Interakce salmonel se sav ímič
makrofágy in vitro
Jaroslav Juráček
Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Hudcova 70, Brno
Vedoucí bakalářské práce: Doc. RNDr. Ivan Rychlík, Ph.D.
Izolace a kultivace prasečích alveolárních makrofágů
► z plic zdravých prasat (apikální část)
► zavedení katetru a proplach PBS
► centrifugace (12 000 g, 10 min)
► DMEM medium (2 % prasečího séra, obsah antibiotik)
► vysetí na 24-jamkovou kultivační desku v hustotě 2 x 105
► po 2 hodinách koncentrace séra zvýšena na 10 %
► kultivace přes noc
► výměna media za DMEM medium bez obsahu antibiotik
Infikace makrofágů salmonelou
► kultivace bakterií v LB mediu 6 h při 37° C
► multiplicita infekce nastavena na 5
► po 1 h gentamicin o baktericidní koncentraci (100 μg/ml)
► po další hodině gentamicin o bakteriostatické koncentraci
(15 μg/ml)
► interakce ukončena po 4 a 24 hodinách
Cytotoxicita salmonel
► stanovení LDH v mediu
► CytoTox 96R Non-Radioactive Cytotoxicity Assay
(Promega, USA)
Invazivita salmonel
► stanovení počtu intracelulárních salmonel
► 20 min lyzace (TritonX-100)
► sériové rozředění a vysetí na LB agar (kult. 24 h při 37° C)
► přepočet na počet bakterií
Izolace RNA
► RNeasy Mini Kit (Qiagen, Německo)
Reverzní transkripce
► M-MLV Reverse Transcriptase (200 U, Invitrogen, USA)
► oligo-dT primery
Kvantitativní real-time PCR
► QuantiTect SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Německo)
► genově specifické primery
► LightCycler 480 (Roche, Basilej, Švycarsko)
► exprese genů GM-CSF, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, IL-12α,
IL-12β, IL-18, IL-23α, TGF-β, iNOS, p47phox , SOD
a Nramp1
► house keeping gen HPRT
VÝSLEDKY
Cytotoxicita salmonel
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
SE SE ∆SPI1 STM STM ∆SPI1 neinf.
A490
Invazivita salmonel
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
WT sipA SPI-1 hilA sipB
Početintracelulárníchbuněk
Infekce STM a ΔSPI1 muatntem
Infekce SE a ΔSPI1 mutantem
Infekce SE a jejími ΔSPI1, hilA, sipA
a sipB mutanty
IL-1β
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i. WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i.
4 h 24 h
expresegenůvnásobcíchHPRT
IL-8
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i. WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i.
4 h 24 h
expresegenůvnásobcíchHPRT
TNF-α
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i. WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i.
4 h 24 h
expresegenůvnásobcíchHPRT
IL-23α
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i. WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i.
4 h 24 h
expresegenůvnásobcíchHPRT
IL-12β
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0,4000
WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i. WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i.
4 h 24 h
expresegenůvnásobcíchHPRT
GM-CSF
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i. WT sipA SPI-1 hilA sipB n.i.
4 h 24 h
expresegenůvnásobcíchHPRT
ZÁVĚR
► objasněné funkce SPI-1 : invaze do buněk
pyroptóza makrofágů (sipB)
► nově objevená funkce SPI-1 :
POTLAČENÍ CYTOKINOVÉ ODPOVĚDI MAKROFÁGŮ
► gen sipB hraje klíčovou roli u tohoto procesu
Děkuji za pozornost.