Důvody pro klonování genů v eukaryotech A. Funkce charakteristické pro eukaryotické buňky, které se u baktérií nevyskytují: - lokalizace systému regenerujícího ATP v mitochondriích, - uspořádání DNA v chromatinu - způsob dělení buněk, mitoza a meioza - diferenciace buněk, buněčné komunikace, signální dráhy B. Rozdíly v expresi genů u eukaryot oproti bakteriím: - odlišnost regulačních sekvencí pro transkripci, translaci a export - specifické posttranslační modifikace Výhody kvasinek pro Gl jednoduchá eukaryota s mikrobiálním charakterem (malý genom se známou sekvencí, krátká generační doba a vysoký počet potomstva, kultivace na definovaných půdách, řada mutant získaných a charakterizovaných klasickou i moderní genetikou řada genů homologních vyšším eukaryotům, podobná buněčná biochemie a regulace genů možnost stanovit dominanci a recesivitu alel (na haploidním pozadí) vysoká frekvence homologní rekombinace - záměny genů tradiční dobře definovaný a bezpečný biotechnologický organismus, možnost přípravy farmak pro humánní medicínu, eukaryotické proteiny vytváří v aktivní podobě, lze dosáhnout sekrece do prostředí Životní cyklus kvasinek Zygotic diplophase Conjugation Q ata CQ Meiosis an sporulatioi an _ ^ Haploid aO oaspore5. Haplophases 0>O tetrádová analýza Dva typy haploidních buněk: a a g Heterotalické kmeny - stabilní Homotalické kmeny - nestabilní, haploidní buňky spontánně s v cr revertují na opačný buněčný typ Molekulární struktura kvasinkového 2\x plazmidu FLP (c) EcdRl Tcř 6,3 kb; 50-100 kopií REP - replikace FLP - rekombince STB - rozklad kointegrátu FRT site = FRT recombination target Flp recombinase = flippase Systém Flp/FRT ~ Cre/loxP Chimerické plazmidy vytvořené spojením plazmidů 2\x a pMB9 štěpených EcoRI, (dále pak vložení genu leu2 z kvasinkového chromozomu do místa Pstl na plazmidu) Kyvadlové vektory pro klonování genů v kvasinkách Přenos do kvasinek: transformace protoplastů elektroporace Základní typy kvasinkových vektorů integrující ~ pBR322 Replikující se velký počet kopií, stabilní AmpR Amp ura3 cirkulární 2^-DNA ura3 Epizomální, malý počet kopií, nestabilní nesoucí centromeru (jediná kopie; stabilní) AmpR Amp ARS ARS CEN3 ura3 ura3 Možnost eliminace bakteriálních sekvencí jejich ohraničením FLP Selektovatelné markery u kvasinek Gen Enzym Selekce HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine LEU2 P-Isopropylmalate dehydrogenase leucine LYS2 a-Aminoadipate reductase lysine TRP1 N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase tryptophan URA3 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase uracil Pozitivní selekce na mediu bez příslušného faktoru G418 - rezistence k geneticinu (KanR) Využití genu LEU2 jako selekčního markeru Začleňovaní epizomálních plazmidů do chromozomu kvasinek YEp13 Slouží současné jako selekční marker ĹEU2 leu --Chromozomální DNA kvasinek Rekombinace LEU2 leu- Plazmidová DNA Umělý kvasinkový chromozom (YAC) Table 13.1 Properties of different yeast vectors VEKTOR Vector Transformation frequency Copy no./ cell Loss in non-selective medium Disadvantages Advantages integrující se Yip epizomální (ori 2 n) replikující se (ars) YEp YRp centromérový YC: umělý chromozom transpoziční YAC Ty 10* 1 transformants per jig DNA IjM 0s transformants per jjg DNA 10J translormants per ug DNA 2S-200 1-20 10" transformants per >ig DNA 1-2 1-2 Depends en vector used to introduce Ty into cell -20 Much less than 1% per gene ration 1 % per generation Much greater man 1 % par generation but can gat chromosomal integration Lesslhan 1% per generation Depends on length: [ha longer the YAC the more stable it is Stable, since integrated into chromosome 1 Low transformation frequency 2 Can only be recovered from yeast by cutting chromosomal DNA with restriction endonuclease which does not cleave original vector containing cloned gene Novel recombinants generated in vivo by recombination with endogenous 2-urn plasm id Instability of transiormants Low copy number makes recovery from yeast more difficult than that of YEp or YRp vectors Difficult 10 map by standard techniques Needs to be introduced into cell in another vector 1 Of all vectors, this kind give most stable maintenance of cloned genes 2 An integrated Yip plasmid behaves as an ordinary genetic marker, e.g. a diploid heterozygous for an integrated plasmid segregates the plasmid in a Mendelian fashion 3 Most useful for surrogate genetics of yeast, eg- can be used to introduce deletions, inversions and transpositions (see BotstBln S Davis 1982) 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number 3 High transformation frequency 4 Very useful (or complementation studies 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number. Note that the copy number is usually less than that of YEp vectors but this may be useful il cloning gene whose product is deleterious to the cell if produced in excess 3 High transformation frequency 4 Very useful for complementation studies 5 Can integrate into the chromosome 1 Low copy number is useful if product of cloned gene is deleterious to ceil 2 High transformation frequency 3 Very useful lor complementation studies 4 Al meiosis generally shows Mendelian segregation 1 High-capacity cloning system permitting DNA molecules greater than 40 kb to be cloned 2 Can amplify large DNA molecules in a simple genelic background Get amplification following chromosomal integration Virům podobné částice odvozené z Ty elementů nesoucích kódující oblast HIV1 TAT Ty-element: 30-40 kopií v genomu S. cerevisiae, velikost 5,9 kb LTR - 334 bp, levá funguje jako promotor genů pro RT a integrázu Pseudovirion (virus like particle, VLP) obsahuje mRNA, dsDNA, RT a integrázu Promotor kvasinkových genů 2|i ORI Transkript vloženého genu URA 3 Fig. 13.6 Structure of the multicopy plasmid used for inserting a modified Ty element, carrying a cloned gene, into the yeast chromosome. pGAL and P are yeast promoters, 5 represents the long-terminal repeats (delta sequences) and grey region represents the cloned gene. Výhody dostupnosti různých typů kvasinkových vektorů Všechny kvasinkové vektory mohou být použity k vytváření částečných diploidů nebo částečných polyploidů, přičemž genové sekvence zavedené do buňky mohou být buď začleněny do chromozomu nebo přetrvávat v extrachromozomálním stavu. Do klonovaných genů mohou být zaváděny in vitro mutace a pozměněné geny lze pak vrátit do kvasinky a nahradit jimi alely standardního typu. Reportérové geny Gene Protein Size (amino acids) Original source Detection Reference cat Chroloamphenicol 219 E. cotiTn9 Acetylation of (Gorman, Moffat and acetyltransferase transposon chloroamphenicol using 14C acetyl-Co A Howard, 1982) lacZ /i-galactosidase 1024 E, coli Conversion of colourless ONPG to a yellow product; XGal blue-white screening (Norton and Coffin, 1985) gush. ^-glucuronidase 603 E. coli Conversion of MUG in a fluorometric assay; XGluc blue-white screening (Jefferson etal, 1986) lue Luciferase 550 Photinus pyralis (firefly) Oxidation of luciferin to produce light (de Wet et ai, 1987) GFP Green fluorescent protein 238 Aequoria victoria (jellyfish) Emits green fluorescence when exposed to blue or UV light (Chalfie etal., 1994) ONPG - o-nitrophenyl-^-D-galactopyranoside. XGal - 5-bromo-4-chíoro-í-indoly]-/i-D-ga]actopyranoside MUG - 4-methylumbelliferyl ß-D-glucuronide. XGluc - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide. Exprese genů v kvasinkách Pro účinnou expresi je žádoucí, aby klonované sekvence byly pod kontrolou kvasinkových promotorů - ty mají určitá specifika. Vektory proto mají promotory z kvasinek. Poločas mRNA (1-100 min) je silně ovlivněn netranslatovanými sekvencemi na 5'a 3'konci - jejich odstranění poločas zvýší Kvasinky mají jiné využívání kodonů než bakterie nebo vyšší eukaryota. Při chemické syntéze genů je třeba volit kodony, které jsou čteny (96% aminokyselin v kvasinkových proteinech je kódováno jen 25-ti z 61 možných kodonů) Exkrece proteinů: signální sekvence jsou dlouhé 20-90 aa. Přesná pravidla nejsou známa - u některých proteinů se exkrece nedaří. Sekrece zabrání rozkladu proteinu v cytoplazmě - proteolýze lze zabránit též změnou aa na N-konci (zábrana ubiquitace) Exprese genů v kvasinkách - pokrač. • Glykozylace - dochází ke glykozylaci cizích proteinů, ale struktura a sekvence oligosacharidů připojovaných na proteiny je odlišná než v přirozených hostitelích - to může mít důsledky pro stabilitu, imunogenitu a výslednou lokalizaci v tkáních (např. při terapeutickém používání) • Stabilita proteinů. Rychlá degradace proteinů po jejich syntéze nebo po rozbití buněk a purifikaci endoproteinázami, karboxypeptidázami a aminopeptidázami přítomnými ve vakuolách. Byla zkonstruována řada mutantních kmenů s pozměněnou aktivitou těchto enzymů. • Sestřih. Introny mají obecné rysy (5' GU - AG 3') a další konsenzuální sekvence. U kvasinek je před 3'místem sestřihu sekvence, která chybí u vyšších eukryot. Struktura kvasinkového promotoru 4 elementy: 1. TC(G/A)A a PuPuPyPuPu jsou u více než poloviny známých kvasinkových promotorů. Tyto sekvence nejsou u vyšších eukaryot, což ukazuje na rozdílný mechanismus jejich transkripčního aparátu. 2. TATA box, oblast 20-120 nukleotidů před místem iniciace. 3. Sekvence umístěné proti směru transkripce podílející se na regulaci genů: A. sekvence aktivující transkripci (UAS) - vazba pozitivního regulačního proteinu na UAS zvyšuje rychlost transkripce, zatímco delece UAS transkripci potlačí. Důležitým strukturním rysem UAS je přítomnost jedné nebo více oblastí s dvojitou symetrií. B. sekvence reprimující transkripci (URS). Vazba negativního regulačního proteinu na URS snižuje rychlost transkripce genů, které jsou regulovány negativně. 4. Sekvence umístěné uvnitř samotného genu, které se označují jako aktivující sekvence umístěné po směru transkripce (downstream activating sekvence, DAS). Nízká množství heterologních proteinů odráží nízké množství mRNA jako důsledek nízkého stupně iniciace transkripce. Např. vložení aktivující sekvence umístěné po směru transkripce genu PGK obnovuje rychlost transkripce mRNA. Struktura typického kvasinkového promotoru TC(GA)A PuPuPyPuPu 1 Initiator Nejsou u vyšších eukaryot i UAS URS TATA U regulovaných genů 20-400 bp 100-1400 bp 40-120 bp Coding sequence mRNA > DAS Ovlivňuje rychlost iniciace transkripce Vložení do sekvence cizího genu ADHI - alkoholdehydrogenáza PGK - fosfoglycerolkináza PHO5 - kyselá fosfatáza alfa-faktor (+ signální sekvence pro exkreci) Příklady konstitutivních kvasinkových promotorů používaných v expresních vektorech Gal systém S, cerevisiae využitý pro expresi genů PGAL1 Gall (galaktokináza) Gal4p + galaktóza (induktor) Transkripční aktivátor t P* r Gal1 Gen zájmu P*Gal1= syntetický promotor obsahující více vazebných míst pro Gal4p + galaktóza (induktor) Ga!4p PGal1 ^GAL4 Exprese genů indukovaná galaktózou A. Gal4p vytvářený z vlastního promotoru B. Gal4p vytvářený z promotoru Gal1 P GAL4 nízká hladina Gal4p, málo cílového produktu PGAL1 vysoká hladina Gal4p, hodně cílového produktu Table 7.1 Promoters for S. cerevisiae expression vectors Promotor Podmínky pro expresi Tvorba produktu Acid phosphatase (PH05) Phosphate-deficient medium Inducible Alcohol dehydrogenase I (ADHI) 2-5% Glucose Constitutive Alcohol dehydrogenase II (ADHU) 0.1-0.2% Glucose Inducible Cytochrome q (CYC1) Glucose Repressible Gal-l-P Glc-l-P uridy transferase Galactose Inducible Inducible Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD, GAPDH) 2-5% Glucose Constitutive Metallothionein (CUP1) 0.03-0.1 mM copper Inducible Phosphoglycerate kinase (PGK) 2-5% Glucose Constitutive Triose phosphate isomerase (TPÍ) 2-5% Glucose Constitutive UDP galactose epimerase (GAL10) Galactose Inducible Sekrece proteinů v kvasinkách Hlavní rysy sekretovaných proteinů: • jsou syntetizovány na endoplazmatickém retikulu • z ER jsou transportovány do Golgiho aparátu, kde jsou upraveny a zabaleny do sekrečních váčků • Fúze sekrečních váčků s plazmatickou membránou se děje konstitutivně nebo jako odpověď na externí signál • Nakonec jsou lokalizovány na buněčném povrchu nebo exportovány z buňky Proteiny přirozeně sekretované do růstového media a) párovací feromony (a-faktor, a-faktor) b) killertoxin (proteinový produkt dsRNA plazmidu n. VLP); molekuly působící toxicky na jiné kmeny kvasinek). • Polypeptidy určené k sekreci mají hydrofobní N-konec, který je odpovědný za translokaci do endoplazmatického retikula. • N-konec je obvykle tvořen 20 aminokyselinami a odštěpen ze zralého proteinu uvnitř endoplazmatického retikula. Bylo dosaženo sekrece řady ne-kvasinkových polypeptidů z rekombinantních plazmidů, ale pravidla pro sekreci nejsou zcela jasná. Problémy při expresi některých proteinů v S, cerevisiae • nízká exprese klonovaných genů, nízký výtěžek proteinu • hyperglykozylace heterologních proteinů • pozměněný transport sekretovaných proteinů (zadržení v periplazmatickém prostoru) • tvorba vysoké koncentrace alkoholu, který usmrcuje buňky a snižuje výtěžek proteinů Cílení proteinů do jádra Jádro kvasinky obsahuje sadu proteinů, které jsou syntetizovány v cytoplazmě. Pro objasnění mechanismu týkajícího se lokalizace proteinů v buňce byly zkonstruovány hybridní geny fúzí kvasinkového Matalfa genu, kódujícího předpokládaný jaderný protein, a genu lacZ z E. coli. Segment genového produktu MATalfa, který byl 13 aminokyselin dlouhý, byl schopen usměrnit P-galaktozidázovou aktivitu do jádra. To bylo potvrzeno imunofluoroscencí. Podobné sekvence byly zjištěny u jiných proteinů a označeny jako nuclear localization signals (NLS) Podle současného modelu pro import jaderných proteinů jsou proteiny obsahující NLS rozpoznány specifickými receptory (nuclear transport receptors) v cytoplazmě. Komplex NLS-receptor se pohybuje k jaderným pórům, které otvírá reakcí vyžadující ATP a dovoluje, aby protein vstoupil do jádra. Klonování kvasinkových genů v buňkách E. coli s využitím komplementace Získávání nových kvasinkových selekčních markerů Sou3A partia! l^A-v cleavage f,C \ <%—* > SC % genů kvasinek se exprimuje v E. coli 1 Most cell: don't grow Four-base /'"itklcy end" ■Amp1* \ Bacterial origin o í replication Genová knihovna kvasinky Transform Piafe onto medium lacking leucine Přenos do mutantních kmenů E. coli Cells contain plasmld with i£U2 gene LEU2 gene Functions in E coli Klonování kvasinkových genů na základě genetické komplementace Xts recipient: kvasinkový kmen nesoucí ts mutaci v genu X a mutaci v genu leu2 -roste jen při SQ°C to/- _JČ2> Q Leu- Plasmid library Yeost transformation Příprava genové knihovny z kvasinkového kmene s genem X(wt) ve vektoru obsahujícím jako selekční marker LEU2 Plate onto medium lacking leucine Incubate at 30°C (permissive temperature) Only cells that contain a plasmid grow Replica plate Incubate plate at 30°C Incubate plate at ■37°C (nonpermissive temperature) All cells grow Only cells that contain plasmid with wild-type gene X will grow at 37°C plasmid Determine DNA sequence of gene X izolace klonu X+ J Translate to obtain iDTotein sequence encoded Za le ování gen homologní rekombinací Left half °f YFG URA3 / / Right half of YFG One chromosome contains YFG integrated at URA3 locus One chromosome contains URA3 gene intergrated at YFG Linearizace plazmidu v místě homologie zvyšuje frekvenci začlenění asi 100x Kvasinkový integrující se vyprošťovací vektor plazmid se nemůže replikovat v kvasinkách Amp" ura3 H/ndlII SamHI integrace do chromozómu Štěpeni Hindlll; cirkularizace Amp™ ura3 Štěpeni SamHI: cirkularizace ura3 Amp" H/ndill BamHi plazmid obsahující standardní alelu H/ndlIl plazmid obsahujíc! mutovanou alelu alela standardního genu ohraničená vhodnými RE-místy začlenění do chromozomu izolace DNA, štěpení RE a cirkularizace analýza mutace Vyprošťovací replikující se vektor AmpR teu2 ARS MIMI Část genu mat je vyštěpena, hraniční sekvence jsou ponechány transformace E coli a vyhledání plazmidO nesoucích Inzert s MAT Homologní rekombinace a cirkularizace plazmidů, jejich izolace a p řenos do E. coli, studium mutantní alely MAT- Rekonstrukce plazmidu homologní rekombinací v kvasinkové buňce Jpvui + PvuIII I Recombination E co Vložení nového selekčního markem do plazmidu, překlonování genu zájmu do jiného typu vektoru Plazmid, který se v kvasince nereplikuje společně přeneseny do kvasinky transformací Plazmid, který se v kvasince replikuje Selekce klonů na HIS3, případně na URA3 Vytěsnění a záměna plazmidů Plasmid shuffle Studium funkce mutantních a cizích genů Trojnásobný mutant TPK1-, TPK2-, TPK3- ura+, his+, trp+, ade-, leu- Myší cAMP dependentní PK Yeasí cell 2lí ori\ Mouse protein ^ kinase gene Transform into yeast Plate to select for Ade+, Leu+ transformants Medium lacking adenine and leucine All cells on plofe contain both plasmids Culture a colony in complete medium (YPD) Cells can lose one of the ^Jpip two plasmids Plate cells onto YPD medium Cells need at least one protein kinase gene to grow Replica plate Cells in colony contain only the plasmid with mouse protein kinase gene Medium lacking Cells in colon; contain only the f~ plasmid with TPK1 f ...Medium. —- lacking Cell contains only the plasmid with TP^' Colony Fails to grow Umožňuje růst na mediu bez adeninu Zajišťuje životaschopnost buňky Selekce buněk obsahujících oba plazmidy - půda bez ade a leu Kultivace buněk za neselektivních podmínek Buňka si musí alespoň jeden z plazmidů podržet Zaver: Gen pro mysi proteinkinazu muze nahradit gen TPK1- Dvouhybridní systém ke studiu interakce proteinů Hybridní protein Gal4p-X se váže na promotor, ale není schopen aktivovat transkripci reportérového genu Hybridní protein Gal4p-Y se není schopen vázat na promotor a tudíž není schopen aktivovat transkripci Interakce hybridních proteinů Gal4p-X::Gal4p-Y aktivuje transkripci UAS Plazmidy určené k vytváření fúzních proteinů s aktivačními doménami Gal4p (DBD a AD) Selekce plazmidů Vyhledání genů jejichž produkty interagují SNF1 a SNF4 asociují za vzniku produktu s protein-kinázovou aktivitou GFP funkčně aktivní TF se vytvořil spojením proteinů SNF1 a SNF4 - tj. tyto proteiny vzájemně interagují Genetický důkaz funkce U2 snRNA (a] Wild-type strain (strain A] U2 snRNA Wild-type U2 gene Intron JACUA^CA Wild type intron Medium lacking histidine Wild-type U2 snRNA Plate Cells make their own histidine and grow his4 mRNA spliced UFC3 (b) Mutant strain [strain B) Wild-type U 2 gene Mutation M>J|onf hi&d gene |c) Mutant strain (strain B) Wild-type U2 gene ®> \ Mutant ' ,, , V hŕsigene PlaSmlci with mm UACllAHCA-^v Mutant intron IM I I I Wild-type U2 snRNA 1 / Mismatch destabilizes RNA hybrid Medium lacking Cells fail to grow histidine hiU mRNA not spliced Pokus prokazuje, že U2 RNA se při sestřihu páruje přímo s intronem. Introduce plosmid into cells by transformation mutant U2 gene LEU2 Selection for cells containing plosmid Medium lacking histidine \ Replica plate Mutant strain can now make histidine his4 mRNA spliced Náhrada chromozomového genu (gene knockout) pUCl18 YFG = your favourable gene Disrupted gene replaces wild-type gene in one chromosome Plate onto medium lacking uracil URA3 gene YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme, inaktivovaný genem URA3 / YFG Other chromosome normal Sporulate Dissect tetrads Characterize haploid cells Tetrádová analýza: sporulací dochází k separaci mutantní a standardní alely Diploid cells Speculate ^^L^) Four haploid spore ^Wgy f^íf£\ ce"s encased by \W9^J ascus wa|| One chromosome contains integrated URA3 gene at YFG Enzymatic digestion of ascus waif Individual spores are loosely stuck together in tetrads Pokud je funkce genu YFG nutná pro přežití, spory nebudou schopny růst na plotnách bez uracilu, neboť gen URA3 je součástí pouze přerušených (inaktivovaných) genů. Complete All colonies are Ura No growth ^ondusion^FC^s^in^ssenfial gene VACCINES Hepatitis B virus surface antigen Malaria circumsporozoite protein HIV-1 envelope protein DIAGNOSTICS Hepatitis C virus protein HIV-1 antigens HUMAN THERAPEUTIC AGENTS Epidermal growth factor Insulin In sul in-like growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growth factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor oil antitrypsin Blood coagulation factor Xllla Hirudin Human growth factor Human serum albumin Figure 7.4 Recombinant proteins produced by S. cereviae expression systems. HIV-1, human immunodeficiency virus type 1. Kvasinka Pichia pastoris • Má schopnost metabolizovat metanol jako jediný zdroj uhlíku a energie • Metabolismus metylotrofů umožňuje vytvářet „single-cell" proteiny - krmivo pro dobytek bohaté na proteiny Heterologní exprese proteinů v metylotrofní kvasince - Pichia pastoris Další druhy: Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha 1. Jednoduché techniky pro genetickou manipulaci u Pichia, podobné jako u S. cerevisiae. 2. Kultivace za definovaných podmínek včetně velkokapacitní kultivace 3. Schopnost P. tvořit proteiny ve velkém množství, buď intra- nebo extracelulárně (samy tvoří jen málo vlastních exkretovaných proteinů) 4. Schopnost provádět eukaryotické posttranslační modifikace (glykozylace, tvorba disulfidických můstků a proteolytický procesing). 5. Dostupnost tohoto systému pro komerční účely. Vektory pro expresi v Pichia a) jsou kyvadlové (+ E. coli) b) mají markery pro E. coli a pro kvasinky (ura, his, ade atd) c) mají expresní kazetu odvozenou z genu AOX • 5'-promotorové sekvence • terminátor transkripce • mezi promotorem a terminátorem je MCS d) u sekrečních vektorů jsou signály z kyselé fosfatázy (PHO) nebo alfa-MAT Hostitelské kmeny: • nesou auxotrofní mutace pro selekci vektorů • jsou proteáza deficientní Expresní vektory často inzertovány do chromozomu Vektory s vícenásobnou kopií cizorodého genu a) kopie genu uspořádány „hlava k patě" b) vektor obsahující gen kanR - amplifikace pomocí G418 Metabolizmus metanolu Metanol induktor Alkoholoxidáza AOX1 a AOX2 Formaldehyd + peroxid H dehydrogenázy Buněčné komponenty Formát + CO2 I energie Po indukci metanolem je 5 % transkriptů tvořeno genem pro alkoholoxidázu, která dosahuje až 30 % všech proteinů v buňce V přítomnosti jiných substrátů (glukóza, glycerol, etanol) je hladina AOX nízká Expresní vektor P. pastoris E. coli marker P. pastoris marker 37MOX1 alkoholoxidáza klonovaný gen Geny jsou klonovány za silný promotor methanolem indukované alkoholoxidázy (AOX1) vložený do expresních vektorů. Syntéza proteinu je spouštěna přidáním methanolu do média, které neobsahuje zdroj uhlíku a tvoří tak jediný zdroj uhlíku pro kvasinku. Konstrukce vektorů s kopiemi expresní kazety Začlenění genu klonovaného v integračním vektoru do specifického místa chromozomu P. pastoris 1 x CO Integrační vektor 5' AOX1 GO! TT mutace his4 HIS4 his4 C GOI = gene of interest Chromosome 5' AOX1 CO! TT HIS4 2 x CO RE 5' AOX1 GOI 1 I Reštrikční fragment vyčleněný z vektoru Chromosome 5' AOXÍ AOX1 3' AOX1 5' AOX1 GOI TT HIS4 3' AOX1 ■ Chromosome Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Bacteria Bacillus, licheniformis a-amylase Bacillus siearothermophilus D-aäanine carboxypeptidase Bordetella pertussis pertussis pertactin (P69) Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) serotype A aiid B Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain fragment, serotype B Clostridium botulinum neurotoxin serotype A binding domain Clostridium tetani tetanus toxin fragment C Escherichia coli acid phosphatase/phytase (appAi) Escherichia coli ß-galactosidase Escherichia coli ß-betamase Leishmania major cathepsin B-!ifce protease Staphylococcus aureus slaphylokinase Streptococcus equislmilis Streptokinase Streptomyces subtilisin inhibitor Streptomyces riridosporus T7A peroxidase, endoglucanase Toxoplasma gondii SAG1 antigen Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Acc) Fungt Aheritaria Alt 1 allergen Aspergillus awamori glucoamylase Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain Aspergillus fitmigatus catalase L Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase IV {DPP IV) Aspergillus fumigaius dipeptidy! peptidase V {DPP V) Aspergillus giganteus a-sarcin ribotoxin Aspergillus mger phytase (phyA) Candida guitliermondii xylose reductase gene (xyll) Candida rugosa lipase 1' {CR.L) Fusarium sotuni pectale lyase (peIC) Fusarium solum peetate lyase fpelD) Ceotrichum candidum lipase isoenzymes > ■ Phytophihora cryptogea |ä-crj'ptogein Rhizopus oryzae lipase Saccharomyces cewisiae invertase Saccharomyces cererisiae Ktrlp • Soccharomycts ctrevisiae (a-1.2-mannosyltransferase) Schizophyltum commune vitamin B2-aldehyde-forming enzyme Trametes versicolor (white rot fungus) laccase (leel) Trichoderma harzianum 0-(l-6)-g!ucanase Comments: mode, amount, signal sequence s. s, I, I. I, I, I, s, t, I s, s, I, s s, s, s, s, s, s, s, s, s, s, s, 1, s, s, s, s, s, s, s. s, s, s, s, s. 2.5 gl"', SUC2 100 mg I-1, nadve 3gr« 78 mg I"1 390 fig g'1 2.4 mg total 12 gl"1 28.9 U mg"1 2.0X10, U mg"1 a-MF 50mgl-',a-MF • 77. mg r\ . 2.47 g l_l total protein, 12 mg I-1', a-MF 7 mg r1, a-MF a-MF Reference [51,60} [61] [62] [63] [64J [65] [66] [67] m [20] [68] [69] (70] [71) P2] [73] [74] I = intracelulární, S = sekretovaný native PHOl a-MF . 400 mg I".1, 400 mg I-1, 2.3 g I"1, PHOl PHOl 0.15 mg I'1, PHOl 1 mg-1-1, synthetic native, PHOl 65 U rar1, a-MF 0.65 U mg-1; S, 0.13 U mg"', a-MF 150 U ml-1. a-MF 1 mg I-1, PHOl native 60 mg r1, 45 mg I-1 50 mg I" 2.5 g I"1 a-MF PHOl a-MF native 400 mg I"1; PHOl 40 mg I"1, PHOl 120 mg r', a-MF native and a-MF 9.3 mg r1 [75] [76] [47] ■; [77] (78] [79] (43] [801 [SI] [42] [82] [S3] [84] [85] [86] [30] [87] [87] [S8] [89! [90] Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Comments: mode, amount, Reference signal sequence Protists " Choiitlr.il crlspus red aiga h.exose oxidase I [91] Gracilariopsis lenuintiformis red alga oc-l,4-glucan lyase (GLql) I [92) Plasmodium falciparum merozoitc surface protein I (MSP-t) S, 24 mg !~ , a-MF [931 Plasmodium wax apical membrane antigen I (AMA-1) S, 50 mg I"1 , PHOl [94J Reticulomyxa filosa (giant freshwater ameba) a.2, p2 tubulin isoforms I, 400'(ig'g- [95] Trypanosoma cruzi acid a-mannosidase S, 11.5 |Jg r native [96] Plants Allium sativum (garlic) aitiiri lyase I, 2.167 U g -i [97] Arabidopsis shaliana NADH: nitrate reductase I, 13 Mgg~l [98,99] Barley {Hordeum vulgare) sucrose fructan 6-fructosyl transferase S, ct-MF [100] Barley cc-amylase 1 S, 50 mg I"1 , native [48] Barley a-nmyhse 2 S, 1 mg r\ native [48] Barky aleurone tissue a-glucosidase S, a-MF [101] Coffee bean a-galactosidase S, 400 mg 1" !, a-MF [102] Cynara etirdiinculus (cardoon) cyprosin S, 1 mg r1, native [103] Cynodon dacnion (Bermuda grass) Cyn d 1 S, 1.5 gl-', PHOl [104,105] Coianthiis nivalis agglutinin S, PHA-E [45] Heyia brasiliensis hydroxynitrile lyase i. 22 g r< [106] Hevea brasiliensis Hcv b 7 patatin-like allergen S, !0 mg , a-MF [107.108] Maize cytokinin oxidase S, native [109] Oat phytochroirw A, phA I, 30 jig g~' [110.111] Oat phytochrome A. pliyA65 .ipoprotcin [, 20 tig g_l [112] I = intracelulärni, S = sekretovany • Účinnost translace je patrně primárně kontrolována rychlostí iniciace translace, která je ovlivňována 5'-netranslatovanou vedoucí sekvencí. Sekvence mRNA může ovlivňovat její strukturu, což následně ovlivňuje rychlost translace a stabilitu (poločas rozkladu) mRNA. • Množství proteinu antigenu viru hepatitity B za přítomnosti sekvencí na 5'a 3'konci představovalo 0,05% celkových rozpustných proteinů. Po deleci virových sekvencí na 5' konci se zvýšil výtěžek proteinu na 26%, zatímco delece sekvencí na 5'a 3'koncích zvýšilo výtěžek na 41%. Hladina mRNA přitom byla v obou případech stejná.