BAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH techniku Metody používané v Laboratoři molekulární cytologie a cytometrie BFÚ, Brno Co to je? • BAC (Bacterial Artificial Chromosome) • PAC (P1 Artificial Chromosome) • YAC (Yeast Artificial Chromosome) • uměle syntetizovaná plazmidová DNA, kterou lze vložit do „organizmu" • vektor x klonovací vektor H VAC systémy • podílely se na mapování lidského genomu klonovací kapacita až 500 Kb, mohou nést celé lidské geny v kvasince se udržují relativně stabilně v 1 nebo více kopiích ale při manipulaci problémy (nestabilita, přeskupování DNA, tvorba chimér s cizorodou DNA, malé výtěžky), nižší účinnost transformace BAC systémy • struktura odvozena od F-plazmidů bakterie Eschericha coli klonovací kapacita 50-350 Kb v buňce v nízkém počtu kopií (1-2) vysoká strukturální stabilita v buňce E. coli, schopnost udržet vloženou DNA, snadná manipulace s DNA snadná izolace díky kruhové plazmidové struktuře (alkalická lyze, sloupcová chromatografie) tvorba chimér méně častá než u YAC BAC systémy z dobrá izolace díky selekčním znakům (př. gen pro rezistenci na antibiotika, přítomnost lacZ) vektory dále obsahují: místa pro restrikční enzymy, geny pro regulaci parA a parB, klonovací místa (Hind\\\, BamHI) \ Bacterial F' plasrrid is cu: wiihin ŕacľgene wiih restrictior enzymes Gene of interest is cutout uíing restriction enzyme I pasmid Jnd gene - y of interest ligate A BAC Rŕr ií ŕli*rtrrtpňntpH in1n F rn/irŕlk Cells are plated on X-gal/ PTG medium White colonics arc composed o* transformed \qc2 'cells PAC systémy • Nevhodný vektor odvozen od bakteriofága Á (nebyl vhodný pro mapování savčího genomu) • proto vyvinuty P1 vektory a PAC systémy (odvozeny od temperovaného fága P1) • P1 vektor se skládá ze 2 domén: adenovirový fragment (plní fágové kapsidy DNA) a P1 lytický replikon (spouští amplifikaci plazmidové DNA) PAC systémy - 2 • PAC systém má místo adenovirového fragmentu plazmid pUC povahy (zvyšuje výtěžek DNA) • je to kombinace P1 vektoru a bakteriálního vektoru • klonovací kapacita 130 - 150 Kb • menší stupeň chimérizmu (jako u BAC), vyšší účinnost transformace, ale složitější příprava vektorů Využití klonovQcích vektoru • fyzikální mapování, analýza a sekvenace nejen savčího genomu • příprava DNA sond • detekce různých poruch genetické informace (delece, inzerce, ...) • detekce nádorových buněk • studium struktury chromatinu v buňkách • tvorba genomických knihoven klinické využití Genomické knihovny • zásobárny klonů s různými vloženými úseky sekvenované genomické DNA konstrukce knihoven: různý postup v závislosti na typu vektoru hledání v knihovnách: pomocí sond a) pro vyhledávání sekvencí DNA b) pro vyhledávání produktů hledaných genů linearizace vektoru restrikčními enzymy a ligace s naštěpenou genomickou DNA produkt elektroporací vnesen do E. coli a transformanty selektovány na plotnách s antibiotikem nebo IPTG a X-gal vybrané transformanty jsou řazeny do mikrotitračních destiček • vektory pomnožovány v kmenech E. coli s poruchou rekombinace (DH5a, DH10B) Konstrukce BAC knihoven Klonování do BAC vektorů • asi nejpoužívanější je vektor pBeloBAC11 • postup: linearizace vektoru, ligace s fragmenty genomické DNA, elektroporace nebo chemická transformace do E. coli • selekce a uchování (LB médium s antibiotikem a 30% glycerolem na -70°C nebo vpich do média při RT) • izolace DNA z transformantů její analýza (PFGE, PCR) Vektor pBeloBACl 1 (kIastr gIobinových genů) 51 HS: 5 4 3 2 1 , -ia -10,9 5 HS: 1 -214 -14,7 -6,1 +21,8 1,1' gy at TP 5 P t X Sali NotI XJfB,'' NotI h- - —1-IZZI--H "\cosN loxP lacZ W .EcoRI / . parC N.\ / /par B CMr\\ Sna BI-J ' \ 1 pBeloBAC 11 H- xhoi l War a 7,3 kb 1 \ ^ / Xbal x^/ rep E^ jf Eco RV ^v^, ^^s^ EcoRV Hostitelská buňka Escherichia coli (G-, Enterobacteriaceae) vhodný modelový organismus protože: - je dobře znám jeho genom - nenáročně se kultivuje, rychle roste, produkuje početné potomstvo - obsahuje F-faktor (konjugativní plazmid o velikosti 100 Kb, který odpovídá za přenos genetické informace z F+ do F- buňky), v buňce je ve 2 formách (plazmid a Hfr) F i ľ /--■, V—"\ F+ F+ /-\ ŕ-' V_J \_> Příprava DNA sondy • nejprve izolace DNA z příslušného BAC nebo PAC vektoru pomnoženého v E. coli izolace klasickou metodou s vlastními roztoky nebo izolačním kitem izolace kitem je výhodnější (větší výtěžek, odstranění bakteriální DNA) Schéma izolace DNA pomocí QIAGEN Large Construct Kit - lyzační pufry rozruší buňky - isopropanol vysráží DNA - etanol přesráží DNA - kolonky odstraní bateriální DNA a RNA - následuje měření velikosti a čistoty DNA pomocí gelové elektroforézy a spektrofotometrie QIAGEN Large-Construct Kit Proceduře Pelleted bacteria i Alkaline lysáte Clear lysáte isopropanol precipitate Collect DNA by centrifuga ti on Exonuclease digestion Bind DNA Wash Elute Y 1 Isopropanol precipitate Collect DNA by centrifugation Genomic DNA-free ultra pure plasm id DNA Nick-translace • vlastní příprava sondy inkorporací např. digoxigeninu do DNA nick-translační kit obsahuje 2 enzymy: - DNáza I 5' 3' 3' 200-500 bp - E. coli polymeráza I • každý 20.-25. nukleotid je modifikován DIG-dUTP • vznik fragmentů o velikosti 200-500 bp Ntck translation Fig1 OWij^e nkhs the double stranded DNA E.Col 1 Pol t has 5-3' exonuclease activity has 5"-3' polymeri^in-g B-ctMty End lttbtfHng of fragments 5- 3' a b 200-500 bp PCR Fig 2 raq Dot Inc&rporetes nucleotides along the entire length of the DNA. I 00-5,000 bp This process is called nick translation because the DNA to be processed is treated with DNase to produce single-stranded "nicks." This is followed by replacement in nicked sites by DNA polymerase I, which elongates the 3' hydroxyl terminus, removing nucleotides by 5'-3' exonuclease activity, replacing them with dNTPs. Cot-1DNA v lidském genomu jsou rozptýlené repetitivní sekvence SINEs, LINEs (např. Alu-elementy, Ll-elementy) tyto repetice jsou obsaženy i v DNA sondě competitor DNA - lidská placentální DNA obohacená repetitivními sekvencemi repetitivní elementy sondy hybridizují s přebytkem repetic na COT-1 DNA nejvíce specifická místa na sondě zůstanou volná (jednořetězcová) pro hybridizaci na cílovou DNA potlačuje hybridizaci sondy na repetitivní sekvence při FISH a zvýší se tak specifičnost (přesnost) hybridizace Stručný návod k použití Cot-1 DNA ke 120 ng značené DNA přidat 6 |jg Cot-1 doplnit salmon sperm DNA do mn. 20 jg přidat 1/10 objemu 3M octanu sodného a 2 objemy 96% etanolu (-20°C) promíchat, inkubovat 30 min při -70°C centrifugovat 15min/13000 rpm, slít supernatant promýt DNA 400 jl 70% etanolu (-20°C) centrifugovat 5min/13000 rpm, slít supernatant sušit pelet a rozpustit ve 20 jl hybrizolu (50% formamid a 2xSSC) (Fluorescenční In Situ Hybridizace) metoda stanovení lokalizace specifických sekvencí DNA nebo i celých chromozomů v buněčných preparátech princip spočívá v navázání značené denaturované DNA sondy na komplementární místo cílové denaturované DNA druhy DNA sond: místně specifické (genové), celochromozomové, telomerické, centromerické typy DNA sond: - oligonukleotidové (chemicky syntetizované) -jednořetězcové (RT-PCR, PCR) - dvouřetězcové (BAC, PAC, YAC klony) - RNA sondy přímé a nepřímé fluorescenční značení duální barvení, SKY (spectral karyotyping), multicolour FISH, opakovaná hybridizace rozsáhlé klinické využití (prenatální diagnostika, cytogenetika nádorů) DOP-PCR semi-degenerate oligonucleotides (CGACTCGAGNNNNNNATGTGG) that bind at a low annealing temperature. N: A,T,G, C R: A,G, Y: C,T M: A, C K: G, T S: G, C W: A,T V: G, A, C D: G, A, T H: A, T, C B: G, T,C fragments that are in average 400-500 bp, with a maximum size of 3 kb, although Kittler and coworkers reported a DOP-PCR method that was able to produce fragments up to 10 kb. nepřímé značení - sekundární protilátka Nejčastěji používané látky nepřímé značení DNA sondy: ligandy typu digoxigenin, biotin sekundární protilátky: Rhodamin-anti-DIG, Fluorescein-avidin, FITC-avidin barvení jádra: DAPI (4',6-diamidin-2'-fenylindol), TO-PRO®-3 iodide, PI (propidium iodide) přímé značení DNA sondy: Spectrum Orange, Green, Red, ... Duální barvení umístění p-globinového genu (červené signály) v rámci chromozomálního teritoria chromozomu 11 (zelené signály) u lidských leukemických buněk K562 A Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) photoWcnch oVf^Vfo B Fluorescence Loss in Photobleaching (FLIP) pho lob teach O An 0*0 O JO 20 40 m 10 100 Time ICO O M 20 40 «0 Time 1CO Photoactivation s1 o » 0 20 40 60 Time IM Immunocytochemistry Visualization of Brain Cells by Immunocytochemistry Enzyme substrate Avidin-Biotin Enzyme Biotinylated 2' Complex Ab Á •OuaMilar*** PCft * Frťm a ľfl r M. i ľícmj r< cry • • • • • • • • * • * • • • • • ■ • P • • 9 m • • • • • • • • * a m -> * • • m • • AFI O ChIP on chip H3K9 acetylation i) the dsRNA is initially recognized by an enzyme of the RNase III family of nucleases, named Dicer, and processed into small double-stranded molecules, termed siRNA and (ii) the siRNAs are bound by the RNA-induced silencing complex (RISC-RNA induced silencing complex), which is a multi-protein complex (with RNase activity) that guides the targeted mRNA to degradation A specific RNAase III enzyme was then found to be responsible for cleaving the dsRNAs and was named Dicer (Bernstein et al. 2001). Following the cleavage of dsRNA into siRNAs by Dicer the second important stage of mRNA degradation occurs.