Diagnostika a léčba nádorových
onemocnění
Diagnostika,
Léčebné metody
Chemoprevence
Nutriční onkologie
Mechanizmy působení protinádorových léčiv
Léková rezistence
Prediktivní markery, bioinformatika
Incidence a úmrtnost na nádorová onemocnění
(USA)
2
Diagnostika
• Laboratorní vyšetření ( sedimentace erytrocytů, hematologické
vyšetření, biochemická vyšetření)
• Cytologické a bioptické vyšetření (pre- nebo postoperační)
• Nádorové markery – laboratorně prokazatelné známky projevu
specifických nádorových onemocnění (antigeny, emzymy,
hormony a jejich receptory)
Mohou odrážet proliferační aktivitu, mohou být sdružené s
diferenciací nebo vznikají při destrukci buněk.
Patří sem i pro nádor charakteristické chromozomální
abnormality.
• Biochemické metody detekce: radioimunologická (RIA), enzym
vázající imunosorpční (ELISA) (většinou komerční kity a
automatické analyzátory)
3
• Vyšetření stavu buněčné kinetiky
Morfologie, sledování počtu mitóz – mitotický index
Metody autoradiografické (inkorporace 3H-tymidinu)
Metody cytochemické (speciální barvení, speifické protilátky proti
antigenům spojeným s proliferací (Ki-67, PCNA), stanovení
AgNOR
Průtoková cytometrie
Buněčný cyklus, ploidita, specifické markery, imunotypizace (CD
antigeny)
• Molekulárně biologické metody (Southern, Nothern a Western
blotting pro analýzu DNA, RNA a proteinů), polymerázová
řetězová reakce – amplifikace malých fragmentů DNA, vytváření
cDNA knihoven z malého množsví mRNA (PCR, RT-PCR, realtime
PCR)
Hybridizace in situ, microarrays
4
 Zobrazovací metody
• Ultrasonografie – vyšetření ultrazvukem, neinvazivní
• Rentgenové vyšetření – kontrastní vyšetření, mamografie –
screening a diagnostika rakoviny prsu
• Počítačová tomografie (CT) - odhalí až 90% ložisek menších
než 1 cm
• Magnetická rezonance (MR) – zejména vyšetření mozku
a míchy
• Radionuklidové vyšetřovací metody – využití izotopů
(scintigrafie, emisní tomografie
• Endoskopické vyšetření – nádory v tělních dutinách
5
Dědičnost nádorových onemocnění
Genetika, mutace specifických genů – zvýšená náchylnost (susceptibility)
k určitým typům nádorů
Prevence – „family trees“, cytogenetické amalýzy, enzymové markery
6
Klasifikace nádorových onemocnění
Určení rozsahu onemocnění důležité pro volbu léčebné strategie a pro
odhad prognózy onemocnění.
Jednotný klasifikační systém TNM
• T (tumor) 1-4 – rozsah primárního nádoru
• N (noduli) 1-3, 0, X – stav regionálních mízních uzlin
• M (metastases) 0, 1 – informace o metastázách
Histopatologický grading G1 – 4, X – stupeň diferenciace
Další nezávazné deskriptory
Stadium choroby (staging) I. – IV.
Hodnocení tělesné zdatnosti (funkční staging)
U některých nádorů formulován soubor prognostických znaků, tzv.
mezinárodní prognostický index (IPI)
Vznik a vývoj nádorů je složitý děj, který závisí na překonání řady
restrikčních mechanismů na úrovni genomu, buňky, tkáně i celého
organismu a který pro svou komplexnost vyžaduje při plánování terapie
individuální přístup (tailoring therapy) - využití poznaných biologických
charakteristik
7
• Klinické – staging (jeden z nejsilnějších prognostických faktorů),
sledování přežití a léčebné odpovědi
• Orgánové – sledování odpovědi nádoru na léčbu
• Tkáňové – histologická charakteristika, grading, tkáňová architektonika,
vaskularizace, expresní profily-imunohistochemie, in situ hybridizace
• Buněčná – funkční testy, obsah DNA, proliferační a apoptická aktivita
• Molekulární – cytogenetické a genetické charakteristiky nádorových a
somatických buněk
Incidence nádorových onemocnění se stále zvyšuje. Přesto je dlouhodobá
mortalita téměř konstantní díky výrazným léčebným a diagnostickým
pokrokům.
Nové léčebné postupy, nová chemoterapeutika, kombinovaná terapie a
aplikace nových poznatků o biologii nádorové buňky.
Hledají se nové prognostické/prediktivní faktory umožňující přesnější
rozdělení nemocných do rizikových skupin.
8
Léčebné metody
• Chirurgie
• Ozařování
• Chemoterapie
• Biologická terapie
Chemoterapeutické látky
• platinové deriváty
• antimetabolity (metotrexat, fluorouracil)
• inhibitory topoizomeráz (doxorubicin, etoposid)
• alkylační činidla (cyklofosfamid)
• rostlinné alkaloidy (vinblastin, paclitaxel)
Biologická terapie - hledání nových přístupů na základě poznání
mechanismů
• Stimulace obranných mechanismů hostitele včetně specifických a
nespecifických imunologických přístupů (imunoterapie)
9
• Strategie cílené přímo na změnu nádorového růstu a diferenciace využití
růstových faktorů, genetické inženýrství - ovlivnění klíčových
genů.
• Angiogenní terapie – cílená proti vaskularizaci nádorů
Podpůrná (symptomatická) léčba
Nemá za cíl smrt nádorových buněk, ale usiluje o co nejlepší kvalitu života
nemocných (zmírnění obtíží vyvolaných nádorem a léčbou)
Paliativní léčba – komplexní podpůrná léčba u pacientů s pokročilým
nevyléčitelným onemocněním
Kurativní léčba – cílem je vyléčení nemocného
Nekurativní léčba – cílem je zabíjet nádorové buňky, ale nemá ambice vyhubit
všechny (pokročilé onemocnění, rezistence na léčbu atd.)
Adjuvantní léčebné postupy – chemo- nebo radio-terapie – u těch nádorů, kde
je předpokládána přítomnost mikrometastáz, nutná chemosenzitivita nádoru
Neoadjuvantní postupy – předoperační léčba s cílem zmenšit primární nádor
před chirurgickým výkonem
10
Nové směry vývoje protinádorové léčby
Cílem je přímo a cíleně zasáhnout do klíčových mechanismů
karcinogeneze na buněčné úrovni (targeted therapy).
Často v kombinaci s konvenčními léčebnými postupy.
• Anti-EFGR terapie – monoklonální protilátky s vazbou na receptor
epidermálního růstového faktoru (EGF), inhibitory tyrozinových kináz,
„antisense“ nukleotidy, vakcína proti receptoru nebo ligandu
• Diferenciační terapie (kyselina all-trans retinová, vitamin D3)
• Inhibitory přenosu signálů
 Inhibitory tyrozinových kináz
 Inhibitory cyklin-dependentních kináz – ovlivnění buněčného cyklu
 Inhibitory jiných kináz – např. MAP kinázy, JNK
 Inhibitory farnesyltransferázy – inhibují onkoprotein ras – spojen
s vnitřní stranou plazmatické membrány izoprenoidní lipidovou
skupinou – farnesylem
Mutace protoonkogenu ras - častá u nádorů - vede k nekontrolované
proliferaci, inhibici apoptózy a zvýšení angiogeneze
11
• Genová terapie
Postup mající za cíl napravit genetickou odchylku
způsobující vývoj nádorové buňky (p53, geny
rezistence, sebevražedné geny, cytokiny)
• „Antisense“ oligonukleotidy
• Angiogeneze a antiangiogenní terapie
 inhibitory proteáz
 inhibitory migrace a proliferace endotelu
 inhibitory angiogenních růstových faktorů
12
Imunoterapie
intervence do imunitních mechanizmů s cílem obnovit nebo
modifikovat funkce imunitního systému (substituční, supresivní
nebo stimulační, aktivní vs. pasivní, specifická a nespecifická)
Buněčná imunoterapie – podání buněk imunitního systému
s protinádorovou aktivitou – cílené zasažení nádorové tkáně a
překonání tolerance a imunosuprese vyvolané nádorem.
Nádorové antigeny – vznik nových antigenů, kterými se nádorové
buňky liší od normálních – terč pro imunitní reakci
Nespecifická buněčná imunoterapie – posílení protinádorové
imunity nezávisle na specifických nádorových antigenech
13
Princip: kultivace efektorových buněk ex vivo
s látkami, které aktivují nebo posilují jejich protinádorový účinek
(LAK buňky, NK-buňky, aktivované monocyty-makrofágy
Zkoušeno přes 30 let – malé uplatnění v praxi
Specifická buněčná imunoterapie – adoptivní imunoterapie
využívající specifický převod buněk (TIL)
Protinádorové vakcíny – navozují specifickou imunitní odpověď
proti nádorovým buňkám v prim. nádoru i metastázách
Dendritické buňky
14
J.Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, 2004 15
Prediktivní onkologie
klinicky orientovaný onkologický výzkum využívající metod buněčné a
molekulární biologie.
Hledání nových léčebných postupů a léčiv směrovaných na klíčové genetické
změny umožňující transformaci normální somatické buňky v nádorovou.
Jsou to především
• poruchy buněčného cyklu,
• poruchy v aktivitě/množství receptorů pro růstové faktory,
• exprese protiapoptických faktorů a
• nesmrtelnost nádorových buněk vázaná či nevázaná na expresi
telomerázy.
Chromozomální a genetická analýza nádorových buněk je důležitým
faktorem pro prognózu a individualizaci léčby. Problémem jsou zvláště
solidní nádory, kde jsou cytogenetické znalosti minimální např. ve srovnání
s hematologickými malignitami.
V praxi se jedná o stanovení ploidity DNA, chemosensitivity in vitro,
cytogenetické a genetické vyšetření atd.
16
Molekulární patologie
studium procesů související se vznikem a rozvojem chorob, a to
na úrovni nukleových kyselin a proteinů, respektive jiných
molekul, které jsou jimi regulovány.
Využívá technik molekulární biologie a výsledky jsou dávány
do kontextu s nálezy dalších biomedicínských oborů.
Umožňuje odhalovat počátky nemoci a nahlédnout až na genovou
úroveň.
Zpětně přispívá k vývoji nových léčebných přístupů.
17
Transplantace
Autotransplantace
Před plánovanou radio- či
chemoterapií nádorů
(nehemopoetických).
Odběr zdravé kostní dřeně
nebo krve – izolace
kmenových buněk či
progenitorů (někdy
s podporou příslušných růst.
faktorů). Po léčbě zpětná
transplantace pro obnovu
krvetvorby.
Transplantace od vhodného
dárce – u hemopoetických
malignit.
18
Využití transplantace tkáňově specifických kmenových
buněk
Možnost kultivace in vitro. Hemopoetické kmen. buňky z kostní dřeně (rekonstituce
poškozené krvetvorby), epiteliální kmen. buňky (popáleniny, poškození kůže),
dopaminergní neurony odvozené z embryonálních kmen. buněk (Parkinsonova
choroba). 19
Tvorba emryonálních
kmenových buněk přenosem
jádra somatické buňky
do enukleovaného oocytu.
Buňky získané z takto vytvořené
blastocysty lze využít
k transplantaci, příp. s využitím
předchozí genové terapie
k nápravě genetických poškození.
20
Scharlau D et al., Mutat Res 2009, 682:39
PREVENCE A TERAPIE
Primární prevence – inhibuje iniciaci buněk redukcí toxicity nebo indukcí detoxifikace
Sekundární prevence - redukuje přeměnu iniciovaných buněk v preneoplastické supresí
proliferace nebo indukcí diferenciace nebo apoptózy
Terapie – se zaměřuje na omezení rozvoje onemocnění do progresivního stadia
Chemoprevence a chemoterapie
22
Chemoprevence
Přírodní nebo syntetické látky, zasahující v ranných fázích karcinogeneze.
Aktivují detoxifikační enzymy, antioxidační účinky - laboratorní a
epidemiologické studie
• -tokoferol, -karoten , vitamin A a retinoidy - zelenina, ovoce
• Dithiolthiony, sulforaphan - brokolice, květák, kapusta
• Genistein - sója
• Epigallocatechine gallate - zelený čaj
• Curcumin - curry
• Tamoxifen - antiestrogen - prevence u žen se zvýšeným rizikem vzniku
nádoru prsu
• Nesteroidní antiflogistika (NSAID) - aspirin, piroxicam, sulindac prevence
kolorektálních nádorů
• Finasteride (blokuje přeměnu testosteronu na androgen) - prevence
nádorů prostaty
• DFMO - difluorometylornitin (blokuje aktivitu ornitin dekarboxylázy) prevence
různých typů nádorů
23
Příklady syntetických chemopreventivních látek
- Selektivní inhibitory
COX-2
- Ligandy receptoru
pro retinoidy
- sLigandy pro PPARγ
24
Příklad různých strukturálních podob skvalenu
25
Oleanolic and ursolic acids, which have been used as chemopreventive agents, are
both derived from squalene. Note that the two structures differ only in the location of
the two methyl groups in the E-ring.
Nové látky vznikající na základě
strukturálních studií
26
Mechanismy působení
protinádorových léčiv
27
CHEMOTERAPEUTICKÉ LÁTKY
Chemoterapeutika zabraňují množení buněk nebo indukují apoptózu různými
mechanismy.
Antimetabolity, inhibitory topoizomeráz a alkylační činidla blokují syntézu DNA
Rostlinné alkaloidy blokují mitotické dělení
28
Chemoterapeutika vyvolávající oxidativní
stres
29
Chemoterapeutika aktivují apoptózu přes mitochondriální dráhu nebo
přes aktivaci receptorů smrti („death receptors)
Dvě dráhy aktivace apoptózy chemoterapeutiky
30
Signální dráhy apoptózy indukované chemoterapeutiky
31
32
Dávková závislost
Expozice buněk velmi nízkými dávkami chemoterapeutik má minimální
efekt na viabilitu nebo bun. cyklus díky dostatečným schopnostem
reparačního systému opravit poškození.
Ve vyšších koncentracích v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti
kontrolního bodu v G1 (souvisejícího s expresí p53) se vyskytují 2 typy
odpovědi:
• v případě funkčního kontr. bodu je bun. cyklus zastaven v G1 dokud
nedojde k opravě poškození nebo dochází ke spuštění apoptózy při
velkém rozsahu poškození (po vysokých konc.) nebo neúspěšné
reparaci.
• jestliže je kontr. bod nefunkční (např. při mutaci p53) buňky vstupují do
S fáze, ale postup (DNA replikace) je suprimována podle konc. látky.
- v případě buněk „primed“ k apoptóze, dojde k apoptóze rychle (3-6 h,
„immediate apoptosis“) u prahových hodnot konc., slabě nad těmi, které
kompletně inhibují progresi S fáze.
33
- v případě non-primed buněk prodloužená suprese průchodu bun.
cyklem (defective progression) vede k růstové nerovnováze,
sekundárním změnám, následnému nastartování a pozdní apoptóze.
Tato apoptóza vykazuje často atypické vlastnosti, komlikované růstovou
nerovnováhou a sekundárními změnami metabolismu.
- při ještě vyšších konc. překračujících farmakologickou dávku dochází
k nekróze.
Nádorové tkáně mají, analogicky jako normální tkáně, proliferující část
populace a část populace neproliferující, která se skládá z klidových
buněk v G0 fázi nazývané někdy také populace kmenových
neoplastických buněk.
Tyto buňky je obtížné zničit, protože jsou rezistentní k cytostatickému
působení záření nebo chemoterapeutik.
Určitou dobu po ozáření nebo chemickém působení vstupují znovu do
cyklu a jsou zdrojem obnovy nádorového růstu.
34
Opakovaná cytostatická terapie a kombinovaná terapie
(s využitím humorálních faktorů, imunologickou indukcí, atd.)
představují hlavní přístupy jak dostat do cyklu i klidové buňky, a
pak účinně inhibovat jejich růst.
Klíčovou otázkou však zůstává volba nejvhodnějšího časového
intervalu mezi jednotlivými aplikacemi (matematické modely).
Klidové buňky přežívají mnohem lépe, protože během dlouhého
časového intervalu mezi cytostatickým působením, replikací DNA
a dělením chromosomů je poškozený genetický materiál
reparován.
Rychle rostoucí nádory jsou citlivé na cytostatickou terapii,
frakce neproliferujících buněk je malá, buňky mají krátkou
generační dobu.
35
Opakovaným působením lze převést G0 buňky do cyklu a
účinně inhibovat růst (lymfomy, seminomy, některé leukémie).
Pomalu rostoucí nádory mají přechod buněk z G0 zásobní
populace řízen negativní zpětnou vazbou.
Tento mechanismus udržuje vždy minimální hladinu G0 buněk,
ze kterých se populace vždy obnovuje.
Tyto nádory jsou rezistentní na cytostatickou terapii a je velká
pravděpodobnost vzniku rezistentních klonů.
Buňky mají dlouhou generační dobu (karcinom tlustého střeva,
žaludku, plic, sarkomy).
36
Wicha MS et al., Cancer Res. 2006
Klinická implikace modelu nádorových kmenových
buněk (CSC)
CSC jsou důležité pro snížení rizika nádoru, brzkou detekci, prevenci i terapii.
Redukce normálních kmenových buněk (SC) – snížení rizika nádoru. Detekce faktorů
sekretovaných iniciovanými SC – brzká detekce. Indukce apoptózy či diferenciace SC
– prevence. Selektivní eliminace CSC – úspěšnější terapie. 37
Obecné schéma účinků vzrůstající koncentrace protinádorových látek poškozujících DNA na
buněčný cyklus a apoptózu.
Velmi nízké koncentrace – žádné či minimální účinky díky dostatečné kapacitě reparačního
systému
Vyšší koncentrace:
- funkční kontr. bod v G1- zástava a reparace poškození nebo apoptóza (při vysoké konc. léčiva
nebo při neúspěšné reparaci).
- nefunkční kontr. bod (mutace p53) – vstup do S-fáze – průchod brzděn podle konc. léčiva
„primed cells“- apoptóza během 3-6 h (immediate apoptosis) při hraniční koncentraci. Spojeno s
dalšími faktory, např. konstitutivní expresí c-myc.
Prolongovaná suprese průchodu bun. cyklem („nonprimed cells“) vede k růstové nerovnováze,
sekundárním změnám a zpožděné apoptóze (delayed apoptosis). Ta má často řadu atypických
znaků.
Po příliš vysokých dávkách dochází k nekróze.
Průchod buněčným cyklem
Normální (delayed apoptosis)Defektní
Žádný účinek
(reparace)
Nekróza
(„Primed“
cells)
Cytostat. účinky Immediate
Apoptosis
Koncentrace léčiva0
38
Typy buněčné smrti po působení protinádorových terapeutik
jsou závislé na dávce
39
Vhodná strategie pro úspěšnou nádorovou
terapii
Optimální terapie – zvýšená apoptóza nádorových buněk a snížení
toxicity pro normální buňky
40
Léková rezistence
41
Mechanismy rezistence ke xenobiotikům
rezistence může být důsledkem:
• snížené vnitrobuněčné koncentrace látky díky změněnému
příjmu do nitra buňky, zvýšenému vylučování z buňky nebo
rozložení v buňce
• zvýšené buněčné detoxifikace (inaktivace)
• kvalitativních nebo kvantitativních změn buněčného cíle
(enzymu)
• neschopnosti přeměňovat látku na aktivní formu
• zvýšené inaktivace látky
• zvýšené reparace DNA
• poruch v drahách apoptózy
Mnoho těchto mechanismů může působit současně a jsou buď
přirozeně přítomny v buňce nebo vznikají de novo během choroby
a léčení.
42
Vylučování látky z buňky je spojeno s aktivitou specifických
proteinů nebo proteinových komplexů uvnitř cytoplasmatické
membrány.
MDR - "multidrug resistance" k nádorové chemoterapii
spojené se zvýšenou expresí Pgp (P170) glykoproteinu membránová
adenosin trifosfatáza (ATPáza) se širokou specifitou.
Transportuje endogenní substance (toxiny, metabolity, odpad,
hormony atd.).
Farmakologická funkce spočívá v protekci proti cytotoxickým
látkám.
Mechanismus MDR je posledních 10 let intenzívně studován. Byl
izolován lidský gen MDR1 na chromosomu 7. Tento gen kóduje
Pgp a jeho exprese je spojena s MDR fenotypem.
43
Léčivo
Aktivované léčivo
Inaktivované léčivo
Detoxifikace léčiva
Buněčné mechanizmy lékové rezistence
Cíl
Snížený příjem
léčiva
Obvyklá dráha inhibice cíle Různé typy rezistence
Aktivace léčiva Inaktivace léčiva
Absence
aktivace léčiva
Změna cíle
Amplifikace cíle
Detoxifikace
Seqestrace
Reparace
Inhibice cíle
Modifikace cíle
Zvýšené vylučování
léčiva
44
Buněčná detoxifikace
Základní roli v rezistenci nádorových buněk k různým cytotoxickým
látkám hraje glutation (GSH) - vnitrobuněčný tripeptid obsahující cystein
a přítomný v savčích buňkách ve vysokých koncentracích.
Zvýšená konjugace s GSH je hlavním mechanismem vývoje rezistence.
Glutation-S-tranferázy (GST) - čtyři známé izoenzymy - jsou hlavní
skupinou detoxifikačních enzymů. Protože katalyzují konjugaci s GSH, je
hladina jejich exprese hlavním faktorem určujícím senzitivitu buněk.
GSH i GST mohou způsobovat rezistenci i jinými mechanismy než
konjugací, např. GSH může modulovat reparační funkce DNA a tak
kontrolovat rezistenci např. k cisplatině.
Využití inhibitorů GSH - indometacin, piriprost
Rezistence k chemoterapii zprostředkovaná změnami
buněčného cíle
Změny topoizomerázy - topoiz. II je zásadní pro replikaci DNA - cíl
interkalačních látek jako je adriamycin, actinomycin D nebo
neinterkalačních látek jako jsou etoposide nebo teniposide.
45
Rezistence může být způsobena změnou hladiny topoiz. II nebo expresí
mutovaného enzymu.
Změny DHFR (dihydrofolátreduktázy) - cíl antifolátových látek - metotrexát.
Zvýšená hladina DHFR je příčinou rezistence.
Změny tymidilát syntázy - cíl 5-fluorouracilu. Dva mechanismy rezistence změny
afinity TS k lékům díky substituci jedné aminokyseliny nebo zvýšená
TS aktivita.
Zvýšené reparační funkce DNA
DNA je cílem různých cytotoxických látek. Přímou nebo nepřímou vazbou k
DNA způsobují tyto látky změny v DNA a genomové poruchy vedoucí k
buněčné smrti.
Jednoduchá alkylační činidla se kovalentně váží k DNA - vnitro- i
meziřetězcové vazby.
Deriváty kovů jako je cisplatina tvoří také podobné vazby. Cisplatina obecně
porušuje DNA indukcí vnitrořetězcových vazeb mezi N7 atomy dvou
sousedních guaninů a v menší míře indukcí meziřetězcových vazen a
monoaduktů.
Další cytotoxické látky jsou schopny nekovalentně se vmezeřovat do DNA.
Ačkoliv všechny tyto interakce s DNA jsou potenciálně letální, rozsah
buněčné smrti je ovlivňován rozdíly v rozsahu reparace.
46
Existuje inverzní vztah mezi buněčnou reparací a cytotoxickou
senzitivitou.
Reparační procesy DNA jsou velmi komplexní a závisí na typu
poškození. Jejich regulace se účastní na 200 různých genů. Mají velký
význam pro nádorovou chemoterapii, protože jsou zahrnuty v
rezistenci k velkému počtu cytotoxických látek, zejména těch, které
nejsou ovlivněny MDR fenotypem.
Tři hlavní typy reparace DNA:
Reverze poškození - nejjednodušší biochemický pochod obnovující
integritu DNA. O6 - alkylguanin DNA alkyltransferáza přispívá hlavním
dílem k rezistenci k alkylačním činidlům - inhibice enzymu významně
zesiluje cytotoxické účinky látek.
Bohužel, tento zásah může na druhé straně indukovat nádory, protože
tento enzym zabraňuje karcinogenním účinkům řady molekul.
Excise pošlození specifickými glykosylázami po specifickém poškození
bazí s následným vyříznutím DNA a doplněním pomocí polymeráz a
ligáz. Exprese těchto enzymů je u rezistentních buněk pozitivně
regulována.
47
Postreplikační reparace umožňuje nápravu vážných poškození DNA.
Jestliže nejsou před replikací opraveny, způsobují tato poškození
replikační blok. Buňky obnovují syntézu DNA v jiném replikačním
bodě.
Využití inhibitorů reparace DNA může zlepšit terapii. Inhibice
specifických enzymů jako je DNA polymeráza nebo topoizomeráza II.
K úspěšnosti chemoterapie přispívá řada faktorů. Jsou to
farmakologické faktory, které zabraňují adekvátní expozici látkou v
místě působení:
• způsob podávání léku - koncentrace a doba
• morfologické podmínky - absorpce, metabolismus, vaskularita a
okysličování tkáně.
Kromě těchto faktorů, které mohou být ovlivněny přizpůsobením
režimu, existují různé buněčné mechanismy odpovědné za nízkou či
vysokou hladinu rezistence.
48
Některé parametry lékové rezistence
Vnitřní (intrinsic) a získaná (acquired) rezistence
49
Různé modely lékové
rezistence
a) genetická změna v nádorové buňce
indukuje MDR (multidrug resistance) a
vytváří se rezistentní klon.
b) malá populace kmen. buněk v nádoru
exprimující transportéry léčiva přežívá
chemoterapii a repopuluje nádor.
c) získaná rezistence - kmenová buňka
exprimující transportéry přežívá terapii,
kdežto komitované buňky hynou.
Mutací pak vzniká v populaci
přežívajících kmen. buněk rezistentní
fenotyp.
d) Vnitřní rezistence – jak kmen. buňky
tak různě diferencované buňky jsou
dědičně rezistentní, takže terapie má
malý efekt.
50
Determinanty dodání léku do cílového místa
51
Determinanty působení léku v cílovém místě
52
Neonkogenní a onkogenní léková rezistence
53
Dvě cesty překonání lékové rezistence
54
Antiangiogenní terapie
Cílená proti tvorbě nových cév v nádoru (proti endoteliálním
buňkám). Výhodná kombinace antiangiogenních a antihypoxických
látek posiluje smrt nádorových buněk.
55
Cykloterapie
Modulací pomocí inhibitorů kináz se stává nádorová buňka citlivá
k apoptóze. Zároveň je normální buňka zastavena v buněčném
cyklu a chráněna před účinky léčiva. 56
Liposomy a genová terapie
Liposomy jsou využívány k cílenému dodání látky k nádorovým buňkám
(majícím příslušné povrchové receptory či antigeny).
57
58
Využití LAK (lymphokine-activated killer) buněk
v protinádorové terapii
TIL‘S (tumor-infiltrating lymphocytes) vyžadují víc
než měsíc přípravy před aplikací pacientům
59
Úloha p53 v predikci odpovědi k chemoterapii
p53 je 53-kD jaderný fosfoprotein (393 aminokyselin) - funguje jako
transkripční faktor
produkt 20-kb genu lokalizovaného na krátkém rameni lidského
chromosomu 17 - nádorově supresorový gen
Hlavní fyziologické funkce:
• regulace bun. cyklu v kontrolních bodech G1/S a G2/M
• indukce apoptózy
• stabilizace genomu
p53 kontroluje odpověď buněk na genotoxický stres indukovaný různými
podněty.
Ovlivňuje růst a viabilitu přes transkripční aktivaci nebo represi řady genů
• p21 (zástava růstu)
• gadd-45 (reparace DNA),
• Bax
60
• bcl-2
• bcl-x
• cd95 (apoptóza)
• mdm2 (zpětnovazebná regulace aktivity p53).
Asi 60 % nádorů obsahuje mutovaný typ p53 - zvýšená stabilita,
neaktivní
Ztráta divokého typu (wild-type) aktivity p53 je hlavním
prediktorem absence odpovědi na
radioterapii a chemoterapii u různých typů nádorů.
p53 zvyšuje chemosenzitivitu podporou apoptózy na transkripci
nezávislými nebo závislými mechanismy - aktivuje transkripci
proapotických genů bax nebo suprimuje transkripci
antiapoptických genů bcl-2.
61
Indukce smrti přes CD95(Fas, FasL) ligandový systém může
také zahrnovat cesty kontrolované p53.
p53 může snižovat chemosenzitivitu podporou
a) zástavy růstu závislou nebo nezávislou na p21,
b) reparace DNA a diferenciace,
c) zvyšováním transkripce antiapoptických genů jako je bcl-x.
Ukazuje se, že účinky změněného statusu p53 na
chemosenzitivitu závisejí na buněčném kontextu.
Porucha funkce p53 u normálních buněk může spíše zvyšovat než
snižovat chemosenzitivitu.
Transformované buňky, které mají wild-type p53 mají tendenci
stát se rezistentními.
62
Figure 9.4 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Frekvence mutovaného p53 u různých typů nádorů
63
Účinky ionizujícího záření na normální (A) a
nádorové buňky (B)
64
Figure 9.5 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Přežívání u nádorů s různým statusem p53
65
Table 9.2 The Biology of Cancer (© Garland Science 2007)
Cílové geny působení p53 a jejich funkce
66
Využití funkce p53 proteinu k selektivní likvidaci nádorových
buněk pomocí geneticky modifikovaného viru
67
Prediktivní markery
Proliferační aktivita a nádorový růst
Růst vyjadřuje celkové zvýšení počtu buněk jako výsledek nárůstu buněk
proliferační aktivitou a ztráty buněk apoptózou nebo nekrózou.
Proliferační aktivita je výsledkem průchodu buněk bun. cyklem.
Mechanismus odpovědný za proliferační aktivitu (P) je rychlost buněčného
cyklu, která je v inverzním vztahu ke generační době (T) na jedné straně a
na druhé straně je ve vztahu k podílu buněk vstupujících do cyklu - růstová
frakce (G).
Matematické vyjádření vztahu je P = G/T
Vysoká proliferační aktivita je tak důsledkem buď velké růstové frakce nebo
krátké gener. doby nebo obojího.
Čas zdvojení (Td doubling time) nádoru (bez ztráty buněk) je definován jako
Td = T (log 2/log (G+1)
Krátký čas zdvojení je tedy výsledkem buď krátkého bun. cyklu nebo vysoké
růstové frakce nebo obojího.
68
Proliferační markery
• techniky inkorporace značených analogů nukleotidů do DNA
3H tymidin (autoradiografie) nebo bromdeoxyuridin (BrdU,
imunohistochemie),
markery buněk v S-fázi bun. cyklu, tj. syntetizujících DNA.
Nevýhody: omezené použití in vivo, radioaktivita, dlouhé časy pro
vyhodnocení, subjektivní kriteria
• mitotický index (MI) - nejstarší metoda vyhodnocování proliferace mikroskopické
počítání mitotických figur na preparátech, do budoucna markery
pro FCM.
Mitózy však představují jen část proliferujících buněk a délka mitózy je
variabilní zejména u aneuploidních nádorů.
MI jen částečně koreluje s dalšími markery proliferace
• procento buněk v S-fázi - flow cytometrie - fluorescenční barvení DNA měření
fluorescence v suspenzi buněk
image (static) cytometry - absorpční barvení (Feulgenova reakce) - měření
buněk na sklíčku
69
Histogramy vyjadřující obsah DNA – ploidita, vyhodnocování % buněk
v jednotlivých fázích bun. cyklu - počítačové programy
SPF - S-phase fraction - celkem koreluje s dalšími markery (např. MI
nebo Ki67)
• imunohistochemické stanovení antigenů spojených s proliferací
PCNA - proliferating cell nuclear antigen - zvýšená exprese u
proliferujících buněk - koreluje s ostatními markery, ale ne vždy. Nepříliš
vhodný u nádorů, zvýšený i při reparaci DNA.
Ki67 - kódovaný genem na chrom. 10 je exprimován v G1, S a G2 fázi u
proliferujících buněk - částečně koreluje s dalšími markery.
DNA topoizomeráza II - exprese se rychle zvyšuje při přechodu S a G2 a
snižuje se na konci mitózy.
Organizátory jadérka (NORs) - segmenty DNA spojené s jadérky, které
obsahují geny kódující ribozomální DNA. Přispívají k regulaci syntézy
proteinů. Jsou vizualizovány barvením stříbrem - metoda AgNOR.
Koreluje s SPF, Ki67 a MI
70
Markery buněčné smrti
AI - apoptický index
Metody detekce apoptózy: morfologické hodnocení - světelná a
fluorescenční mikroskopie,
flow cytometrie (subdiploidní pík bun. cyklu, annexin V, TUNEL)
Další markery:
Molekuly na buněčném povrchu:
proliferace: CD71 - receptor pro transferin, receptory pro specifické
růstové faktory
apoptóza: CD95 (Fas)
Změny protoonkogenů a nádorově supresorových genů - fosforylace RB
proteinu, p53 (wild type, mutace), antiapoptický bcl-2 a proapotický bax
Změny cytoskeletonu
Markery neproliferujících a klidových buněk: statin
71
Důležité:
• Otázka interpretace a klinické využitelnosti jednotlivých markerů
• Standardizace metod a hodnocení mezi laboratořemi
• Problematika heterogenity nádorů
• Statické vs. dynamické stanovení parametrů, časový rozvoj
• Exprese a změny různých onkogenů mohou podmiňovat též citlivost
nádorových buněk k chemo- a radioterapii
• Postižení vzájemných vztahů jednotlivých markerů
• Predikce odpovědí na léčbu
72
Srovnávací genomová hybridizace a expresní
microarray analýza
Základní komponenta je fluorescenční poměrná hybridizace
In these processes, two nucleic acid samples to be compared are differentially
labeled with reagents that fluoresce at different wavelengths. They are then
hybridized along with excess, unlabeled repeat rich DNA, to the representation
of the genome onto which information is to be mapped. In CGH, the
representation may be either metaphase chromosomes or arrays of cloned
probes. In expression microarray analysis, the representation may be arrays of
cDNA clones or oligonucleotides.
73
Fluorescenční mikrofotografie z výsledků CGH analýzy
lidské línie z nádoru prsu MCF7
CF7 DNA was labeled
green and normal
reference DNA was
labeled red.
The chromosomes were
counterstained with DAPI.
Thus, regions of weak
hybridization appear blue,
regions of increased copy
number appear green and
regions of decreased copy
number appear red.
74
CGH analýza pokročilého nádoru prsu
The data are arranged along the x-axis with chromosome 20pter to
the left and chromosome 22qter to the right. The green:red CGH
ratio is plotted along the y-axis. The gray band indicates the region
of normal variability. Thus, values above the band show significant
increases in copy number and values below the band show
significant decreases in copy number.
75
Hodnocení dat – vícerozměrné analýzy
Průnik metod molekulární biologie do onkologické diagnostiky
vyžaduje zpracování multiparametrických (vícerozměrných)
souborů dat.
Bioinformatika – data z „array“ analýz (DNA, proteiny),
lipidomická data
Využití multivariačních analýz pro predikce - analýza základních
(principal) component a diskriminační analýza.
Biomarkery, „surrogate biomarkers“ – „náhradní“ biomarkery
Patří mezi ně:
• důležité genetické a cytogenetické markery,
• exprese významných regulačních genů,
• aktivity enzymů,
76
• cytokinetické parametry,
• parametry angiogeneze, atd.
Vyšetření na chemorezistenci v testech in vitro (MTT test) a
související znaky (exprese MRP, PGP).
Doplňují standardní klinická vyšetření a nespecifické ukazatele
imunologického a fyziologického stavu pacienta.
Je nutné vytvořit systém hodnocení takovýchto dat s cílem určit
jejich prognostický význam a zajistit zpětnou vazbu lékaře
k těmto hodnoceným datům – individualizace léčby – prospěch
pro pacienta
77
A B
E C
D
prognóza
A
E C
multi-
variační
analýza
78
prognóza
závěry
sporné
výsledky
zobecnění pro jiné
situace, jiné typy
nádorů, zlepšená
predikce a terapie
existující informace pro
různé typy nádorů
(experimentální data I,
databáze), empirická
zkušenost
experimentální
verifikace částečných
nesrovnalostí na
modelech in vitro
vícerozměrné
analýzy
konstrukce
modelu
doplňování
klinických dat
přehodnocení
pomocí
biomatematických
přístupů
79
experimentální
data II
Výukovou pomůcku zpracovalo
Servisní středisko pro e-learning na MU
http://is.muni.cz/stech/
80