• detailně prostudovaný druh
• snadný přenos DNA
• vysoká účinnost transformace
• k dispozici jsou R- mutanty
• existuje řada expresních vektorů, s regulovatelnými promotory
= řadu cizorodých proteinů nevytváří ve funkční podobě
= postrádá vedlejší metabolické dráhy
= neexkretuje proteiny
= nepatří k tradičním průmyslovým mikroorganismům
Výhody a nevýhody klonování v E. coli
• nedostatek vhodných vektorů
• nízká účinnost přenosu DNA do buněk
• negativní vliv RM-systémů
• nízká exprese klonovaných genů i selekčních markerů
• nízký počet kopií vektorů, jejich nestabilita
Vhodné jsou vektory se širokým spektrem hostitelů: transpozony
• stabilní začlenění do chromozomu
• nezatěžují hostitele extrachromozomovou DNA (průmyslové kmeny)
Poznatky z klonování v G- (jiných než E.coli)
a G+ bakteriích
Pomocný plazmid = Zdroj transponázy
Micrococcus, Pseudomonas
plazmid se širokým rozmezím
hostitele
Produkční kmeny
Využití transpozonů jako vektorů s širokým
rozmezím hostitele
Deriváty Tn7
• gen lacZ spojen s různými vektory
(deriváty pUC - vysoký počet kopií)
• vnesení do buněk na
sebevražedných vektorech (využití
inkompatibility)
Stabilní začlenění do chromozomu,
následné vnášení nových genů do
genu trpE
• produkují velká kvanta extracelulárních enzymů, které lze snadno
izolovat z media
• lze je snadno kultivovat a adaptovat na řadu podmínek kultivace
• lze připravit celou řadu mutant, hyperprodukujících enzymy a jiné
látky
• jsou nepatogenní pro vyšší organismy
• jsou modelem diferenciace prokaryotických buněk
Výhody klonování genů v Bacillus spp.
Itohiki-natto - národní potrava v Japonsku, fermentované sojové boby.
Natto je tradiční japonská potravina, fermentovaná sója, která se používá v japonské
kuchyni, ale i v tradiční medicíně. Má charakteristický, velmi nepříjemný zápach,
způsobený přítomností vitamínu K2. Japonci se dožívají velmi vysokého věku, což je
částečně připisováno i vysoké spotřebě sojových produktů a hlavně "natto". Využívá
se přitom její jednoznačný trombolitický účinek.
Mezi nejúčinnější komponenty "natto" patří fibrinolytický enzym
"natokináza". Snižuje viskozitu krve a tím zabraňuje zpomalení toku krve a možnosti
vytvoření trombu. Jeho antikoagulačně-fibrinolytický účinek je velmi vyrovnaný a
zabraňuje možnosti nadměrného rozpouštění fibrínu.
Kdy Natto NKCP pomáhá:
při nutnosti zvýšit prokrvování mozkových cév,
při potřebě zvýšit přítok krve v srdečních cévách, je prevencí infarktu,
je součástí prevence vzniku trombóz v těhotenství, po operaci, při onkologických
onemocněních, při cukrovce, při užívání antikoncepce apod.,
při problémech v oblasti dolních končetin (potrombotické stavy, bércové vředy,
otoky, zvýšená pigmentace, nedokrvování končetin),
je prevencí tzv. economy class syndromu (trombózy v průběhu dlouhých a častých
letů letadlem),
při arterioskleróze,
při osteoporóze
B. amyloliquefaciens - 90% průmyslově vyráběných enzymů
• alfa-amyláza, celuláza
• dextranáza, maltáza, pektátlyáza
• esteráza, alkalická fosfatáza
• proteázy (subtilizin)
• lysozym
• pektináza
Cizorodé látky
• interferon (myší, lidský)
• proinzulin
B. thuringiensis: δ-toxin
Příklady látek připravovaných
v druzích r. Bacillus
1. Transformace kompetentních buněk
2. Transformace plazmidovým vektorem nesoucím homologní sekvence („plasmid
rescue“)
3. Transformace protoplastů
Možnosti přenosu DNA do B. subtilis
Transformace kompetentních buněk B. subtilis plazmidovou DNA (CCC forma)
A. Monomerní heterologní plazmidová DNA
B. Oligomerní plazmidová DNA
C. Monomerní plazmidová DNA s částečnou homologií k chromozomové DNA B. subtilis.
Oblasti homologie jsou znázorněny tučně.
Hlavní výhoda: účinný přenos monomerních plazmidových molekul,
nezávislý na rekombinaci – DNA je přijímána jako dsDNA
Table 12.2 Comparison of the different methods of transforming B. subtilis
Plazmidy r. Bacillus:
• kryptické
• značně veliké, nevhodné pro konstrukci vektorů
• chybí vhodné selekční markery
Izolace plazmidových mutant se zvýšeným počtem kopií (800-1000)
2,9.106Tetracyclin-ResistenzpT127
3,0.106Kanamycin-ResistenzpUB110
2,7.106Streptomycin-ResistenzpSA0501
2,3.106Erythromycin-ResistenzpE194
Počet kopií
20-50
1,8.106Chloramphenicol-ResistenzpC194
VelikostFenotyp hostitelské buňkyPlasmid
Plazmidy S.aureus vhodné pro transformaci B. subtilis
Rozdíly v expresi markerů –
transkripční a translační úroveň
Konstrukce pendlujících vektorů pHV14 a pHV15
v E. coli ApR, CmR
v B. subtilis CmR, ApS
Chimerické pendlující vektory pro klonování
v B. subtilis
klonovací
místo
klonovací
místo
CAT – B. pumilus
P
1. Nestabilita plazmidů (segregační a strukturní)
2. Restrikce exogenní DNA
Table 12.4 B. subtilis – E. coli shuttle plasmids
Problémy:
Recipient: B. subtilis 6GM15 – obsahuje lacZD15 napojený na G+,
promotor + signály pro iniciaci translace
Struktura vektoru pro přímou selekci
v B. subtilis
Translační fúze CAT
z B. pumilis a lacZ z E. coli
Selekce = CmR, EryR
• transkripce: značný počet sigma-faktorů rozpoznávajících různé
promotory
• translace:
• vyšší stupeň konzervovanosti oblastí mRNA vázajících se na
ribozomy,
• odlišnost iniciačního kodonu (UUG n. GUG namísto AUG, aj),
• odlišné ribozomové proteiny zajišťující vazbu mRNA
(nastavení SD- AUG na 30S)
• odlišné využívání kodonů
• transport: signální sekvence (stejná funkce jako u E. coli)
Degradace proteinů vlivem silné proteolytické aktivity
• nutnost používat indukovatelné promotory: CAT
• snížení rozkladu přípravou proteáza-deficientních mutant (odstranění
6 exoproteáz: prodloužení poločasu rozpadu z 1,5 na 85 hodin)
Faktory ovlivňující expresi klonovaných
genů v B. subtilis
Lokalizace proteinů u G+ a G- bakterií
b) Gram-negative cell envelope
a) Gram-positive cell envelope
G+
G-
Signální sekvence u Bacillus jsou delší než u G- bakterií a eukaryot
Exprese cizorodých genů v B. subtilis
s využitím sekrečního vektoru
SS = signální sekvence alfa-amyláza z B. amyloliquefaciens
p RBS SS Foreign gene sequence Vector sequence
Transcription
Translation
Secretion
N C
Signal peptidase
cleavage
Exported foreign polypeptide
N C
Odštěpení signální
sekvence alfaamylázy
probíhá
přesně za 31 aa
Zkrácení kódující
oblasti alfa-amylázy
Signální sekvence
alfa-amylázy včetně
promotoru
Optimalizace spojení
kódujících sekvencí
Konstrukce plazmidového vektoru pro sekreci
interferonu
Místo štěpení
Kódující oblastPre-α
31 aa
Kódující sekvence
Nekódující sekvence
Plazmid nesoucí gen pro zralý IFNα2
1. Vytvoření oblasti
homologie pro začlenění
klonovacího vektoru
2. Klonování genu zájmu a
jeho přenos do recipienta
3. Možná amplifikace
začleněného genu
První recipient
Druhý recipient
Plazmid typu pBR322
s naklonovaným genem
Oblasti
Homologie
Oblasti
Homologie
1. Plasmid
Chromosom
Rekombinace
Plazmid obsahuje úsek homologní
s chromozomem recipientní buňky
Začlenění plazmidu do
chromozomu za vzniku „lešení“
Vnášení heterologních plazmidů do B. subtilis
s využitím „lešení“ („scaffolding“)
Rekombinace
KmR
Amplifikace KmR
30 kopií KmR
Vytváření delecí v chromozomu B. subtilis
Selekce klonů CmR
Začlenění reciprokou
rekombinací
Vyhledání homologních oblastí
na chromozomu B. subtilis
Náhodná linearizace DNA
během transformace
Vzájemně nesousedící oblasti
chromozomové DNA B. subtilis
Vektor, který se v B. subtilis nereplikuje
delece
„vyprošťování“ genů
Přenos
chromozomových
genů z B. subtilis
do E. coli
Klonování sekvencí chromozomu sousedících
s místy začlenění plazmidového vektoru
Klonování klastrů genů v požadovaném pořadí
Rozpoznávací sekvence SfiI –
vnitřní část (NNNN) je variabilní
Amplifikace genu A pomocí PCR
s primery nesoucími v extenzích
místa SfiI
PCR produkt s extenzemi SfiI
PCR produkt po štěpení SfiI
Klonovací vektor
Klonování klastrů genů v požadovaném
pořadí – pokrač.
Vzájemné spojení
genů vybavených SfiI
místy a jejich
začlenění do vektoru
Příklad: příprava kmene B.
subtilis pro tvorbu hydrokortizonu
postupným spojením 8 genů
Analýza genů s neznámou funkcí v B. subtilis
pomocí vektoru pMUTIN
Vektor pMUTIN
• vektor není schopen se replikovat
v B. subtilis, což umožňuje provádět
inzerční mutagenezu
• reportérový gen lacZ usnadňuje sledovat
expresi cílového genu
• promotor Pspac umožňuje navodit expresi
genů nacházejících se v témže
operonu jako cílový gen
Část genu
s neznámou
funkcí klonovaná
ve vektoru
Operon (geny orf1-3)
v chromozomu B.s.
orf2 je inzerčně
inaktivován
Reportérový gen je
exprimován
(vytvoří se
transkripční fúze)
exprese genů
po směru transkripce
od orf2
IPTG
Pspac = PBS-pen + Olac
• producenti antibiotik (60%) a extracelulárních proteinů (enzymy a inhibitory enzymů)
• přenos transformací do protoplastů (PEG)
• vektory odvozeny z plazmidů (SCP2) – charakter kyvadlových vektorů
• selekční markery – antibiotika (thiostrepton, viomycin, neomycin nebo metylenomycin)
• fágové vektory podobné lambda fágu (např. ΦC31) – přenos transformací do lyzogenů nebo
má vektor sekvenci homologickou s chromozomem recipienta
Přenos kompletní biosyntetické dráhy pro tvorbu antibiotik
Klonování velkých úseků (40-100 kb) genomové DNA streptomycet ve
vektorech BAC, pak přenos vektorů elektroporací do buněk
streptomycet (nebo do protoplastů) a selekce klonů, v nichž se
klonovaný úsek začlenil do chromozomu
Klonování ve streptomycetách
Izolace genů pro
tvorbu antibiotik
Princip mutačního klonování u streptomycet
Promotor Kódující oblast Terminátor
Vektory obsahující různé
úseky genu X
Výsledek začlenění vektoru
homologní rekombinací (1 x CO)
I.
II.
III.
Postup mutačního klonování pro izolaci genů
1. Klonování chromozomového genu X (antR) do fágového vektoru (konstrukce genové knihovny)
2. Infekce buněk původního kmene exprimujícího gen X (AntR), selekce transduktantů na
rezistenci
k viomycinu (gen vph nesený na fágovém vektoru).Výsledkem začlenení vektoru homologní
rekombinací je duplikace homologní sekvence, která vede k jedné ze 3 možností:
• Vektor nese promotor (I) nebo terminátor (III), funkce genu zůstává zachována
• Vektor nese kódující oblast genu (II), inzercí vektoru dojde k jeho inzerční inaktivaci
(mutaci) → vyhledání klonů nesoucích mutací hledaného genu
Gen X na chromozomu
Klonování genů v archeích
• extremofilní organismy (T, pH, konc. solí)
• jedinečné fyziologické vlastnosti (např. striktně anaerobní a
metanogenní)
Přenos genů:
• elektroporace, nízká účinnost
• transformace zprostředkovaná PEG
• transformace zprostředkovaná lipozomy
Vektory: používány jako kyvadlové, některé se integrují do chromozomu
(inz. inaktivace)
• plazmidy
• viry
Selekční markery: rezistence k antibiotikům (puromycin, novobiocin,
thiostreptin, mevinolin)
Reportérové geny: β-glukoronidáza, β-galaktozidáza, trehaláza