Jaroslava Dubová Mikropropagace Množení in vitro 5. Definice mikropropagace  Micropropagation is the true-to-type propagation of a selected genotype using in vitro culture techniques.  Most often micropropagation is also associated with mass production at a competitive price. [P.C. Debergh and R.H. Zimmerman /Eds./:Technology and Application]  High yield plant production, grown in a nutrient rich gel under sterile lab conditions. [R. Fenwick 2004] Výhody množení in vitro  malý rozměr řízku  vysoký množitelský koeficient  zkrácení množitelského cyklu  možnost použití netradičních orgánů  možnost načasování na určitý termín  dobrý zdravotní stav (ozdravování) Typy regeneračních procesů (Němec 1905) restituce = náhrada odňaté části - meristémy (meriklonové množení) reprodukce = regenerace z již existujících základů regenerace de novo = odvozování přes kalus, v něm diferenciace adventivních pupenů viz schéma: Opatrný (1988) Opatrný 1988 in vitro restituce = náhrada odňaté části - meristémy (meriklonové množení) reprodukce = regenerace z již existujících základů nodální segmenty regenerace de novo = odvozování přes kalus internodální segmenty, diferencované orgány část meristému vzrostného vrcholu část meristému vzrostného vrcholu vzrostný vrchol orchideje pupen kalusové pletivo protokormy Apikální stonkový meristém listová primordia vlastní meristémizolovaný „meristém“ Apex stonku Begonia rex izolovaný „meristém“ listová primordia apikální meristém Mikropropagace, klonování rostlin in vitro http://www.kitchenculturekit.com/africanviolet.htm http://www.jmu.edu/biology/biofac/facfro/cloning/cloning.htm http://aggie-horticulture.tamu.edu/tisscult/microprop/microprop.html http://www.janholub.cz/my.html okrasné dřeviny - rododendrony masožravé rostliny http://www.micropropagation-services.co.uk/ kapradiny http://bestcarnivorousplants.com/dionaea/ www.phytotechlab.com/pdf/FernMicropropagation.pdf http://www.darwiniana.cz - vydává pro členy časopis Trifid Stadia mikropropagace in vitro Murashige (1974) I. iniciace II. propagace (množení) III. zakořeňování Převádění do nesterilních podmínek ex vitro Debergh et Maene (1981) 0. příprava explantátu - ovlivnění mateřské rostliny II.a elongace (prodlužování) prýtů aklimatizace na nesterilní podmínky (nižší vzdušnou vlhkost, větší kolísání teplot, normální osvětlení) I. II. III. Stadia mikropropagace Saintpaulia ionantha Wendl. Mikropropagace sukulenty z výsevu aklimatizované masožravé rostliny Dionaea muscipula DroseraDrosera capillariscapillaris fáze mikropropagace dřevin www.boku.ac.at/iam/poster/revital.htm. rejuvenace Meristémové kultury a termoterapie Kombinace in vitro termoterapie a meristémové kultury - nejúčinější metoda eliminace virů. Aktivně rostoucí rostlinný materiál je umístěný do termoterapeutické komory. Expozice 3 týdny nebo déle, fotoperioda 16 h 38°C, 8 h tma 36°C. Teplota a doba expozice jsou limitovány tolerancí rostliny (závisí na druhu a varietě). 0 50 100 150 200 250 300 350 1982 1988 1990 1996 Numbers of laboratories Commercial Official The European Plant Tissue Culture Industry COST meeting 1992, COST 822 The European Plant Tissue Culture Industry COST 87, COST 822 Country Official Commercial Year 1992 1996 1992 1996 Austria 6 5 0 1 Belgium 22 22 11 14 Denmark 6 8 6 8 Czech Rep. 18 18 2 3 Finland 21 13 6 8 France 33 18 0 12 Germany 28 40 25 31 Netherlands 19 9 35 36 Poland 24 7 Slovakia 9 7 3 4 Sweden 3 3 4 3 U.K. 36 31 7 18 Rostlinné taxony v komerčních laboratořích COST meeting 1992, Dijon Rod Počet laboratoří Prunus 107 Ficus 82 Philodendron 56 Spathiphyllum 46 Nephrolepis 44 Rosa 41 Syngonium 37 Malus 35 Orchidaceae 31 Solanum 30 Gerbera, Begonia, Fragaria 26 Celkový počet rostlin produkovaných v komerčních laboratořích v Evropě (x1000) COST meeting 1992, Dijon Gerbera 18 383 Nephrolepis 14 517 Prunus 10 725 Spathiphyllum 9 827 Lilium 7 112 Fragaria 7 040 Ficus 7 002 Saintpaulia 5 696 Solanum tuber. 2 817 Orchidaceae 2 162 Citrus 2 061 Actinidia 1 112 Betula 842 Nicotiana 704 Platycerium 700 Diffenbachia 82 Rostlinné taxony ve výzkum. laboratořích COST meeting 1992, Dijon Rod Počet laboratoří Prunus 78 Solanum 66 Malus 62 Vitis 42 Brassica 40 Nicotiana 39 Betula 37 Rosa 35 Quercus 32 Fragaria 25 Orchidaceae 13 Hlavní zájmy evropských laboratoří in vitro COST meeting 1992, Dijon 0 10 20 30 40 50 60 70 80 komerce výzkum množení ozdravování uchování gen. manipul. šlechtění s. metabolity Produkce rostlin in vitro podle zemí (miliony ks.) COST meeting 1992, Dijon 0 10 20 30 40 50 60 70 evropské státy Belgie Německo Španělsko Francie Itálie Holandsko I. stadium: Iniciace mikropropagace 1. výběr materiálu: zdravotní stav matečných rostlin ontogenetické stáří (rejuvenilizace) vliv genotypu 2. desinfekce 3. výběr typu explantátu 4. přítomnost cytokininu a auxinu v médiu II. Stadium mikropropagace: propagace médium se sníženou koncentrací regulátorů nebo bez nich, možný přídavek giberelinů Opakované rozdělování vzniklých prýtů není neomezené: většinou 10 – 15 pasáží pak je nutné nové založení kultury možné problémy: habituace vitrifikace mikropropagace melounu Cucumis melo L. II. stadium mikropropagace adventivní prýty Debergh et al. III. Stadium mikropropagace: zakořeňování • snížení koncentrace minerálních solí • možná indukce auxinem (pulsní - vysokou koncentrací nebo dlouhodobější působení nízkou koncentrací) pro tvorbu funkčních kořenů = vhodnější tekuté médium • absence mykorhizy inokulace kulturami hub mikropropagace Lilium mikropropagace Malus Mikropropagace - stadium III. zakořeňování katalog firmy Aklimatizace nedostatečně vyvinutá kutikula (vosky) nefunkční stomata odumírají kořeny vyvinuté in vitro Snižování relativní vlhkosti in vitro – „bottom cooling“ Zvyšování vlhkosti – tunely nebo mlžení Zabránění infekci po převodu: pečlivé odstranění zbytků agaru desinfekce substrátu - Previcur-N (0,15-0,25%) problémy: Aklimatizace Saintpaulia ionantha Wendl. 1 3 12 9 2 skleněné akvárium regenerované rostliny Aklimatizace vyvíječ mlhy sadbovače s nezakořeněnými mikrořízky přeneseny do mlžné komory ve skleníku http://instruct1.cit.cornell.edu /courses/hort400/raspberry/ stageIV.html Nevýhody množení in vitro  možnost nežádoucího zvětšení variability (tzv. somaklonální variabilita)  nebezpečí genetické degradace  protokoly nejsou optimalizované pro všechny druhy  problémy s vitrifikací a habituací  pracnost a energetická náročnost - cena Habituace = forma zkušenosti, která vede k vymizení reakce živočicha nebo rostliny na neškodný, dlouho opakovaný podnět nebo skupinu podnětů = snížení odpovědi Vitrifikace („hyperhydricity“) Symptomy vitrifikace nemusí být vždy viditelné pouhým okem. Viditelné příznaky se mohou objevit u citlivějších taxonů nebo v případě nepříznivějších podmínek. Příklady nepříznivých podmínek: • příliš vysoká koncentrace cytokininu • vysoká kapacita retence vody • příliš těsně uzavřené kultivační nádoby • příliš nízká koncentrace gelujících látek (agar) Příklad jasných vizuálních symptomů vitrifikace u Oreopanax nymphaefolia Debergh et al. Znaky vitrifikace morfologické anatomické biochemické 1. kratší internodia 2. tvorba růžic 3. průhledné, křehké a zkroucené listy 4. abnormální barva 5. slepené jehlice u konifer 1. velké interceluláry 2. hypolignifikace 3. redukovaný vývoj cévního systému 4. defektní epidermis 5. změněné ukládání vosků 6. snížená funkce průduchů žádné obecné závěry Debergh et al. Srovnání atmosféry ve skleníku a kultivační nádobě větší než 2 ppm5 ppb - 100 ppbethylen ± 100 %60-85 %vodní pára až 20 %365 - 1000 ppmCO2 až 87 %77 %N2 až 4 %22 %O2 kultivační nádoba skleníksložka Vliv různých druhů agaru na růst apikálních prýtů Picea abies (koncentrace agaru 1%) (Romberger and Tabor, 1971) Komerční laboratoře v USA více než 10 mil. rostlin 2 až 10 mil. rostlin Komerční laboratoře ve vybraných zemích Asie (1988) 65 - 86105Celkem 3518Thajsko 2 - 41Srí Lanka 3 - 44Singapur 0,5 – 1,02Filipíny 0,1 – 0,51Nepál 6 - 88Malajsie 310Korea 1030Japonsko 3 - 68Indonésie 4 – 54Indie 0,1 – 0,21Bhútán Produkce (v mil.)Počet laboratoříZemě Produkce sazenic in vitro (x 1000) Firma Miyoshi (Japonsko) 0 200 400 600 800 1 000 1 200 1 400 1 600 1 800 2 000 1970 1978 1979 1980 Laminární boxy komerční laboratoře katalog firmy Kultivace - komerční laboratoře katalog firmy Hlavní skupiny rostlin produkované in vitro v Asii (1987 - 88) 10074celkem střední nárůst00lesnictví mírný nárůst54plodiny plantáží mírný nárůst11koření výrazný nárůst85ovoce mírný nárůst1713květy mírného pásma mírný nárůst00tropické květy stagnace6044orchideje mírný nárůst97ozdobné listem Prognóza%Počet v mil. Druh Produkce rostlin in vitro (mil.) kategorie • Hrnkové rostliny (92,3) 1. Nizozemí (26,7) 2. Francie (22,6) 3. Belgie (16,6) • Řezané květy (37.8) 1. Nizozemí (18.2) 2. Francie (10,1) 3. Itálie (4,9) • Ovocné stromy (19,4) 1. Itálie (14.6) 2. Španělsko (1,9) 3. Francie (1,7) • Okrasné cibuloviny (13,2) 1. Nizozemí (13,0) 2. Itálie (0,2) 3. Finsko (0,01) Alocasia sanderiana var. nobilis pochází z Filipín, kde je údajně vyhubená nebo velmi vzácná Calathea Malus Crinum lugardiae