Plotnová metoda
Cíl: zisk řady ředění a vysetí na misky → nezkreslené
info o počtu životaschopných MO
Přímé stanovení (preparát, komůrka)
X
nepřímé stanovení (kultivace)
• Počet buněk je důležitý pro srovnání, pro opakování
experimentu atd., nefelometrické stanovení.
• CFU / ml = počet buněk tvořících kolonii = ŽIVÝCH,
KULTIVOVATELNÝCH není to celkový počet
buněk v 1 ml
→ kolonie rozizolovat, aby šly spočítat (rozetření)
• rozlišení mrtvých a živých buněk – vitální test
• Kultivace – 1 médium – známý vzorek, selektivní médium – zajímá
nás jen něco
• Více médií – neznámý vzorek
• Lze i smíšená kultura (vzorek vody)
• Odběry po cca 20-40 min → růstová křivka
• Grafickým vynesením logaritmu počtu živých buněk stanovených ve
vzorcích odebraných v časových intervalech vzniká růstová křivka.
• 1 – lag fáze; 2 – fáze zrychlujícího se růstu; 3 – exponenciální fáze
růstu; 4 – fáze zpomaleného růstu; 5 – stacionární fáze růstu; 6 –
fáze odumírání
• Automatické počítání kolonií:
• Stěrová a výplachová metoda
• Rychlé určení kontaminace - luminiscenční měření pomocí přístroje
Lumitester PD 10 (jednotky RLU)
• Celkový stupeň kontaminace
bez rozlišení druhů MO
Postup
PRACUJEME ASEPTICKY, POPSAT SKLO NA VÍČKO
• Kontrola sterility – vysetí 100 µl fyziologického roztoku
• Do zkumavek pipetovat 0,9 ml fosfátového pufru
• Z narostlé a promíchané kultury odebrat 100 µl, dát do
zkumavky, promíchat → až na konec ředící řady
• Ze tří nejnižších ředění vyset na misky 100 µl, na misce
rozetřít hokejkou
• Hodnocení – příští týden (kultivace v termostatu cca 2 dny, do
cvičení misky zůstanou při pokojové teplotě)