Jméno:                                                                                  Datum:

Téma 14: Testování bakteriální a houbové kontaminace kultur explantátů


Přítomnost latentních mikroorganismů v kultuře in vitro ovlivňuje její růst a vývoj, množitelský
koeficient i aklimatizaci. Při kultivaci na klasických médiích používaných pro explantáty se
kontaminace mikroorganismy nemusí vždy hned projevit. Často se kontaminace manifestuje až při
dlouhodobé kultivaci. Segmenty listů, kořenů nebo prýtů pěstovaných kultur se proto při testování
inkubují na různých selekčních médiích, které jsou pro rozvoj mikroorganismů příhodnější.

Bakteriální kontaminaci kultur testujeme na širokospektrém médiu Leifert and Waites Sterility Test
Medium (Leifert et al. 1989) nebo na médiu B523 (Viss et al. 1991).


Materiál: Nodální segmenty kultur prýtů africké fialky (Saintpaulia ionantha Wendl.) brambor
(Solanum tuberosum L.), karafiátů (Dianthus sp.) a orchidejí (Potinara hybr.) apod.


Média:

testovací medium B523 (Viss et al. 1991) = kaseinhydrolyzát 8 g.l^-1, MgSO[4] . 7 H[2]O 0,15
g.l^-1, K[2]HPO[4] 2 g.l^-1, kvasničný extrakt 4 g.l^-1, 1% sacharosa, 1% agar

kontrola = MS medium: makro a mikroelementy MS, vitamíny B5, 2% sacharosa, 0,7% agar, pH 5,7


Postup:

1.    Vyjmi prýty sterilní pinzetou z kultivační lahve a polož je na sterilní Petriho misku
v aseptických podmínkách laminárního boxu.

2.    Odděl apikální segmenty prýtů a inokuluj je do udržovacího média pro další kultivaci.

3.    Rozřež zbylé prýty na jednotlivé nodální segmenty a tenké řezy.

4.    Do agarového B523 média zanoř segment (řez), pomalu jej vytáhni, polož na povrch media a
misku uzavři. Tímto postupem se inokulují i spodní vrstvy media s nízkou koncentrací O[2], která
podporuje růst některých anaerobních mikroorganismů.

5.    Stejným způsobem inokuluj i kontrolní misku s udržovacím MS médiem.

6.    Popiš misky s odpovídajícími segmenty, disky a apikálními segmenty prýtů.

7.    Inkubuj inokulované Petriho misky ve tmě při 22-30˚C po 3 týdny.


Hodnocení:

V následujících týdnech kontroluj čistotu kultur.

Kolonie na povrchu pevného média nebo halo v médiu indikují přítomnost kultivovatelných
mikroorganismů v kultuře.

Porovnej projevy kontaminace odpovídajících testovaných kultur na testovacím a MS médiu.

Zapiš výsledky do protokolu.


Literatura:

Leifert et al. (1989): J. Appl. Bacter. 67: 351 – 361.

Viss et al. (1991): In Vitro Cell Dev. Biol.-Pl. 27P,42.