Zajištění exprese klonovaných genů a její optimalizace Faktory ovliv ující expresi klonovaných gen A. Regulační sekvence pro genovou expresi 1. Transkripce • Síla promotoru • Terminátor transkripce • Stabilita mRNA 2. Translace • struktura vazebného místa pro ribozom • využívání kodonů • stabilita proteinu 3. Transport proteinu • charakter signální sekvence B. Vlastnosti vektorů • Počet kopií vektoru • Stabilita vektoru C. Fyziologie hostitelské buňky • růstové podmínky • enzymový aparát hostitelské buňky 1 Signály ovlivňující transkripci a translaci strukturního genu (bakterie E. coli) Regulační sit;iiúl> pro transkripci Regulační signály pro iniciaci translace _ TGTTGACA -35 -10 +1 TATAATG Vedouc!sekvence mRNA Signální peptid Klonovaný gen 1 protein TAACGAC ATG sroř 2 Sekvence přirozených a hybridních promotorů -35 Region 17 bp -10 Region 1 234567í9 1011121314151317 CONSENSUS •••TTGACA.................TATAAT ■ ■ lac GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGT lip CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTAACTAG 1PL tec A tací tacll GTGTTGACATAAATACCA CACTTGATACTGTATGAA CTGGCGGTGATACTGA GCATACAGTATAATTG CTGTTGACAATTAATCAT CTGTTGACAATTAATCAT CGGCTCGTATAATGT CGAACTAGTTTAATGT +1 Hybridní promotory 15-18 bp 5-9 bp Sekvence lac, trp a tac promotoru Hybridní promotor 3 Regulovatelné promotory používané v expresních vektorech Promotor Zdroj Způsob regulace £. coli Leftward and rightward early promoters of £ co/Z/jcoperon £ cotffrpoperon trp*35 region /?C*10 region hybrid £ coA'aJkaline phosphatase operon f. cotirecA gene Tnffl te t recycli ne-resistence gene Oŕí 3{TC Tryptophan in medium Excess phosphate in medium On >3TC itn rl^j host} IPTG m [medium Indoteacetic acid in medium IPTG .in medium Phosphate-limited medium Mitomycin C in medium Tetracyclines irt medium Promotory fága lambda vykazují velmi striktní kontrolu transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu nedochází vůbec k transkripci, na rozdíl od promotorů „metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá pořád. Promotor Zdroj Způsob regulace Off On 8. Sí/btíSs 1 bia Sadttus - (Madams ft'cherifformis in medium p* facta ma se gene ran Savffus pumifis - Chloramphenicol chloramphenicol in medium acetyl tran ifei Streptemyces gyi Streptorrtyces Glucose in Glycerol in medium medium glycerol operon S, cerevisiae AÜH Yeast repressLble High glucose Low glucose alcohol dehydrogenase in medium in medium \A0ft) gene GAU Yeast galactose Glucose in Galactose, in utilisation operon medium medium GPD-PX05 Hybrid between yeast Excess phosphate Phosphate-limited glyceraldehyde in medium medium 3-phosphate dehydrogenase and afkeline phosphatase £ene promoters 4 Vliv vzdálenosti mezi promotorem a startem translace na množství vytvářeného proteinu cro změny vzdálenosti Transcription from lac promoter i-*■ Recognition sequence for endonuclease earn Hi Translational start signal for cro gene AATTOTGAeCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAaí5ATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAe6AGQT:TGTAT TTAACACTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCCTTTGTCCTAGGCCCTeATAAAATGGATACCGCCACTATTACCAACGTACATGATTCCTCCAACATAC Delece různého rozsahu pTR213 PTR199 pTR214 pTR1S8 pTR194 PTR210 pTR182 ^ pTR190 Relativní množství produkovaného proteinu cro Sekundární struktura cro-mRNA 163% 8% 100% 5 Vliv regulačních sekvencí na výtěžek t-antigenu SV40 z různých plazmidových konstruktů % celkového proteinu Vzdálenost SD-ATG Sekvence oblasti pro iniciaci translace vektor 0.068 9 AGGAAACAGAAAGATGGAT pTR436 1.0 9 AGGAAACAGCCAGATGGAT HP1 0.01 5 GTCGAGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-372 0.1 5 ATTGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-37 2.5 8 TTGGAATTATTCCATGGAT pPLcSVt5-379 1.0 9 TTGGAATTAATTCCATGGAT pPLcSVt5-374 0.01 9 AGGAATTCCAAAGATGGAT pPLcSVt5-72 Sekundární struktura mRNA (pro t-antigen) v oblasti iniciačního kodonu v různých plazmidových konstruktech 0,07 ů a E 1,0 i | AUG —► G g í 1 !"!/'s \ -n _ i. _u_uLJ *-A „pa-l AÍG&ÉÍiĚu 1 LÚ 11 au A a ůůqSíIÍ? 5 | "v«. 16ac ; 1 r" i. T í ■ j .uu"«., »UWtfW» i SD —► § # 0 1,0 /; «\ J&S c ř-Gi-r Q £5 p "{ a-J a-u a-U 0,01 >ř G-t ^«S& řSG4- a í a YĚ\ a ^auaaa[]"JLiJUAAB \f£ LEUtl V í_ AAaAuJŮ a <■ £ b a * b j, I a-m * a . u » ACůQAfl a-lf a A' * e i- r a* J u AU C-n LI «■ 6 C " C-C ia,iT i A c. 6 Posun vzdálenosti mezi promotorem a klonovaným genem kohezní EcoRI konce / \ Restriktion mit SamHI různý obsah odbourání DNA u jednotlivých molekul /\ EcoRI klonovaný gen /ac-Promotor- fragment (95 Basenpaare) posun vzdálenosti klonovaný gen EcoRI Použití teplotně senzitivního represoru pro kontrolu promotoru PL fága X cI857 I inaktivní klonovací místo Promotory fága lambda vykazují striktní kontrolu transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu k transkripci vůbec nedochází, na rozdíl od promotorů "metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá stále. Problém s termoindukcí u ts promotorů je ve velkokapacitních nádobách, kde je obtížné zvýšit rychle teplotu z 30 na 41°C. chromozom E. co/i cI857- , ----Lambda cI857-lysogen Při 32°C se termolabilní represor cI857 kódovaný genem cl na chromozomu váže na operátor OL na plazmidu a zabraňuje transkripci z promotoru PL. Zvýšením teploty na 41°C je represor inaktivován, uv olní se z operátoru a transkripce probíhá. 7 Regulace genové exprese promotorem pL fága X -L cl gene TT Při 30°C se represor cl, který je konstitutivně syntetizován pod kontrolou vlastního promotoru pcI, váže na operátor oL promotoru pL a tím zabraňuje expresi cílového genu pl Target geiMř TT 3- Active cl prtííei. Při 42°C je ts represor cl inaktivován a dochází k transkripci cílového genu cl geícií Tcm^l gertů TT Expresní vektory obsahující T7-promotor RNA-polymeráza T7 rozpoznává pouze promotory genů fága T7 Gen kódující T7-polymerázu 8 Regulace genové exprese cílového genu kontrolovanané promotorem pT7 fága T7 T7 RNA polymerase lair repressoi rA r>br 17 RNA polymerase gene Za nepřítomnosti induktoru (IPTG) represor lac reprimuje syntézu T7-polymerázy, která je pod kontrolou lac promotoru a lac operátoru a cílový gen se netraskribuje. Po přidání IPTG je lac-represor inaktivován, T7-polymeáza se tvoří a je transkribován cílový gen Systém T7 pro expresi proteinu v E. coli £ coli RNA polymerase ** lacO jy4, lad gene Target gene \ T7 promoter j i Expresní lacO vektor Druhý vektor určený k inaktivaci nízké hladiny T7-pol vytvářené i bez indukce 9 Terminátory transkripce používané v expresních vektorech u E. coli a) terminátory T1 a T2 bakteriofága lambda b) terminátory T1 a T2 z operonu rrnB rRNA E. coli používají se v tandemu Účinná terminace transkripce je esenciální pro dosažení vysoké hladiny exprese: - zvyšuje stabilitu mRNA, - zvyšuje hladinu akumulovaných proteinů. Stabilita mRNA • Rychlost syntézy proteinu závisí na množství mRNA v buňce • Existuje rovnováha mezi syntézou a rozkladem daného druhu Mrna /turnover/ Snížení rozkladu mRNA (kombinované působení endonukleázy a 3'exonukleázy) • u E. coli činí poločas rozpadu molekul mRNA 1-2 minut • poločas rozpadu mRNA genu 32 bakteriofága T4 je 20 minut a více - za zvýšenou stabilitu jsou odpovědné specifické sekvence, které se nacházejí před iniciačním kodonem genu 32 - díky této 5' nepřekládané sekvenci mohou být také stabilizovány jiné mRNA molekuly. • Konstrukce plazmidu s expresní kazetou genu 32, pomocí níž je možné v buňkách E. coli syntetizovat velká množství cizích proteinů. Vzniklé hybridní transkripty mají dlouhou životnost. Poločas rozpadu se podle klonované sekvence pohybuje od 4 do 10 minut. 10 Zajištění účinné translace Interakce mRNA s 16S rRNA při iniciaci translace 16 S rRNA 3 AU UCCUCC ACUAG ^AGGAGGUL £ S-D sequence U u / u mRNA Iniciační kodon U G A C C IJ A U G fMet-tRNA f Ke t Kromě iniciačního kodonu AUG existují v RBS ještě tři další oblasti, jejichž sekvence jsou více či méně konzervovány: 1. Shine-Dalgarnova sekvence, níž se obvykle vyskytuje sekvence 5'UAAGGAGGU 3'. 2. U mRNA (alespoň polycistronické) jsou součástí RBS jeden nebo více terminačních kodonů. 3. U genů, kteréjsou silně exprimovány (např. geny pro fágové kapsidy nebo ribozomální proteiny), se v RBS nachází sekvence PuPuUUUPuPu (nebo sekvence jí podobná). Bývá označována též jako RRUUURR sekvence. Může se vyskytovat vedle SD-sekvence nebo místo ní. Ukazuje se, že přítomnost této sekvence je nezbytná pro translaci eukaryotických genů v E. coli, jak bylo zjištěno při expresi malého T antigenu SV40. 11 Synteticky připravené ribozomové vazebné místo 1. S-D sekvence - 2. RRUUURR (GGTTTAA) - 3. Terminační kodon TAA - Klonovaný gen TAAGGAGGTTTA / to promoter — * —„ to coding sequence 3' ACGTATTCCTCCAAATTCGA 5' t t PstI cohesive end H;'ndIII cohesive end Zajištění účinné translace použitím optimalizované RBS 1 gen bez RBS a ATG, s terminačním kodonem RBS ATG lze pozměňovat sekvenci nebo vzdálenosti Gen zájmu vložen za RBS 12 Různé čtecí rámce vzhledem k iniciaci translace genů lacZ u tří různých vektorů ,- — čtecí rámce Sít AAZUV5 Proximální část genu pro p-gal 02 ÍAZ2 GJfAATT C c ttaaJIq ggg aatt c cgc ttaa g inzert EcoRI + 2GC inzert + 2GC ggggg aatt c ccccg ttaa] g inzert V devátém kodonu genu pro p-galaktozidázu je jedinečné místo pro EcoRI. Čtecí rámec, který tímto EcoRI místem začíná, byl označen jako O 1. Byly připraveny AAZ vektory se zabudovaným fragmentem v čtecích rámcích O 2 a O 3 připojením 2GC. Zvýšení genové exprese konstrukcí homopolycistronické sekvence RBS RBS jeden promotor jeden terminátor více kopií genu A RBS RBS Transcription Transcription from multiple RBSs -t—mRNA 13 m silně a slabě Srovnání využívání kodonú sil^ě a slab( exprimovaných genů u E. coli Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a R-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. Řešení problému rozdílného využívání kodonů 1. Koexprese genů pro tRNA pro alternativní kodony • příprava kmenů s klonovanými geny pro tRNA na samostatných vektorech • kmen E. coli Rosetta má geny pro tyto tRNA na plazmidu, který je kompatibilní s expresním vektorem. 2. Změna méně často používaných kodonů mutagenezí in vitro za kodony používané častěji (pracnější postup) 14 Dosažení vysoké exprese cizorodého genu v kmenech E. coli obsahujících geny pro vzácné tRNA Standardní kmen Plazmid s cizorodým genem Low level of foreign gene expression Upravený kmen Plazmid s cizorodým genem High level of foreign gene expression Zvýšení stability cizích proteinů v E. coli • Změna lokalizace (poločas krysího proinzulinu v E. coli je v cytoplazmě 2 min, v periplazmě 10 x vyšší) • Tvorba fúzních proteinů (bakteriální + eukaryotická část = beta-galaktozidáza + somatostatin, pak štěpení fúzního proteinu) • Exprese v mutantách E. coli s nižší aktivitou intracelulárních proteáz (lon-proteáza - zabraňuje akumulaci denaturovaných nebo jinak pozměněných polypeptidů). • Snížení degradace proteinů produktem genu pin fága T4 (protease inhibition) - stabilizace eukaryotických proteinů (interferon) 15 Zvýšení stability proteinů změnou sekvence jeho aminokyselin Stabilita p-galaktozidázy po přidání aminokyselin k jejímu N-konci Amino acid added Half-life Met, Ser, Ala >20 h Thr, Val, Gly >20 h Ile, Glu >30 min Tyr, Gln ~10 min Pro ~7 min Phe, Leu, Asp, Lys ~3 min Arg ~2 min PEST = aminokyseliny (prolin P, glutamová kys. E, serin S. treonin T), jejichž přítomnost v určitých vnitřních oblastech proteinu zvyšuje jeho citlivost k proteolytické degradaci Vytváření fúzních proteinů Fúzní protein: produkt vytvořený po spojení dvou nebo více genů/sekvencí: 1. Přirozený gen hostitelského organismu = stabilizující partner (cizí proteiny jsou v heterologních systémech často nestabilní) 2. Cizorodý gen (gen zájmu ) 3. +/- spojující sekvence (oligonukleotidový linker), kódující krátké úseky aminokyselin rozpoznávané nebakteriálními proteázami • umožňují dodatečné odštěpení cílového produktu z fúzního proteinu • používají se k purifikaci rekombinantních proteinů 16 Klonovací vektor pro p ípravu fúzních protein Selekční marker —*■ Zkrácený gen pro p-galaktozidázu, vložený mimo čtecí rámec ompF N-terminální část _j genu ompF Klonovací místo Signály pro transkripci, translaci a sekreci fúzního proteinu ... Cizorodý gen Tribridní protein Nap . antigen pro přípravu protilátek N které fúzní systémy používané k purifikaci cizorodých proteinů vytvářených v E. coli Fusion partner Size Ligand Elution condition ZZ 14 kDa IgG Low pH His tail 6-10 aa Ni2+ Imidazole Strep-tag 10 aa Streptavidin Iminobiotin PinPoint 13 kDa Streptavidin Biotin MBP 40 kDa Amylose Maltose p-Lactamase 27 kDa Phenyl-boronate Borate GST 25 kDa Glutathione Reducing agent Flag 8 aa Specific MAb Low calcium ZZ = fragment proteinu A (S. aureus); His = histidin; Strep-tag = peptid s afinitou ke streptavidinu; PinPoint = fragment proteinu biotinylovaný in vivo v E. coli; MBP = protein vázající maltózu; GST = glutation S-transferáza; Flag = peptid rozpoznávaný enterokinázou; Mab = monoklonální protilátka. 17 Proteolytické št pení fúzního proteinu krevním koagulačním faktorem Xa Rozpoznávací linkerová sekvence štěpená Xa Místo štěpení Thr-Ala-Glu-Gly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-Val-His-Leu Y Část prvního proteinu Y Funkční protein klonovaného genu Linkerová sekvence není štěpena bakteriálními proteázami Fig. 7-79. Thin sections of E. coli bacteria showing granules of ß-galactosidase/proinsulin fusion peptides (fixed in formaldehyde/glutaraldehyde according to Karnofsky; embedded in Epon; stained with uranylacetate/lead hydroxide; 38 000:1; Courtesy of Dr. W. Wetekam, Hoechst AG). 18 Tři možné způsoby transportu sekretovaných proteinů Growth medium A Vyžadovány produkty mnoha g dalších genů Vliv C Outer membrane Periplasmic space struktury C-konce Inner membrane Signal peptidase Pullulanase complex Signal peptidase Cytoplasm A. obecná exportní dráha (general export pathway, GEP) - SP + Sec proteiny (chaperony) B. dráha IgA-proteázy (SP + C-konec proteinu) C. dráha nezávislá na SP - vyžaduje ABC-transportery (ATP-dependentní transportní proteiny) 2 1 1 Příklady signálních sekvencí různých proteinů Konec ss bel ala leir Irp v^Bel flhe lau pro Telí 1*u ala \mhuLw- K-ltghr cMin IMwmJK) »if «P m»t ar-g ťa P" fi Sin iLe paie gA, pKe Lati lan Eml lvu 1** Pro <$r "if *f9 Čí1 -a«p Of*»třMírm* (CíiicktíiJ[5| meh ary sf-Uu l«u ILi Ku val Len cys ptie Sen ořu 1eif ate a [a IéJ jLť Ly* Pre-Craul-ri tinraani LfialUS] mři aLa ala asn sar gl- p.-q lYfl I* !tu rhr phritr lei. Lni tys Etu tou rifl pfů rjíň stu ala jly íLí Leu' IVř-tiL,eaprnIe»n WeslcuUr Stanurilis Virus.1 PHI mtr Ijfs'cya Leu len r,r Isu Ala pfi* lvu pfi* ILi -Hll ViV'Hll njffi -KytS Pra-p-l.atH*«é lpOR323f vririous prccurnorš for men5faran& proteins. {M), and a variety of secretary proteins {SJ. The verticil I line indicates ihc tr&rrsiilurj tioffl hydrophilic ío hydrophobic reasons witiiln tbc signal ieqnc-ntps, the arrow thesiart of the iKiturc ptůtůins. N-konec obsahující polární aminokyseliny Místo štěpení SP 1 i i —*—t— Hydrofobní aminokyseliny 19 Instabilita vektorů 1. Segregační instabilita: Ztráta plazmidu, ke které může dojít při dělení buněk v důsledku • chybění funkce par (partitioning) u některých vektorů (pBR322), která zaručuje rovnoměrné dělení kopií do dceřinných buněk. Problém lze řešit selekcí antibiotiky, nebo lze oblast par klonovat, např. z pSC101 do pBR322 a tím plazmidy stabilizovat. • vytváření multimerních forem plazmidu a následné nerovnoměrné dědění kopií do dceřiných buněk. Multimerní plazmidy nevznikají u ColE1, který využívá rekombinační systém cer xer, který rozkládá multimery. Toto místo lze klonovat do plazmidů typu pBR322 a eliminovat problémy s multimerizací. Možnou strategií pro překonání segregační instability je eliminace buněk, které plazmid ztratily (např. použití genu cI fága v klonovacím vektoru a využití lyzogenních hostitelů) 2. Strukturní instabilita: Důsledek delecí, inzercí nebo translokací v chromozomech, plazmidech nebo virech (homologní rekombinace a transpozice). Překonání segregační instability vektoru eliminací buněk, které vektor ztratily 1. krok 2. krok cl jr i 1 lyzogenizace V ( cI^tf..AjI ) 1 Ztráta vektoru Represor cI vytvářený rekombinantním vektorem udržuje buňku v lyzogenním stavu Indukce profága i Lyže buněk 20 )6c Vektory s dvojím plátkem replikace pro regulaci počtu kopií Nízkokopiový počátek replikace ori pSC101 P-RNAII nahrazen P-lambda očá Po átek replikace zajišťující vysoký počet kopií 30°C - aktivní je pouze ori pSC101 4 kopie plazmidu/ chromozom o ooooo o o0ooooďg5'cg 42°C - inaktivace represoru cl, aktivace X.pL, aktivace ori ColE1, 140 kopií plazmidu/ chromozom Příprava vektoru s regulovatelným ts-počátkem replikace a s regulovatelným ts-promotorem Fragment 1 obsahuje pL promotor a MCS Fragment 3 obsahuje selekční marker AmpR Buňky s pCP3 nejdříve rostou při 28°C, kde je cI funkční a promotor pL je vypnut a počet kopií pCP3 je nízký. Při 42°C je cI inaktivován, pL se aktivuje a počet kopií se zvýší více než 10x Mol Biotechn 127 21 Vliv teploty na počet kopií plazmidú u tří expresních vektorů Plasmid Plasmids/cell at: pL present 28°C -► 42°C pKN402 82 512 No pPLc2833 38 42 Yes pCP3 60 713 Yes D sledky vyplývající z p ítomnosti rekombinantního plazmidu v buňkách 1. Snížení růstové rychlosti buněk 2. Změny morfologie buněk, nebo zvýšená fragilita buněk 3. Restrukturalizace klonovaného genu (rekombinace) • výběr vhodného plazmidu RC x theta 22 Kompetice mezi pomalu rostoucími buňkami produkčního kmene (obsahuje vektor) a rychle rostoucími mutantami (které ztratily vektor) Po et bun k mutantů 1 buňka Čas 0 Mirtant (uma* = 0.693 h"1) . 1. ztráta rekombinantního plazmidu (x antibiotika) 2. snížení počtu kopií plazmidu 3. restrukturalizace transgenu Po et bun k produkčního kmene 2x106buněk Čas 0 Integrace klonovaného genu do bakteriálního chromozomu plazmid A Klonovaný gen A. Klonovaný gen je vložen do sekvence klonovaného úseku chromozomu, 2 x CO vede k integraci klonovaného genu. Chromozomová DNA S. B. Klonovaný gen je vložen poblíž klonovaného úseku chromozomu, 1 x CO vede k integraci celého plazmidu včetně klonovaného genu. 23 Počet kopií klonovaného genu pro a-amylázu v B. subtilis a její aktivita v buňkách Copies/genome 2 geny na chromozomu 5 7 8 9 Multicopy plasmid (20-40 kopií) Activity (U/mL of mid-log cells) 500 2,300 3,100 3,400 4,400 700 Gen pro a-amylázu z B. amyloliquefaciens byl vložen do oblasti pocházející z chromozomu B. subtilis naklonované v plazmidu E. coli, konstrukt byl vnesen do B. subtilis. Plazmid nesl rovněž geny pro rezistenci k chloramfenikolu a ampicilinu. Buňky B. subtilis s plazmidem byly pěstovány v prostředí s chloramfenikolem, což vedlo k selekci buněk se zvýšeným počtem kopií integrovaného plazmidu, tím zvýšení počtu kopií genu pro amylázu a ke zvýšení jejího množství v buňkách. Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1 | ATAACTTCOTATA > GCATACAT< .TATSCOAAGTIAT Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován 24 Odstran ní selek ního markeru po vnesení plazmidu do bakteriálního chromozomu Marker loxP gene loxP - Plasmid Homologous chromosomal DNA Homologous recombination - Cre protein 1« Gen cre je na samostatném plazmidu pod kontrolou lac promotoru (indukce IPTG) Vlivy prostředí ovlivňující expresi genů a tvorbu produktů 1. Složení kultivačního media, zdroje živin 2. Teplota 3. pH 4. Koncentrace kyslíku 25 D kaz tvorby cizorodého produktu Imunologické testy Enzymové testy SDS-PAGE Minibuňky Maxibuňky Transkripce a translace in vitro 26