Logo1me Proteomika 2011 Základy proteomiky 2011 Proč právě proteomika? Jan Hejátko Logo1me Proteomika 2011 §Schéma přednášek ze Základů proteomiky 2011 Základy proteomiky 2011 §Proč právě proteomika? (Jan Hejátko) §Exprese a purifikace rekombinantních proteinů (Radka Dopitová) §Funkce proteinů (Lubomír Janda) §Určování třírozměrných proteinových struktur metodami proteinové krystalografie (Jaromír Marek) §Dvoudimenzionální elektroforéza (Hana Konečná/Jana Bursíková) §Hmotnostní spektrometrie proteinů (Zbyněk Zdráhal) Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika §analýza posttranslačních modifikací Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? Základy proteomiky 2011 §PROTEOME = PROTEins expressed by genOME (konference 2-D ELFO, Siena, 1994) §Proč vůbec studovat proteiny, když máme tolik genetických dat? (sekvence genomů, expresní profily genů, fenotypy mutantů,…?) Na konci je vždy BIOLOGICKÝ PROBLÉM !!!! §DNA: GENOME, HAPLOME, EPIGENOME §RNA: TRANSCRIPTOME §PROTEIN: ORFEOME, PROTEOME, LOCALISOME, INTERACTOME, METABOLOME, PHENOME, … V koncovém výsledku, tedy fenotypu, se vždy projeví regulace na všech úrovních, od genu po protein a jeho modifikaci •PHENOME: kombinace různých dat, zahrnujících fenotyp, expresní data různých (ideálně všech) genů daného organismu a proteinová data (interakce, jednotlivé vlastnosti proteinů, …) Logo1me Proteomika 2011 Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §dnes k dispozici v databázích více než 700 000 záznamů (nr databáze) různých organizmů §Získané informace lze zpracovat pomocí bioinformatiky Genome Project at NCBI Anotace genů a odhad aminokyselinových sekvencí předpokládaných proteinů Logo1me Proteomika 2011 Adobe Systems Adobe Systems Predikce funkce genů in silico struktura genů §struktura genů §promotor §počátek transkripce §5´UTR §počátek translace §místa sestřihu §stop kodon §3´UTR §polyadenylační signál TATA ATG….ATTCATCAT ATTATCTGATATA 5´UTR 3´UTR ….ATAAATAAATGCGA Logo1me Proteomika 2011 Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst Anotace genů a odhad aminokyselinových sekvencí předpokládaných proteinů §dnes k dispozici v databázích více než 700 000 záznamů (nr databáze) různých organizmů §Získané informace lze zpracovat pomocí bioinformatiky Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Logo1me Proteomika 2011 §Genom vs. Proteom § monarch_caterpillar monarch_imago Gen Transkript Protein Fenotyp Danaus plexippus (monarch) Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Logo1me Proteomika 2011 Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Možná analogie s textem a jeho interpretací Kdyžadoperbtabijsemdfjfwůcsaknclůsnínjxldalnxckjcnbychcxmasizdciksrdceasnanazxcnlsdlaň. DNA: RNA: Když----------------jsem---------s----------ní-----dal----------bych-------si------srdce-------na-- ------dlaň. Když----------------jsem---------snídal-----------------------------------------------srdce. Když----------------jsem---------s----------ní-----dal----------by----------si------srdce-------na- -------dlaň. PROTEIN: Když jsem s ní, dal bych si srdce na dlaň. Když jsem s ní, dala by si srdce na dlaň. Když jsem snídal srdce. Když jsem s ní, dal by si srdce na dlaň. Kdyžadoperbtabijsemdfjfwůcsaknclůsnínjxldalnxckjcnbychcxmasizdciksrdceasnanazxcnlsdlaň. Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace §regulace transkripce Od genu k proteinu a zpět SRBs (suppressor of RNA polymerase B) are proteins interacting with DNA polymerase II. These proteins were isolated in a screen for mutations rescuing the deletion mutants lacking the carboxy-terminal repeat in yeast. Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace §regulace transkripce §sestřih RNA Od genu k proteinu a zpět SRBs (suppressor of RNA polymerase B) are proteins interacting with DNA polymerase II. These proteins were isolated in a screen for mutations rescuing the deletion mutants lacking the carboxy-terminal repeat in yeast. Logo1me Proteomika 2011 §odchylky rozpoznávání míst sestřihu u rostlin v praxi - příklad vývojové plasticity (nejen) rostlin •identifikace mutanta s bodovou mutací (tranzice G→A) přesně v místě sestřihu na 5‘ konci 4. exonu •analýza pomocí RT PCR prokázala přítomnost fragmentu kratšího než by odpovídalo cDNA po normálním sestřihu •sekvenace tohoto fragmentu pak ukázala na alternativní sesřih s využitím nejbližšího možného místa sestřihu v exonu 4 RTPCR_EN •existence podobných obranných mechanizmů prokázána i u jiných organizmů (např. nestabilita mutantní mRNA se vznikem předčasného stopkodonu (> 50-55 bp před normálním stop kodonem) u eukaryot, viz doporučená studijní literatura, Singh and Lykke-Andersen, 2003) Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace regulace transkripce Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace přeskupování subgenů při produkci protilátek Přeskupování subgenů jako specifický mechanismus při produkci protilátek §protilátky variabilní oblast (V) a konstantní oblast (C) a lehký (L) a těžký (H) řetězec §každá z V oblastí L řetězce u myší je kódována 2 subgeny (V a J) §každá z V oblastí H řetězce u myší je kódována 3 subgeny (V, J a D) §v zárodečných liniích myších B-lymfocytů dochází k tzv. kombinatorické diversifikaci (přeskupování) subgenů (místně-specifickou rekombinací) §L řetězec (κ): cca 300 V sub-genů a 4 J subgeny (300 x 4 = 1200 možností) §H řetězec: cca 500 V sub-genů, 4 J subgeny a 12 D subgenů (500 x 4 x 12 = 24000 možností) Ab7 §celkové množství kombinací u myší: cca 1200 x 24000 = 28 mil. různých V oblastí (protilátek rozpoznávající různé antigeny) MBC_01 §antigen indukuje tzv. afinitní dozrávání mechanismem somatické hypermutace §po aktivaci B-lymf. pomocnými T-lymf. dochází ke zvýšenému výskytu mutací ve V oblastech (1 mutace/V oblast/generaci, cca 1 mil. X vyšší než je obvyklé (např. u tzv. „house-keeping“ genů) a selekci protilátek se zvýšenou afinitou k antigenu V oblasti jsou kódovány jednotlivými subgeny, kdežto C oblasti jsou kódovány pouze C geny. Obrázek ukazuje mechanismus přeskupování subgenů pro lehký řetězec. Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace §regulace transkripce §sestřih RNA Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me Proteomika 2011 • Funkční význam sestřihu v nepřekládaných oblastech - důležitá regulační součást genů §Translační represe prostřednictvím krátkých ORF v 5‘UTR §Identifikováno např. u kukuřice (Wang and Wessler, 1998, viz doporučená lit.) §V případě CKI1 pokus prokázat tento způsob regulace genové exprese pomocí transgenních linií nesoucích uidA pod kontrolou dvou verzí promotoru, zatím nepotvrzeno fig_1 ATGaaaagagcttttTAG M K R A F . ATGaaaagagcttttTAG M K R A F . ATGatggtgaaagttaca…. M M V K V T … ATGatggtgaaagttaca…. Regulace genové exprese mechanismem translační represe ATGatggtgaaagttaca…. M M V K V T … Logo1me Proteomika 2011 Expression of CKI1 in Diploid Generative Tissue Inflorescence PR4_GUS_IL_124 fl16 fl2 Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace §regulace transkripce §Sestřih RNA §posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me Proteomika 2011 Mello, 2004 Od genu k proteinu a zpět umlčování genů mechanismem RNA interference (RNAi) Logo1me Proteomika 2011 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello USA USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b. 1959 b. 1960 Andrew Z. Fire Craig C. Mello Logo1me Proteomika 2011 Regulace vývoje květů u Arabidopsis prostřednictvím miRNA §ABC model vývoje květních orgánů u rostlin §během vývoje květních orgánů dochází k určování identity jednotlivých květních orgánů kombinací exprese tzv. homeiotických genů §homeiotické geny kódují většinou rostlinné homolgy MADS-box transkripčních faktorů §mezi jednotlivými homeiotickými geny dochází k tzv. katastrálním interakcím, kdy exprese jednoho genu inhibuje expresi dalšího §např. AP1 je nejprve aktivní v celém květním meristému, po indukci exprese AG pak AG inhibuje expresi AP1 ve vnitřních dvou kruzích) § Od genu k proteinu a zpět posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA §výjimkou je exprese genu AP2, jehož mRNA je přítomná v celém květním meristému, ale exprese AP2 je regulována na úrovni translace prostředictvím miRNA (gen miRNA 172) wt ap2 35S::miRNA 172 in situ lokalizace miRNA172 v 3. a 4. kruhu Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace §regulace transkripce §Sestřih RNA §posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA §směřování proteinů Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me Proteomika 2011 §Intracelulární lokalizace proteinů §v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) §endomembránový transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů secretion_pthways Od genu k proteinu a zpět směřování (cílování) proteinů CV, central vacuole; DV, dense vesicle; ER, endoplasmic reticulum; GA, Golgi apparatus; LV, lytic vacuole; N, nucleus; PAC, precursor-accumulating compartment; PB, protein body; PCR, partially coated reticulum; PSV, protein-storage vacuole; PVC, pre-vacuolar compartment; SV, secretory vesicle. Surpin and Raikhel, 2004. §Pro funkci proteinů v buňkách je zásadní jejich správná lokalizace prostřednictvím tzv. signálních sekvencí Logo1me Proteomika 2011 Od genu k proteinu a zpět směřování (cílování) proteinů §Cyklování auxinových přenašečů u Arabidopsis §auxin je rostlinný hormon se silným morfogenním účinkem §proteiny podílející se na transportu proteinů jsou tzv. PIN proteiny, polárně lokalizované v bunňkách kořene u Arabidopsis §v přítomnosti inhibitorů endocytózy (BFA) dochází k akumulaci těchto proteinů v intracelulárních kompartmentech…. §….čímž je zároveň negativně ovlivněn gravitropizmus u rostlin §PIN proteiny cyklují v endomembránovém systému rostlinné buńky Logo1me Proteomika 2011 Mechanismy uplatňující se při vyjadřování genetické informace §regulace transkripce §sestřih RNA §posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA §směřování proteinů §posttranslační modifikace proteinů Od genu k proteinu a zpět §translační represe Logo1me Proteomika 2011 Význam posttranslačních modifikací proteinů §regulace enzymové aktivity §regulace interakcí proteinu s dalšími proteiny nebo jinými biomolekulami §přenos signálu Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů §lokalizace proteinu v buňce §změna mechanických vlastností proteinu Logo1me Proteomika 2011 Typy posttranslačních modifikací proteinů §přidání glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy §fosforylace §N-myristolyace Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů §sulfonace §glykosylace §N-metylace §hydroxylace §karboxylace §prenylace §…. Logo1me Proteomika 2011 Přenos signálu a regulace genové exprese prostřednictvím fosforylace §přenos cytokininového signálu u rostlin § Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů FGP_logo_color Signal Transduction via TCS NUCLEUS Adobe Systems PM AHK sensor histidine kinases • AHK2 • AHK3 • CRE1/AHK4/WOL REGULATION OF TRANSCRIPTION INTERACTION WITH EFFECTOR PROTEINS HPt Proteins • AHP1-6 Response Regulators • ARR1-24 Recent Model of the CK Signaling via TCS Pathway D’Agostino et al., Plant Physiol, 2000 CK primary response genes - Type-A ARRs expression Logo1me Proteomika 2011 Přenos signálu a regulace genové exprese prostřednictvím fosforylace §přenos signálu prostřednictvím TGFβ (Transforming Growth Factor) u živočichů § Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky Logo1me Proteomika 2011 Technologie rekombinatních proteinů § §umožňuje získat velké množství analyzovaného proteinu ve velké čistotě § Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů §využívá technologie rekombinantní DNA §principem je vložení „přívěsku“ prostřednictvím přípravy rekombinantní DNA, který usnadní purifikaci (afinitní purifikace) §možnost využití „přívěsku“ i pro lokalizaci a další analýzu proteinu v in vivo systémech Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů Logo1me Proteomika 2011 Analýza vztahu mezi funkcí a strukturou proteinu § §využívá technologie produkce rekombinantních proteinů a místně řízené mutageneze § Přístupy současné proteomiky analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §umožňuje analyzovat strukturu rekombinantního proteinu pomocí rentgenové krystalografie nebo NMR §kopmparativní analýzou lze pak analyzovat strukturu a funkci jak u strandardního typu tak i mutantního proteinu ahp5-det productive_nonproductive_popisky Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika Logo1me Proteomika 2011 Analýza změn proteomu organismu na různé stimuly § §využívá technologií vícerozměrné separace proteinů (nejčastěji ELFO nebo LC) § Přístupy současné proteomiky komparativní proteomika §umožňuje analyzovat mnoho proteinů najednou §pomocí analýzy obrazu lze odhadnout proteiny se změnou vlastností, příp. kvantity za daných sledovaných podmínek (mutace, vývojové stadium, fyziologická odpověď) Zvýšená hladina endogenních CK Logo1me Proteomika 2011 pOp-ipt13(2)/LhGR pOp-ipt11(5)/LhGR Wt.col. O DEX Přístupy současné proteomiky komparativní proteomika MS HPCd Logo1me Proteomika 2011 Přístupy současné proteomiky komparativní proteomika Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2011 §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika §analýza posttranslačních modifikací Logo1me Proteomika 2011 Analýza posttranslačních modifikací § §pomocí specifických metod lze identifikovat kotranslační a posttransalční modifikace, buď v gelu nebo po blotování na membránu (barvení spec. barvičkami) § Přístupy současné proteomiky analýza posttrranslačních modifikací §fosforylace Pro-Q Diamond SYPRO Ruby §přenos signálu §regulace chromatinových strruktur a transkripční aktivity prostřednictvím regulace vazby histonů §velice heterogenní (aktivátor plasminogenu 3 místa pro glykosylaci na N-konci, až 11. 520 možných izoforem) §acetylace §glykosylace •mikroheterogenita díky velkému množství různých cukerných zbytků, které se mohou vázat na jednu ak. •makroheterogenita díky rozdílům v přítomnosti různých cukrů na různých ak. na různém počtu kopií daného proteinu §identifikace modifikací pomocí MS technik (MALDI TOF, ESI-MS, …) Logo1me Proteomika 2011 Proč právě proteomika? §exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Základy proteomiky 2011 shrnutí §Postgenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst §Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování §Od genu k proteinu a zpět §Přístupy současné proteomiky §analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů §diferenční proteomika §analýza posttranslačních modifikací Logo1me Proteomika 2011 §Zdrojová literatura k první přednášce: §Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey §Wang, L. and Wessler, S.R. (1998) Inefficient reinitiation is responsible for upstream open reading frame-mediated translational repression of the maize R gene. Plant Cell, 10, (1733) Základy proteomiky 2011 zdrojová literatura §Friml, J. and Palme, K. (2002) Polar auxin transport. Old questions and new concepts?. Plant Mol. Biol., 49, 273-284 §Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature, 431, 338-342 §Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 Monografie a učebnice Publikace v mezinárodních časopisech §Proteome Research: New Frontiers in Functioonal Genomics, ed. Wilkins, M.R., Wiliams, K.L., Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., 1997, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg §Dubová J. , Hejátko J., Friml J. (2005) Reproduction of Plants, in Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine (ed, R. A. Meyers), pp. 249 – 295. Wiley-VCH, Weinheim, Germany