1 Petr TPetr Tááborskýborský Masarykova UniverzitaMasarykova Univerzita PPřříírodovrodověědeckdeckáá FakultaFakulta ÚÚstav Chemiestav Chemie 5. dubna 2012 F9600 Spektroskopické studium biopolymerů Luminiscence 2 Doporučená literatura Knihy: A. Sharma, S. G. Schulman - Introduction to Fluorescence Spectroscopy J. R. Lakowicz - Principles of Fluorescence Spectroscopy B. Valeur - Molecular Fluorescence: Principles and Applications Časopisy: Journal of Fluorescence http://www.springerlink.com/content/1573-4994/ Journal of Luminescence http://www.elsevier.com/wps/find/journaldescription.cws_home/505700/de scription#description Luminescence: The Journal of Biological and Chemical http://www.wiley.com/bw/journal.asp?ref=1522-7235&site=1) Internet: http://www.fluorescence-foundation.org 3 Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace • fotoluminiscencefotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla •• chemiluminiscencechemiluminiscence a bioluminiscencebioluminiscence - zdrojem energie je chemická, nebo biochemická reakce •• elektroluminiscenceelektroluminiscence – zdrojem je el. proud • katodoluminiscence – zdrojem je proud elektronů •• thermoluminiscencethermoluminiscence •• radioluminiscenceradioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření •• mechanoluminiscencemechanoluminiscence – zdrojem je mechanická energie (triboL, piezoL, atd.) •• krystaloluminiscencekrystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí • další zdroje (sonoluminiscence, atd.) 4 v=3 v=2 v=1 v=0 S0 S2 S1 T1 ______ radiační přechody (s účastí fotonu) ............ neradiační přechody (bez účastí fotonu) absorpce absorpce vibrační relaxace fosforescence přechod mezi systémyvnitřní konverze fluorescence Jablonského diagram 5 Vnitřní konverze Obecně jde o přechod mezi nejnižší excitovanou hladinou (S1) na nejvyšší vibrační hladinou nejnižší singletové hladiny (S0). a) vibrační hladiny S0 sahají až k vibračním hladinám S1. Elektron se tak může přejít mezi S1 a S0 bez toho, aby se výrazně změnila jeho energie. b) vibrační hladiny S0 a S1 jsou blízko sebe a za jistých okolností může elektron přejít díky tunelovému efektu. Pravděpodobnost tohoto děje se zvyšuje se zmenšením vzdáleností mezi hladinami. S1 S0 S1 S0 6 • molekuly mají v základním a v excitovaném stavu obecně různé dipólové momenty i polarizovatelnosti (je to způsobeno elektrostatickými interakcemi s okolím molekuly – např. solvatací) • okamžitě po absorpci není excitovaná molekula v rovnovážném stavu a do rovnovážného stavu se dostane až dojde k vyrovnání sil, které na ní působí • doba potřebná pro molekulární relaxace je mnohem delší, než je rychlost elektronového přechodu, ale obvykle kratší, než doba života excitovaného stavu • emisi dochází ze stavu, kdy již bylo dosaženo rovnovážné konfigurace • okamžitě po vyzáření světla se molekula nachází v nerovnovážném stavu → vibrační relaxace na základní hladině Franck-Condonův princip 7 Absorpce Fluorescence 1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav 1 2 3 4 8 Zpožděná fluorescence „příznaky“ zpožděné fluorescence: 1. čas vyhasínání tohoto procesu je srovnatelný s časem vyhasínání fosforescence 2. vlnová délka emitovaného záření je stejná jako u fluorescence ? 9 Zpožděná fluorescence T1 S1 S0 fluorescence zpožděná fluorescence fosforescence ∆E (teplo, srážky, atd.) absorpce 10 Princip • jde o termální excitaci molekuly s nejnižší hladiny tripletového stavu zpět na nejnižší hladinu excitovaného singletového stavu (je to reverzibilní mezisystémový přechod (reverse intersystem crossing) mezi T1 a S1) • k fluorescenci dochází po návratu na S1 (proto je vlnová délka je stejná jako u „běžné“ fluorescence) • mezisystémový přechod způsobuje zdržení celého děje (čas vyhasínání je mnohem delší, než u „běžné“ fluorescence) 11 Typy termální excitace • E-typ zpožděné fluorescence – probíhá u pevných vzorků a je doprovázen zahříváním systému, případně statistickou fluktuací elektronů mezi hladinami (jen pokud rozdíl mezi tripletovou hladinou a excitovaným singletem není příliš vysoký). Jedná se o jednofotonovou absorbci a závislost mezi intenzitou emise a intenzitou budícího záření je lineární. Poprvé byl tento jev pozorován u eosinu (E-typ). • P-typ zpožděné fluorescence – k excitaci dochází po kolizí dvou molekul v tripletovém stavu. Jedna molekula v tripletovém stavu odevzdá nezářivě svoji energii druhé molekule v tripletovém stavu a ta přejde do excitovaného singletu (triplet-triplet annihilation). Rozdíly mezi S1 a T1 mohou být vyšší, než u typu E. Je to dvoufotonová absorbce (excitace dvou molekul), proto je intenzita fluorescenční emise přímo úměrná čtverci intenzity budícího záření. Tento jev byl poprvé pozorován u pyrenu (P-typ). 12 Vliv prostředí na luminiscenci 13 Vliv vnějšího prostředí na fluorescenci • okolní prostředí (rozpouštědlo, pH, atd.) má ve fluorescenční spektroskopii větší vliv na výslednou podobu spekter, než spektrofotometrie (UV-Vis) • větší vliv okolí na molekuly v excitovaném stavu ? 14 Absorpce Fluorescence 1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (závisí na okolí molekuly) 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav 1 2 3 4 15 Vliv rozpouštědla • možnosti interakcí mezi molekulou analytu a rozpouštědla: dipól-dipól, dipól-indukovaný dipól, vodíkové můstky... • rozpouštědla, která tvoří vodíkové můstky mají vliv na n-π* přechody (tato rozpouštědla se chovají jako velmi slabé Brønstedovy kyseliny a atomy s nevazebnými elektrony jako zásady a částečně přijímají proton) • polarita rozpouštědla nejvíce ovlivňuje π-π* (polární rozpouštědla snižují energii π*) 16 Vliv polárního rozpouštědla http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/jabl onski/solventeffects/index.html 17 Nativní fluorescence proteinů – vliv polarity okolního prostředí 18 Zhášení luminiscence (luminescence quenching) • luminiscenci konkuruje jiný děj, který vede k poklesu intenzity luminiscence • všechny možné procesy zhášení ještě nejsou zcela vysvětleny • dynamické (někdy též kolizní) a statické zhášení 19 Dynamické zhášení luminiscence • k interakci mezi zhášečem a potenciálním fluoroforem dojde po excitaci, kdy excitovaná molekula vytvoří „komplex“ s jinou částicí (molekulou, „species“), který nefluoreskuje – dojde k vytvoření nových hladin a dojde k deexcitaci vnitřní konverzí. Typická je např. tvorba komplexu s kyslíkem rozpuštěným v rozpouštědle (oxidace), I-, Cs+, akrylamidem, atd. F0/F = 1 + KSV [Q] • Stern-Volmerova rovnice: F0 je intenzita fluorescence bez zhášedla, F je intenzita fluorescence se zhášedlem, KSV je Stern-Volmerova zhášecí konstanta, Q je koncentrace zhášedla • dynamické zhášení snižuje τ 20 Dynamické zhášení Zhášení fluorescence fluoresceinu za přítomnosti I- 21 Zhášení luminiscence • statické zhášení: ke „komplexaci“ dochází v základním stavu (vytvoří se nefluoreskující komplex). Luminiscence jsou pak schopny jen disociované molekuly, ale rychlost disociace je malá ve srovnání s se zářivými přechody (zářivé přechody jsou neefektivní). Typický příklad – komplexace těžkým kovem (snížení fluorescence kys. salicylové po komplexaci Fe(III).) F0/F = 1 + Ka[Q] 22 Luminiscence molekuly je charakterizována: emisní spektrum (emisní maximum), excitační spektrum (excitační maximum), Stokesův posun, kvantový výtěžek, čas vyhasínání luminiscence 23 Emisní a excitační spektra emisní spektrum (fluorescenční resp. fosforescenční spektrum): závislost intenzity luminiscence na vlnové délce. Měří se při konstantní λex. excitační (aktivační, „absorpční“) spektrum: závislost absorpce luminoforu (fluoroforu) na vlnové délce. Měří se při konstantní λem. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 450 500 550 600 650 λ [nm] IF Emise Excitace λex, max λem, max Stokesův posun 24 Emisní spektrum 25 Excitační spektrum Excitační a absorpční spektrum mají podobný tvar, jestliže absorbuje pouze ta část molekuly odpovědná také za fluorescenci 26 Emisní a excitační spektra • Stokesův posun: rozdíl mezi emisním a excitačním maximem (v nm) • Kashovo pravidlo: tvar emisního spektra není ovlivněn vlnovou délkou excitace a lze excitovat zářením s kteroukoli vlnovou délkou z excitačního spektra • nejvyšší intenzita luminiscence: excitace vlnovou délkou rovnou excitačnímu maximu • fosforescenční spektra jsou posunuty k vyšším vlnovým délkám, neboť přechod z T1 do S0 je spojen s menším rozdílem energie, než přechod z S1 do S0 27 3D luminiscenční spektra • emisní vs. excitační spektra • emise (resp. excitace) vs. Čas • synchronní sken 28 Zrcadlové pravidlo • emisní a excitační spektra organických látek mají podobný tvar, ale jsou zpravidla zrcadlově obrácené Rhodamin 6G 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 450 500 550 600 650 λ [nm]IF[a.u.] Emise Excitace 29http://en.wikipedia.org 30 Emisní spektra Aditivní pravidlo: fluoreskuje-li po ozáření ve vzorku více nezávislých fluoroforů, výsledná emise je součtem příspěvků emisí těchto látek. Toto pravidlo však platí pouze pro molekuly, které spolu nevyměňují energii... 31 Fluorescence a fosforescence Čas vyhasínání fosforescence – 10-4 až několik s Čas vyhasínání fluorescence – 10-12 až 10-6 Fosforescence: posun emise k vyšším vlnovým délkám 32 Základní vztahy A = c l ε = log (Φo/Φ) (Lambert-Beerův zákon) A – absorbance, c – koncentrace, ε – absorbční koeficient, l – tloušťka kyvety, Φo - záření vyslané na vzorek, Φ - záření prošlé vzorkem F = k φ Φo (1-10-clε) F – fluorescenční signál (fotony/s), k – podíl emitovaných fotonů, které dorazí na detektor, φ – výtěžek luminiscence F = k φ Φo 2.3 c l ε zjednodušený vztah pro nízké koncentrace 33 „Čas života“ (lifetime) fluoroforu • nestudujeme jednu molekulu s fluoroforem, ale mnoho molekul s populací elektronů na excitovaných hladinách • na základě studia systému z mnoha molekulami určujeme „čas života“ určité molekuly s fluoroforem dn*/dt = -n* Q + f(t) n* je počet excitovaných částic, t je čas, Q je rychlostní konstanta emise fluorescence, f(t) je časová jednotka (čas excitace) 34 • jestliže k excitaci dojde v čase t = 0, pak: dn*/dt = -n* k pro počet excitovaných molekul lze rovnici zapsat takto: n*(t) = n*(0) exp k t jestliže: τ = k -1 pak: n*(t)/n*(0) = e - t/τ τ je tedy čas, kdy 1/e molekul (36.8%) je v základním stavu 35 Čas života luminiscence křivka vyhasínání má pro stejné „species“ exponenciální průběh n*(t)/n*(0) = e - t/τ 36 • obecná definice: φ = kf / (kf + ki + kx) kf rychlost emisního procesu (fluorescence) ki rychlost nezářivých přechodů (teplo, relaxace...) kx rychlost mezisystémových přechodů - jestliže rychlost deaktivačních procesů je pomalá ve srovnání s kf potom kvantový výtěžek je vysoký • kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs = Iem/Iabs = Iem/(I0-I) • energitcký výtěžek: φe = Eem/Eabs = hνem/hνex Výtěžek luminiscence φe<φk (Stokesův posun) 37 38 Stanovení kvantového výtěžku 1) absolutní stanovení (primární metody) • chemický aktinometr • kalorimetrie • kalibrované zdroje záření, korekce spekter, integrační koule atd. 2) relativní stanovení (sekundární metody) • srovnání s fluorescenčním standardem 39 Chemický aktinometr • roztok šťavelanu železitého absorbuje všechno záření o vlnové délce menší než 490nm • absorbované záření se velikou účinností redukuje Fe(III) na Fe(II) • titračně lze určit kolik Fe(III) se přeměnilo na Fe(II) a následně spočítat kolik fotonů prošlo systémem • uspořádání chemického aktinometru pro určení kvantového výtěžku: kyveta se vzorkem je obklopena aktinometrickým roztokem, kromě malého okénka, které propustí do vzorku excitační záření. Emitované záření je pak zachyceno do aktinometrického roztoku. Stanovení kvantového výtěžku 40 41 Stanovení kvantového výtěžku kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs • pro stanovení kvantových výtěžků používáme fluorescenční standardy (tj. látky s definovaným kvantovým výtěžkem) • potřebujeme znát molární absorpční koeficienty (nebo hodnoty absorbancí při stejné koncentraci) stanovované látky i standardu pro vlnovou délku excitačního záření • změříme a porovnáme plochy (F) emisních spekter • pro různá rozpouštědla je třeba počítat s indexem lomu (voda/ethanol ≈ 5 %, voda/DMSO ≈ 20 %, atd.) Fx Fst x εst εx φ φx = st nx 2 nst 2 x 42 Stanovení kvantového výtěžku - problémy • vnitřně filtrační efekt (samoabsorpce) • různá citlivost detektoru pro různé vlnové délky • proměnlivá intenzita excitačního zdroje • korekce na refrakční index • polarizační efekt • nečistoty ve standardech • rozptyly (Raman, Tyndal) 43 Luminiscence a struktura látek 44 Typy přechodů Přechod σ - σ* : jednoduché vazby (např. C-C, nebo C-H), vyžadují velikou energii (méně než 190nm, vakuová oblast) Přechod n - σ* : nutná přítomnost atomu s volným elektronovým párem (N, S, I, Cl, Br), absorpce kolem 200nm. Přechod π – π*: sloučeniny s dvojnými a trojnými vazbami, čím lepší konjugance vazeb, tím vyšší vlnová délka (energetická hladina nejvyššího obsazeného vazebného orbital se zvýší a energetická hladina nejnižšího nevazebného orbitalu se sníží → nižší ∆E), delokalizované π orbitaly aromatických systémů → rozdíl energií je nízký (absorpce ve Vis oblasti) n – π*: v molekule je kromě dvojné vazby přítomen také atom s volným elektronovým párem (N, S, Cl...), nízká energie, ovlivnění π – π* přechodu 45 Typy přechodů – org. látky E σ π n π * σ * hladiny energií molekulových orbitalů 46 Struktura organických molekul a luminiscence – základní pravidla 1. luminiscenci většinou nepozorujeme u uhlovodíků bez dvojných vazeb (σ → σ* přechod) 2. luminiscence je vzácná také u nearomatických uhlovodíků s dvojnými vazbami, někdy pozorujeme slabou fluorescenci molekul obsahujících karbonylovou skupinu v UV oblasti (přechod n→π*), nebo u vysoce konjugovaných (ale nearomatických) molekul (vitamín A) 3. většina aromatických uhlovodíku jeví dobrou luminiscenci (π→π* přechod) 47 Základní pravidla 4. Aromatické systémy s přechody n→π* zvyšují intensitu fluorescence (molekuly obsahují atomy s nevazebnými elektrony – N, O, S). U jednoduchých molekul obsahujících karbonylovou skupinu (např. benzofenony), nebo heteroatomy (pyrimidin, pyrazin) je často pozorována i fosforescence. 5. Skupiny připojené na aromatické jádro často silně ovlivňují fluorescenční vlastnosti molekuly. Tyto skupiny mohou měnit polohu nejnižší vibrační hladiny excitovaného stavu (týká se to jak n→π*, tak i π→π* přechodů) – viz. tabulka. 48 -zvýšeníkyano zvýšenízvýšeníamino -sníženísulfhyrylová -nepatrnýsulfonová zvýšenínepatrnýalkyl zvýšenízvýšeníhydroxo, methoxo zvýšenísníženíX zvýšenísníženíNitro, nitroso velké zvýšenívelké sníženíKarboxylová, keto vliv na ΦPvliv na ΦFskupina 49 O OO- COO- OO- COOFluorescein (výborné fluorescenční vlastnosti) Fenolftalein (barevný, ale nefluoreskující indikátor) 6. molekuly s planární a rigidní strukturou mají vyšší kvantový výtěžek, než molekuly s velkým stupněm volnosti (konjugace takových systémů je vyšší, interakce se solventem je nižší (fluorescein x fenolftalein, různá fluorescence isomerů též molekuly). 50 6. jestliže je na aromatickém jádře halový prvek můžeme pozorovat tzv. efekt těžkého atomu: přítomnost těžkého prvku zvyšuje pravděpodobnost přechodu na S0 → T1, což má vliv na zvýšení ΦP. 7. jestliže jsou aromatická jádra téže molekuly oddělena alkyovou skupinou je systém slabě, nebo vůbec konjugován (menší kvantový výtěžek, nižší vlnová délka emise). 51 0.60 0.46 0.29 0.11 ΦF ΦPλemλexNázevVzorec 480 400 321 278 -390Naftacén <0.01365Antracén 0.1286Nafatlén 0.26205Benzén Luminiscence a struktura přechod π→ π* čím více je v molekule konjugovaných vazeb, tím vyšší má emitované záření vlnovou délku 52 Luminiscence organických molekul: ukázky 53 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470 λ [λ [λ [λ [nm] IF[a.u.] Trp Tyr Phe 0 7.0 0.04282200257Fenylalanin (Phe) 0.143031,400274Tyrosin (Tyr) 0.203485,600280Tryptofán (Trp) Kvantový výtěžek Vln.délka (nm) Abs. koeficient Vln.délka (nm) Aminokyselina FluorescenceAbsorpce 1. P. Pekárková, Bakalářská práce, 2005 2. www.biotek.com 54 Chinin emisní maximum: 446 nm excitační maximum: 349 nm Stokesův posun: 97 nm 55 Deriváty fluoresceinu excitační maximum: 494 nm emisní maximum: 520 nm 56 Deriváty rhodaminu 0 1 2 3 4 5 550 600 650 700 750 Vlnová délka [nm] IF 57 Fluorofory s emisním maximem v oblasti kolem 600nm 58 Anorganická luminiscence Základní typy přechodů - komplexy • Metal Centered (MC) • Ligand Centered (LC) • Ligand to Metal Charge Transfer (LMCT) • Metal to Ligand Charge Transfer (MLCT) • Ligand to Ligand Charge Transfer (LLCT) • Metal to Metal Charge Transfer (MMCT) • Intraligand Charge Transfer (ILCT) 59 Místnost s fosforeskujícím nátěrem na hradě Špilberk 60 Excimery a exciplexy • excimer (excitovaný dimer) se tvoří, jestliže spolu reagují dvě excitované částice • jestliže se jedná o dvě různé excitované „species“, tak vzniká exciplex 61 Excimery a exciplexy 62 • zářivá deexcitace excimeru (fluorescence) • nezářivá deexcitace • excimer reaguje s jinou molekulou (např. Diels-Alderova reakce) Excimery a exciplexy 63 Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii 64 Luminiscenční analýza Kvantitativní analýza: F = k φ Φo 2.3 c l ε Vysoká citlivost metody: • použití laserů • odezva na relativně malé změny v okolí 65 Luminiscenční stanovení • nativní luminiscence • tvorba luminiscenčních komplexů • luminiscenční značky • luminiscenční sondy • propojení s dalšími metodami 66 Vnitřní a vnější luminiscence • vnitřní/intrinsic (nativní luminiscence) – molekuly lze stanovit bez výrazného zásahu do sledovaného systému, zpravidla aromatické látké • vnější/extrinsic luminiscence – do sledovaného systému přidáme fluoreskující činidlo(barvivo), jehož fluorescence bude závislá na koncentraci analytu, případně se na něj naváže 67 Nativní luminiscence 68 470325retinol 420348calciferol 305275cyanocobalamin 515470nicotineamids 510400 a 475GFP 565370 a 440riboflavin 3723163-hydroxocoumarin 309258uracil 313267cytosine 390272adenosine 380265purine 303270caffeine 548352 a 432berberine 347315papaverine 448347quinine 365325LSD 330-350270-290indole group λem max (nm)λex max (nm)sloučenina 69 Peptidy, proteiny, AK 70 Stanovení aminokyselin www.biotek.com 71 Stanovení aminokyselin www.biotek.com 72 Stanovení proteinů www.biotek.com 73 Nativní fluorescence proteinů – vliv polarity okolního prostředí 74 Stanovení anorganických iontů Ln3+1,10 - fenntrolin Cd2+2-(o-hydroxyfenyl) benzoaxazol Al3+, Be2+, In3+, Hf(IV), Th(IV), Sc3+, Ca2+, Mg2+, Sn(IV), Y3+ Různá azobarviva B4O7 2-, Zn2+Benzoin Zr2+, Sn4+Flavonal Al3+, Be2+, Zn2+ , Li+, Mg2+ a další 8-hydroxychinolin Iont kovuIont kovuKomplexujKomplexujííccíí ččinidloinidlo 75 Fluorescenční značky a sondy • fluorescenční značky (fluorescent labels) jsou vnější (extrinsic fluorescence) fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám (proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou • fluorescenční sondy (fluorescent probes) jsou vnější fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. 76 Derivatizace fluoroforem Rhodamine B (c =1x10-12 mol.l-1) Rhodamin B (c =1x10-12 mol.l-1) Vnitřní (nativní) x vnější luminiscence luminiscenční značky a sondy Molekuly bez vlastní (vnitřní, nativní, přirozené) luminiscence lze derivatizovat luminiscenčními značkami Omezení: lze detekovat i jednotlivé molekuly („single molecule detection“) obsahující silné luminofory, problém je jejich navázání na analyt... 77 Výběr fluorescenčních značek kritéria pro výběr: spektrální vlastnosti (excitace, emise, kvantový výtěžek atd.) vazebné místo (-NH2, -SH skupina a další) podmínky reakce (pH, koncentrace...) hydrofobicita 78 Výběr luminiscenčního barviva – spektrální vlastnosti 79 Výběr luminiscenčního barviva – spektrální vlastnosti RBITC 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 450 500 550 600 650 λ [nm] IF[a.u.] Emise Excitace O OH O N + NCH3 CH3 CH3 CH3 N S N S Cl - 80 Výběr fluorescenčních barviv 81 Fluorescenční značky – vazebná místa amino-reaktivní značky sukcinimidyl estery (Rh6GSE) sulfonyl chloridy isothiokyanáty (FITC, RBITC) 82 Fluorescenční značky – vazebná místa thiol-reaktivní značky 83 Fluorescenční metody v imunoanalýze Imunoanalytické metody: • dříve hlavně tvorba precipitátu • dnes značené hlavně různým způsobem značené reaktanty (antigeny a protilátky) • radiometricky, enzymaticky, fluorescenčně (luminiscenčně) značené reaktanty • enzymové metody mohou mít luminiscenční detekci 84 Fluorescenční imunoanalýza (FIA) • poprvé použity v roce 1964 • často ovlivněna fluorescencí matrice a samotného vzorku • může být použita i TR-FIA (Time Resolved Fluorescence Immuno Assay). Tato metoda využívá jako značek chelátů s lanthanitých kationtů (Eu3+, Tb3+, Sm3+ a dalších) • FIA lze provádět v homogenním i heterogenním prostředí, v kompetitivním i nekompetitivním uspořádání Ab +