Stanovení karyotypu z periferní krve
PRINCIP:
Jde o vyšetření karyotypu lymfocytů z periferní krve. Působením phytohemaglutininu (PHA) se T-lymfocyty přeměňují zpět na mladší formy-lymfoblasty, které jsou schopny dělení. Kultivace trvá 72 hodin pří 37 °C.
BIOLOGICKÝ MATERIÁL:
3 ml periferní krve a 0,3 ml heparřnu..
CHEMIKÁLIE:
Medium (RPMI 1640, bovinní semni, NaHC03, glutamnin, penicilin, PHA, redestilovaná voda), kolchicin, KC1, kyselina octová, metanol, barva Giemsa-Romanovski, Sorensenův pirfr, trypsin, heparin.
PRACOVNÍ POSTUP:
»   0,6 ml krve a 7 ml media
* kultivace 72 hod. při 37 °C v C02 termostatu
©   blokáda mitotického dělení kolehicinem 40 min *
* centrifugace 10 min.
'« • hypotonie 0,075 M.KC1 - 25 min.
» centrifugace 10 minut
*■ fixace 3x kyselinou octovou a metanolem (3:1)
* příprava preparátů - 1 kapka suspenze na mokré podložní sklo » pruhování preparátů
HODNOCENÍ:
«  20 mitóz diferencovat
Stanovení karyoíypu z kostní dřeně (onkocytogentika)
PRINCIP:
Jde o vyšetření karyotypu blastů v kostní dřeni, kultivace trvá 24 hod., nebo se provádí přímé zpracování tj. bez kultivace.
BIOLOGICKÝ MATERIÁL:
1 ml kostní dřeně v 5 ml PBS pufŕu (transportní médium) a 0,5 ml keparinu. CHEMIKÁLIE:
Medium PANSERIN - 411, kolchicin, K.C1, kyselina octová, metanol, barva Giemsa-Romanovski, Sorensenuv pufr, trypsin, heparin, PBS pufr.
PRACOVNÍ POSTUP:
»   1 ml kostní dřeně a 12,5 ml PANSERINU, kultivace 24 hod. při 37 °C v C02 termostatu nebo bez kultivace...
* blokáda mitotického delení kolchicinem (1 ml, 90 min.) e centrifuga.ee 10 min.
* hypotonie 0, 075 M KC1 - 25 min.
* přidat 10 kapek fixačního roztoku a 5 min. nechat stát «= centrifugace 10 minut
* fixace 3x kyselinou octovou a metanolem (3 : 1)
* příprava preparátů - 6 kapek suspenze na namražená podložní skla
* pruhování preparátů HODNOCENÍ: '
. * 20 mitóz diferencovat
Základní piruhovací techniky ■ G-pruhování"
a) 'Barví se nakapaná skla stará nejméně 24 hodin
b) Zapečení skel: 20 minut'při 80° C
■ c) Připravit 3 roztoky do histologických kyvet:     .  • •, •
1. kyveta: roztok trypsinu - 0,5.mg trypsinu naředit 5 ml Sorerisenovapufru. Z tohoto roztoku'připravit 0,5 % - 1 % - 8 % dle kvality preparátu
2. kyveta: roztok Sorensenovapufru
3. kyveta: roztok Giemsova barviva-. 2 ml Giemsy dô 70 .tu] Sorensenova pufro
4. kyveta.destilovaná voda
Vlastní barvení: •
'Použít několik Zkušebních skel pro různé pasy • • .
a) Preparát ponořit do roztoku trypsinu (1. kyveta) asi na.5 - 15 vteřin
b) Rychle opláchnout v Sorensenově pufru (2. kyveta)
c) Okapat a barvit Giemsou (3. kyveta) asi 1 - 2,5 minuty
d) Opláchnout destilovanou vodou
ve). -Prohlédnout v mikroskopu a upravit časy barvení a denaturace.'