejich velmi nízké koncentrace. Zakořeňovací média mají často redukovanou koncentraci základních solí a cukru. Materiál: Petriho misky s MS médiem + 0,5% aktivní uhlí Petriho misky s MS médiem bez růstových regulátorů kultivační nádoby Magenta s MS médiem bez růstových regulátorů rašelinová multiplata, rašelinový substrát, mikrotenové sáčky Postup: 1. Založ experiment, jak je popsáno výše. 2. Přenes explantáty označené písmenem A na MS medium obsahující aktivní uhlí a označ jako variantu C, po 3 dnech kultivace je přenes na MS medium bez růstových regulátorů. 3. Paralelně s bodem 2. přenes další explantáty označené písmenem A na čerstvé MS médium bez růstových regulátorů a označ jako variantu D. 4. Kultivuj všechny kultury za stejných podmínek popsaných výše. Rozděl somatická embrya podle kategorií (globulární, srdčitá, kotyledonární), spočítej je a zapiš do protokolu. 5. Odděl kotyledonární embrya od explantátu a přenes je na MS médium bez růstových regulátorů. Kultivuj na světle (25 – 75 μmol.m^-2.s^-1) ve 22°C. 6. Rostliny 2 cm vysoké přenes do skleníku do vlhkého rašelinového substrátu a překryj mikrotenovým sáčkem (nebo vlož do mikropařeniště). 7. Po 2 – 3 týdnech aklimatizace (postupné větrání rostlin) přesaď rostliny do květináčů a dále pěstuj podle požadavků kultury. Předpokládané výsledky: Somatická embrya varianty A se vytváří přímo na explantátu a nerovnoměrně se vyvíjejí – pozorujeme všechna vývojová stádia. Asi 1/3 kotyledonárnách embryí přenesená na MS médium s aktivním uhlím vytvoří kořínky a prýty v průběhu 10 dní, ostatní přenášená přímo na M-S bez růstových regulátorů vytvoří pouze kořínek a nebo neklíčí. Většina rostlinek cinerárie odvozených ze somatických embryí se lehce aklimatizuje. Květy jsou sice menší, ale normálně tvarované a vybarvené. Literatura: Malueg K.R. et al. (1994): A three media transfer system for direct somatic embryogenesis from leaves of Senecio x hybridus Hyl. – Plant Cell Tissue, Organ Culture 36: 249 – 253.