• může být normální funkce obnovena zavedením normálního genu do buňky nesoucí mutantní formu genu (aniž by došlo k začlenění homologickou rekombinací)? • bude ke korekci docházet v případě, že se produkt tvoří v jiných tkáních? • bude množství funkčního proteinu dostačující? • jaké budou vedlejší efekty? Korekce genetických defektů v transgenních zvířatech Korekce choroby „shiverer“ – deficience MBP CH/CH; transgen/transgen Jedna kopie transgenu 8% MBP 26% MBP Důkaz, že normální funkce genu může být obnovena zavedením normálního genu do buňky nesoucí jeho mutantní formu Gen MBP je začleněn na jiném místě genomu než endogen MBP = (myelin basic protein) cDNA pocházející z normálního zvířete R = EcoRI, X = XhoI P, E1, E2 Delece 6,7 kb v prvním intronu Důkaz, že homologní rekombinace proběhla Sonda = cDNA HPRT Izolace klonu ES buněk s korigovaným genem HPRT a jejich zavedení do blastocyst, vznik myši s CG Korekce mutace v genu HPRT homologní rekombinací v ES buňkách (HPRT-) Linearizace vektoru v místě X zvýhodňující homologní rekombinaci Mutantní (deletovaný) gen myší, z nichž byly připraveny ES buňky Vektor se po zavedení do ES buněk začlenil HR Má jediný funkční gen = CG Mají deleci v genu HPRT na obou X chromozomech Korigovaný gen se dědí Korigovaný gen pro HPRT (CG) se stabilně integruje do X-chromozomu Zavedený gen měl malou expresi v játrech a vysokou v mozku, což je znak podobný genu divokého typu u normálních myší. Korekce defektu funkce CFTR in vitro CFTR = transmembránový regulátor Buňky z pacienta trpícího CF Buňky rezistentní k G418 – vektor se začlenil Forskolin = stimulátor adenylátcyklázy cDNA Zvýšený tok iontů u buněk s CFTR Target cellHuman geneDisorder Correction of Human Inherited Disorders in Cells in Tissue Culture Buňky se zavedeným transgenem přežívají in vivo Mutantní forma DHFR rezistentní k metotrexátu Usmrcení vlastních kmenových buněk zářením Primární recipient V kostní dřeni se exprimuje DHFR, tj. buňky z primárního recipienta v ní přežívají DHFR je esenciálním enzymem v syntéze dTMP, který je vyžadován dělícími se buňkami. Metotrexát (Mtx) je silný kompetitivní inhibitor DHFR 1. Úprava diety – karenční terapie (galaktosemie, fenylketonurie) 2. Substituční terapie (hemofilie, diabetes, nanismus) 3. Genová terapie (kauzální léčba) • vnesení funkčního genu (funkční alela navíc) • cílená oprava mutace homologní rekombinací • cílené usmrcování geneticky pozměněných buněk • cílená inhibice exprese genů zodpovědných za genetickou poruchu Možné způsoby léčby genetických onemocnění • Specially formulated diets • Restrictive diet to lower the intracellular level of toxic molecule • Supplemented diet to replace a metabolic deficiency • Inhibition of enzyme reactions • Enzyme inhibitor to prevent the accumulation of the toxic molecule by blocking a step in a metabolic pathway that precedes the reaction with a defective enzyme • Removal of toxic molecules • Dialysis • Removal of excess cations (chelation) • Facilitation of excretion by binding a toxic molecule to a lowmolecular-weight compound • Replacement of defective or missing product • Enzyme replacement therapy • Protein replacement therapy • Cofactor supplementation Strategies for treating genetic disorders • Alteration of defective protein by small molecules • Restoration of partial protein function • Directed proteolytic degradation of defective protein • Transplantation • Replacement of a nonfunctional organ (organ transplantation) • Providing a required protein synthesized by blood cells (bone marrow transplantation) • Gene therapy • Rectification of a genetic defect with a functional gene • Nucleic acid therapy • Blocking translation of mRNA from a mutant gene with an oligonucleotide (antisense, ribozyme) • Correction of gene mutation with an oligonucleotide Strategies for treating genetic disorders A. Oprava mutantní alely homologní rekombinací B. Inhibice translace pomocí antisense oligonukleotidů C. Selektivní destrukce nebo reparace mRNA pomocí ribozymu D. Selektivní inhibice mutantní alely RNA interferencí Metody opravy nebo inaktivace patogenních genů v buňkách a tkáních Léčba genetických chorob • Dědičných • Nádorových Podle typu buněk, do nichž jsou geny vnášeny: a) Genová terapie zárodečných buněk b) Genová terapie somatických buněk Podle způsobu přenosu genů a) Genová terapie in vitro (ex vivo) b) Genová terapie in vivo Genová terapie 1/500LDL-receptorPředčasné arteriosklerotické změny cév.Familiární hypercholesterolemie 1/3 500α1-antitrypsinPlicní emfyzém, (rozedma plic).Deficience na α1-antitrypsin 1/2 500transmembrá-nový regulátor CF Porucha v transportu Na-, zahlenění dýchacích cest, embolie. Cystická fibróza, CF 1/106 1/3 000 mužů ? 1/106 mužů 1/12 000 1/106 Četnost Příklady lidských chorob podmíněných monogenně a připadajících v úvahu pro genovou terapii v současnosti hypoxantingua- ninfosforibozyl- transferáza Usazování kyseliny močové v kloubech a ledvinách, poruchy CNS. Leschův-Nyhanův syndrom dystrofinSvalová ochablost.Duchennova svalová dystrofie glukocerebro- zidáza Nádory sleziny, zvětšení jater, žluté zbarvení (pigmentace) kůže. Gaucherova choroba faktor VIII, faktor IXPorucha v srážlivosti krve, krvácivost.Hemofilie A + B fenylalaninhy- droxyláza Fyzická a psychická retardace.Fenylketonurie adenozinde- amináza Defektní T-lymfocyty, porucha v tvorbě protilátek, narušení imunitního systému. Deficience adenozindeaminázy (ADA) Produkt defektního genu Hlavní symptomyNemoc ex vivoGenová terapie in vitro Přímá injekce a bombardování: účinný přenos do buněk různých tkání. Účinnost není vysoká a injikovaná DNA není stabilně integrována. Ve svalech se může DNA udržet i několik měsíců. Využití: přenos plazmidových konstruktů pro dočasnou expresi transgenu: • likvidace infekčních agens, • DNA-vakcinace, • destrukce nádorů Přenos genů endocytózou zprostředkovanou receptory Endocytóza: DNA je napojena na molekulu, která se může vázat na receptor buňky, indukovat endocytozu a přenést se tak DNA do buňky. Účinnost metody může být vysoká, ale nedochází k integraci DNA. Kotransfer adenovirů nebo adenovirových proteinů Využití lipozomů pro vnášení genů in vivo DNA Lipozomy: Syntetické váčky (fosfolipidy), které se tvoří ve vodném prostředí – struktury imitující biologické membrány. Snadno se připravují, není omezena velikost DNA. Účinnost přenosu nízká, DNA se neintregruje do chromozomu a její exprese je dočasná. DNA Vnášení retrovirových vektorů do těla pacienta (genová terapie in vivo) Catheter Double balloons Instillation port Iliac artery Femoral artery 1. Snadné získání buněk z těla 2. Snadná kultivace v kulturách in vitro 3. Odolnost k manipulacím spojeným se zaváděním genů 4. Schopnost navrácení buněk do organismu, kde se musí pomnožovat a přetrvávat po dostatečně dlouhou dobu • Kmenové buňky kostní dřeně • Kožní fibroblasty • Hepatocyty • Myelocyty Vlastnosti buněk vhodných jako vektory pro zavádění genů do organismu Záměna mutantní formy genu za normální Strategie genové terapie A) Přidání funkčního genu B) Strategie genové terapie C) D) Cílená inhibice genové exprese Přímé usmrcování patogenních buněk Usmrcování chorobných buněk buňkami imunitního systému Strategie genové terapie C) Schéma postupu při genové terapii deficience na adenozindeaminázu Normal T-cell function requires the enzyme adenosine deaminase (ADA). These two girls suffer from severe combined immunodeficiency disease (SCID) resulting from a mutant form of ADA. They were among the first persons to receive gene therapy. Doctors removed some of the white blood cells from each girl, cultured them, added genetically engineered viruses containing working copies of the ADA gene, and then treated each girl with her own engineered cells. Years after the initial therapy, each girl still has a functional subset of T cells that produces ADA. Alternativa: Přenos genu pro TNF přímo do nádorové buňky Schéma genové terapie melanomu 1. Snadné získání buněk z těla 2. Snadná kultivace v kulturách in vitro 3. Odolnost k manipulacím spojeným se zaváděním genů 4. Schopnost navrácení buněk do organismu, kde se musí pomnožovat a přetrvávat po dostatečně dlouhou dobu • Kmenové buňky kostní dřeně • Kožní fibroblasty • Hepatocyty • Myelocyty Vlastnosti buněk vhodných jako vektory pro zavádění genů do organismu nejpoužívanější v GT, velmi dobře infikují lidské buňky. Asi 70% pokusů s GT • Onkoretroviry: transgen začleňují do chromozomu do dělících se buněk výhoda při léčbě nádorů (např. nádory mozku). Riziko inzerční inaktivace endogenů • Adenoviry: infikují nedělící se buňky, DNA zůstává jako epizom v jádře. Jsou bezpečné, ale exprese je krátkodobá. Problém je imunogenicita. Uplatnění tam, kde je nutná vysoká exprese během krátké doby, např při léčbě rakoviny pro zabití buněk. • Adenoasociované viry AAVs: Nepatogenní, schopné infekce jen s využitím adenovirů jako pomocných virů k replikaci. Integrují DNA do chromozomu na specifické místo, umožňující dlouhodobou expresi bez rizika inzerční mutageneze. • Lentiviry: HIV (retrovirus) – infikují nedělící se buňky. Do chromozomu se integrují náhodně – douhodobá exprese. Nutnost odstranění virových genů a zachování schopnosti infikovat nedělící se buňky. • Herpes simplex viry: Mají tropii pro CNS, v latentní infekci jsou epizomální, tj. dlouhodobě exprimují transgen a šíří jej do okolní synaptické sítě. Hlavní úloha: přenos genů do neuronů pro léčbu nervových chorob (Parkinsonova ch.) a tumory CNS. Viry jako vektory Principal viral vectors of potential application for human gene therapy DisadvantagesAdvantagesPotential target cellsParent virus Konstrukce retrovirových vektorů a vytváření infekčních virových částic Retrovirové vektory schopné infikovat cílové buňky Poznámka: Minigen je uměle připravená rekombinantní DNA, v níž je příslušná kódující sekvence genu spojena s regulačními oblastmi vektoru, které umožňují expresi této kódující sekvence. Genová terapie prostřednictvím „antisense“ – oligonukleotidů Zábrana exprese genů navozená protismyslovou RNA Použití ribozymu typu „hammerhead“ ke štěpení mutantní mRNA Úseky ribozymu komplementární k sekvenci mRNA cílového genu Mutantní mRNA ribozym Mechanismus RNA interference - iRNA Dvojřetězcová RNA vnesená do buňky nebo vytvářená z transgenu Komplex RNázy Degradace RNA Amplifikace degradované RNA polymerázou Endogen v cílové buňce Vytvoření krátkých 22 nt fragmentů dsRNA tzv. siRNA mRNA je štěpena mRNA je degradována, endogen není exprimován Přirozená funkce iRNA: obrana proti transpozonům a RNA virům Přehled schválených protokolů genové terapie X-SCID – těžká kombinovaná imunodeficience vázaná na X chromozom: mutace genu kódujícího γ c-řetězec receptoru pro interleukin 2, která zabraňuje normálnímu vývoji T-lymfocytů a „killer“ buňkám (náchylnost k infekcím, bez transplantace kostní dřeně smrt do 1 roku života) Odběr kostní dřeně Kultivace buněk in vitro, infekce retrovirovým vektorem s genem g c, pomnožení buněk Vrácení buněk do těla pacienta 10 pacientů vyléčeno 2 pacienti onemocněli leukémií v důsledku aktivace onkogenu retrovirem Dosud jediný příklad úspěšné léčby chorob genovou terapií 1. dodání genu: obnova funkce nádorových supresorových genů 2. inaktivace genu: zábrana exprese aktivovaného onkogenu 3. genetická manipulace: vyvolání apoptózy nádorových buněk 4. modifikace nádorové buňky tak, aby byla více antigenní a byla zničena imunitním systémem 5. modifikace dendritických buněk ke zvýšení nádorově-specifické imunitní odpovědi 6. použití geneticky upravených onkolytických virů selektivně usmrcujících nádorové buňky 7. genetická modifikace nádorových buněk zajišťující konverzi netoxického prekurzoru na toxický produkt Genová terapie nádorů Příklady léčby nádorů pomocí genové terapie Injekce retroviru s TK do tumoru. Jsou infikovány jen rostoucí buňky. Je přidán gancyklovir, který TK-pozitivní buňky (tj. tumorové) mění na toxin a jsou tak samy selektivně usmrcovány Nádorové buňkyMaligní gliom (mozek) Na autologní dendritické buňky se působí tumorovým antigenem nebo cDNA exprimující antigen aby zahájily imunitní odpověď vůči tumoru. Dendritické buňky Prostata Transfekce nádorových buněk retrovirem exprimujícím povrchový antigen (HLA-B7) nebo cytokin (IL-12), což by mělo zvýšit imunogenicitu tumoru, takže jej imunitní systém snáze zničí. Nádorové buňkyRůzné nádory Extrakce TILs z tumoru a jejich pomnožení. Infekce TILs retrovirem s genem pro nekrotický faktor, který pak působí na okolní buňky v nádoru. Tumor-infiltrující lymfocyty (TILs) Maligní melanom Injekce adenoviru s scFv protilátkou proti onkoproteinu ErbB2. Snaha o inaktivaci růstového signálu. Nádorové buňkyVaječník Intraperitoneální injekce retrovirů nebo adenovirů s genem p53 nebo BRCA1 – obnova kontroly buněčného cyklu. Nádorové buňkyVaječník Použitá strategie genové terapieZměněné buňkyTyp nádoru Inject brain tumour with engineered retrovirus containing TK gene A few cells are modified Treat with ganciclovir Modified cells and „bystanders“ killed. Healthy cells away from the tumour are not affected Gene therapy for brain tumours. The tumour is directly injected with a retrovirus containing the mouse thymidine kinase (TK) gene and a few cells take up the vector, shown in blue. These cells convert the prodrug ganciclovir into an active form and are killed (grey cells). Because of the bystander effect surrounding cells are also killed. Genová terapie in vivo Do nádoru jsou injikovány buňky, do nichž byl in vitro vnesen retrovirový vektor, který obsahuje gen pro tymidinkinázu (TK). Vektor se uvolňuje a infikuje okolní nádorové buňky, v nichž se pak vytváří TK (retrovirus je schopen infikovat jen dělící se buňky!). Do těla pacienta je intravenózně podána netoxická látka gancyklovir (gcv), která je TK konvertována na toxický gcvtrifosfát usmrcující buňky.