Molekulární fyziologie genomu Historický úvod Nukleové kyseliny a chromosomy Poškození genomu Systémy reparace Cytogenetika Architektura buněčného jádra Replikace genomu Exprese genomu Historický úvod 1632-1723 Anton van Leeuwenhoek – bakterie,nematody 1655 Robert Hook – první pozorování buňky 1828 Robert Brown – objev jádra 1838 Charles Darwin – evoluční teorie 1839 Schleiden, Schwann, Virchhof – buněčná teorie 1866 Ernst Haeckel – dědičná informace je v jádře 1869 Friedrich Miescher - nuclein 1866 J.G. Mendel – zákony dědičnosti 1882 Walter Fleming – pozoroval chromosomy (mitóza) 1889 Johann Miescher – izoloval DNA 1902 Teodor Boveri – chromosomová teorie dědičnosti 1910 Thomas Hunt Morgan – geny vázány na chromosomy, 1913 – crossing over Historický úvod 1928 F. Griffith – transformace bakterií 1944 Oswald Theodore Avery – DNA je dědičný materiál 1953 James Watson and Francis Crick – DNA struktura 1974 Roger Kornberg – Struktura nucleosomu 1982 Thomas Cremer – Teritoriální struktura chromosomů v interfázi, konfokální mikroskopie, FISH technika, CGH technika, CT-IC model První pozorování pod mikroskopem (Anton van Leeuwenhoek, 1632-1723, Delft, Holandsko) Pracoval v obchodě, kde se používaly zvětšovací sklíčka k počítání vláken v látce. První viděl a popsal bakterie, červy, spermie, krevní buňky a život v kapce vody. Během svého života pozoroval svým mikroskopem velký počet věcí. Jeho pozorování otevřely nový svět. První pozorování pod mikroskopem (Anton van Leeuwenhoek, 1632-1723, Delft, Holandsko) Mikroskop – dva šrouby, objekt je umístěn na špičku hrotu, vyžaduje dobré osvětlení. Mikroskop o dvou čočkách byl poprve zkonstruován o 40 let dříve, roku 1595. Na obr. jsou zelené řasy a bičíkovci. Odkud pochází pojem buňka První pozorování buněk pod mikroskopem (Robert Hook, 1665 - Micrographia) Houby, hmyz, prvoky, buňky v korku Jádro buňky (Robert Brown, 1828) 1) Výprava do Austrálie 2) Objev Brownova pohybu 3) Objev jádra buňky Buňky a jejich jádra jádra Evoluční teorie (Charles Darwin, 1838) Anglický přírodovědec, na svých cestách se zabýval rozdělením různých forem života a fosílií na povrchu Země. Vymyslel teorii přirozeného výběru (1838) a přesvědčil vědeckou komunitu, že druhy se vyvíjejí v čase ze společného předchůdce – teorie evoluce. Na obr.: loď Beagle u břehu Jižní Ameriky, trasa lodi. Buněčná teorie (19. stol. – první polovina, Schleiden, Schwann, Virchhow a další ) 1) Všechny formy života jsou tvořeny jednou či více buňkami 2) Buňky vznikají pouze z jiných buněk 3) Buňka je nejmenší formou života Dědičná informace je v jádře (Haeckel 1866) Ernst Haeckel byl německý biolog, filosof a fyzik. Objevil tisíce druhů, zmapoval genealogický strom všech form života. Je autorem teorie rekapitulace (ontogeneze opakuje fylogenezi – viz obrázek dole vlevo). Na obrázku – sasanky z knihy „Kunstformen der Natur“ Nuclein (Friedrich Miescher, 1869) Miescher objevil nukleovou kyselinu – molekulární substrát genetického kódu a nazval ji nuclein. Na buněčný extrakt působil pepsinem Ukázal, že zůstane látka, která 1) Je v jádře buněk 2) Je rozpustná v louhu, né v kyselině 3) Obsahuje fosfor (kromě C, H, O) Dělení buněk (Walther Flemming, 1882) Buňka před dělením Walther Flemming: první pozoroval dělení buněk, zavedl pojem mitóza a chromatin Mitotické chromosomy Chromosom Centro mera Interfázní buňka Mendel: zákony dědičnosti (1866) Křížení vlastností v potomstvuJ. G. Mendel Dvojice alel genů kontrolují dědičnost znaků Interakce dvou alel vede k expresi pouze jedné z nich Dominantní alela (DA) – exprimuje se vždy Recesivní alela (RA) – není exprimována v přítomnosti DA Boveri První představy o struktuře genomu Dlouhou dobu se vědci domnívali, že nukleová kyselina v jádře buňky je rozprostřena náhodně všude se stejnou pravděpodobností. Pozorování mitotických chromosomů však vedlo již koncem 19. století některé badatele k závěru, že také v interfázi si mohou chromosomy uchovat svou identitu (genetickou a strukturální) (Rabl 1885, Boveri 1888). Theodor Boveri: dědičnost je vázána na chromosomy (1887), po znovuobjevení Mendlových zákonů Hugo de Vriesem (1900) pokračuje ve výzkumu dědičnosti. Geny jsou na chromosomech (Thomas Hunt Morgan, 1910) -v roce 1910 objevil pohlavně vázanou dědičnost, činí závěr, že gen „white“ se nachází na pohlavním chromosomu -v roce 1913 objevil „crossing over“ a „linkage“ mezi geny -ukázal, že geny se nacházejí v určitých místech na chromosomech, sestavil se studenty první chromosomovou mapu. Genetický materiál lze přenést do jiných buněk jako neživou látku (Griffith, 1928) Myš, které je injikován S-kmen Pneumococcus umírá Myš, které je injikován R-kmen přežívá. Extrakt z S-kmene (buňky nedají kolonie) transformuje R-kmen na virulentní S-kmen DNA je genetický materiál (Avery et al., 1944) Avery, MacLeod, and McCarty, 1944, vyčistili extrakt S-kmene, aby bylo možné lépe charakterizovat transformaci. •Extrakt byl rezistentní k proteázam, neobsahoval lipidy a uhlovodíky •Jestliže byla DNA v extraktu zničena, transformace nenastala •Čistá DNA izolované z S-kmene transformovala R- kmen •Avery opatrně naznačil, že genetickým materiálem je DNA Primární a sekundární struktura DNA Dvojice bazí Řetězec fosfát-cukr Watson a Crick, 1953 – struktura DNA, DNA kód Nukleosom Nukleosomové jádro (oktamerní komplex histonů) H1 histon 6 nm DNA Roger Kornberg, 1974 Histony (H2A a H2B) a (H3 a H4) tvoří dimery, ty tvoří tetramery a dohromady pak vzniká oktamer Chromosomová teritoria (CT) První experimenty, které vedly k závěru, že chromosomy se nacházejí v jádře v podobě ohraničených domén, byly pokusy T. Cremera v létech 1982-1984. Zavedení FISH podstatně urychlilo poznání chromosomů jak v mitóze, tak v interfázi. Principle of fluorescence microscopy (filters are most important) Excitation filter, (blue colour, 450-490 nm ) Emission filter, (set to green 520-560 nm ) Dichroic mirror, reflects the light under 510 nm transmitts the light above 510 nm Source of light Ocular ObjectivePreparation Principle of confocal microscopy LSCM microscope laser sample scanning mirrors pinhole detector (PMT) Fluorescenční in situ Hybridizace (FISH) A C T G A T T G A C T A A C T G A T Chromosomová DNA Denaturace A C T G A T T G A C T A DNA proba (sonda) Hybridizace T G A C T A A C T G A T Druhy sond pro FISH a) Sondy specifické pro určité geny (sekvence) b) Sondy specifické pro repretitivní sekvence v okolí centromer c) Sondy specifické pro telomery d) "Paintingové" sondy pro celé chromosomy Princip DNA microarrays Obarvená RNA se váže k malému spotu na sklíčku, kde je komplementární sekvence. Intenzity červené a zelené se snímají skenerem a vyhodnocují. Funkční uspořádání genomu v jádře Chromosom Jadérko Proteinový komplex Jaderné pory Chromatinová vlákna Transkripce