Protokol č. 7 Pozorování živých a mrtvých buněk kvasinek Vitální test Cíl cvičení: Bude se jednat o přímé nebo nepřímé stanovení počtu buněk? Stanovujeme počet živých nebo mrtvých buněk? Jak odlišíme živé a mrtvé buňky? Vztahujeme ke známému objemu? Účinek které fyzikální veličiny bude sledován? Jakým způsobem? K čemu slouží časové intervaly? Teoretická část: Seznámili jsme se již s nepřímým stanovením počtu buněk plotnovou metodou. Zdlouhavá, ale přesná plotnová metoda umožňuje spočítat pouze počet živých buněk – CFU/ml (colony forming units); domluvou bylo stanoveno, že každá z buněk vytváří jednu kolonii. V tomto cvičení se seznámíme s metodou přímého počítání buněk vitálním testem = barvením nativního preparátu, která nám umožní rozlišit a spočítat živé a mrtvé buňky a tím zjistit okamžitý stav populace sledovaných buněk. Test je založen na propustnosti membrány mrtvých buněk: cytoplazmatická membrána u mrtvých buněk není semipermeabilní, barvivo se dostává dovnitř. Živé buňky se průniku barviva „brání“ svými kanálky v membráně; nepropustí jej tedy nebo jej odbourají. K barvení se využívá netoxických barviv. Roztok methylenové modři je zředěný a pufrovaný fosfátem s pH = 4,6. Takto můžeme sledovat například působení zvýšené teploty na přežívání buněk a vitálním testem (nabarvením mrtvých buněk) sledovat úbytek živých buněk v určitých časových intervalech.Výhodou je rychlost, nízká spotřeba materiálu oproti metodě plotnové a možnost rozlišení poměru živých a mrtvých buněk. Nevýhodou je, že buňky již dál nelze kultivovat. Proč určovat procento přežívajících buněk? Vitální test má v praxi značný význam při kontrole životaschopnosti mikroorganismů během technologického procesu. Sledujeme jejich odpověď (změnu počtu) na přídavek či úbytek různých látek či na fyzikální proces. Z výsledků testu vitality lze okamžitě rozhodovat o zasažení do technologického procesu během kultivace buněk. Počet buněk stanovujeme např. v Bürkerově nebo Thomově komůrce, což je skleněná destička podložního skla s počítací mřížkou. Prostor mezi podložním a krycím sklíčkem má u různých komůrek různou hloubku (např. 0,1mm) a je na komůrce vždy vyznačen. Pracujeme tedy s určitým objemem vzorku. Plocha čtverečku je 0,0025 mm^2. Při hloubce komůrky 0,1 mm je objem nad každým čtverečkem 0,00025 mm^3, čili 1:4000 mm^3. Známe objem vzorku, dopočítáváme většinou do hodnoty 1 ml. Buňky použité ve cvičení patří mezi eukaryontní kvasinkové organismy. Saccharomyces cerevisiae Botanicky je řadíme mezi houby – vzhledem k jejich velikosti mezi mikromycety (mikroskopické houby) spolu s plísněmi. Své české jméno dostaly podle schopnosti zkvašovat mono-, di-, nebo trisacharidy na ethanol a CO[2]. Kvasinky jsou většinou jednobuněčné organismy rozmnožující se pučením nebo dělením. Na pevných médiích tvoří kolonie a askospory. O kvasinkovitých mikroorganismech hovoříme v případě, pokud se kromě jednotlivých pučících buněk vytváří i vlákna (pravé a nepravé hyfy), které zpravidla netvoří vřecka. Většina má nízkou teplotní odolnost; usmrcuje je 2-5 minutové zahřívání na 56 °C, spory jsou nepatrně odolnější. Kvasinky: na agaru tvoří větší kolonie než jsou kolonie bakteriální, Gramovým barvením se barví také, a to G+. - Materiál: - Kvasinková kultura Saccharomyces cerevisiae - sbírková a z pekařského droždí - Erlenmeyerova baňka, zkumavky - Pipety, kapátko - Sterilní destilovaná voda - Vodní lázeň, teploměr - Mikroskop - Bürkerova komůrka - Methylenová modř - Filtrační papír Postup: Ø Připravíme si suspenzi kvasinkových buněk z pekařského droždí ve sterilní destilované vodě v Erlenmeyerově baňce Ø Z ní pipetujeme po 1 ml suspenze do každé ze 4 zkumavek Ø První zkumavka se bude zpracovávat jako startovní vzorek pro zjištění počtu živých buněk při pokojové teplotě při začátku pokusu Ø Ostatní zkumavky umístíme do horké vodní lázně (60 °C) Ø Druhá zkumavka je vytažena po 7 minutách Ø Zchladíme studenou vodou Ø Třetí po 14ti a poslední po 21 minutách Ø Stanovíme počet živých a mrtvých buněk v jednotlivých zkumavkách a to tak, že do prohlubně Bürkerovy komůrky naneseme kapku suspenze a zakryjeme krycím sklem. K okraji krycího sklíčka přikápneme methylenovou modř, na opačné straně ji odsajeme filtračním papírem, až je celý preparát zbarven modře. Ø Ø Po 2 až 5ti minutách se buňky usadí a mrtvé jsou obarveny modře, živé zůstávají nezbarvené, tedy žlutozelené Ø Pozorujeme pod mikroskopem při vhodném zvětšení max 40 x 10 Ø Počítáme živé buňky a mrtvé namodralé buňky v deseti čtverečcích Ø Buňky ležící na levé a spodní straně do počtu zahrnujeme, na pravé a horní straně ne Ø Postup opakujeme pro suspenze kvasinek v jednotlivývh časových intervalech pro každou zkumavku Ø Zjistíme tak narůstající počet mrtvých nabarvených buněk Ø Počet buněk musíme stanovit pro 1 mm^3 a z toho následně pro 1 ml!! Ø Sestrojíme graf závislost přežívajících kvasinkových buněk na délce doby vystavení zvýšené teplotě Nákres: čtvereček Bürkerovy komůrky, rozdělený na další, s jednotlivými údaji dopočtu do 1ml: Vyhodnocení: 1) Tabulka Čas (min) Počet živých b. V 10ti čtvercích Počet mrtvých b. V 10ti čtvercích Součet živých a mrtvých buněk v 10ti čtvercích Procento přežívajících buněk 0 5 10 15 2) Výpočet celkového počtu buněk v 1 ml vzorku v čase 0 minut - vycházíme z 1 mm^3 , údaj pak vynásobíme 1000 pro hodnotu v 1 ml - k 1 mm^3 se dopracujeme ze součtu všech buněk (živých i mrtvých) z 10-ti počítaných čtverečků (pro dostatečný průměr) a vyděleno tímto počtem 10ti čtverečků. Toto číslo následně násobíme 250ti (abychom se dostali k objemu nad čtverečkem a převedli tak mm^2 na mm^3) a následně násobíme 1000 (tak získáme 1ml). N v deseti čtverečcích = součet buněk živých a mrtvých ve všech čtvercích Počítá se deset čtverečků, aby byla dostatečná hodnota pro průměrný počet buněk ve čtverečku jednom. Z toho N v 1 mm^3^ = součet buněk živých a mrtvých / 10 x 250 (celkový počet z deseti čtverečků dělíme deseti a násobíme objemem; to platí, pokud počítáme z velké plošky; z nejmenší by se násobilo 4000; v násobení je tedy již zahrnuta hloubka 0,1 mm) N v 1 ml: součet buněk živých a mrtvých / 10 x 250 x 1000 My jsme do zkumavky pipetovali 1ml, nenásobíme tedy žádným dalším ředěním. Příklad: Čas (min) Počet živých b. V 10ti čtvercích Počet mrtvých b. V 10ti čtvercích Součet živých a mrtvých buněk v 10ti čtvercích Procento mrtvých buněk 0 189 34 223 15,25 5 448 59 507 11,64 10 365 11 476 23,32 15 413 239 652 63,34 Výpočet celkového počtu buněk v čase 0 minut a) N[ ]v 1ml v čase 0: 223/10 . 250 . 1000 = ....... buněk v 1 ml 3) Vitální test Graf závislosti počtu mrtvých kvasinkových buněk na době jejich vystavení zvýšené teplotě - osa y: čas (minuty) - osa x: % mrtvých buněk (nebo živých buněk) - v každém čase je potřeba sečíst počty živých a mrtvých buněk a vypočítat, kolik % tvoří mrtvé buňky z celkového počtu - vypočítáme tak pro všechny časové intervaly. Př: Graf závislosti (vytvoříte v excelu) počtu mrtvých (nebo živých) kvasinkových buněk na době jejich vystavení zvýšené teplotě (60°C, intervaly 0, 5, 10 a 15 minut): % mrtvých buněk Závěr: Docházelo k plynulému úbytku buněk? Byly dobře rozeznatelné mrtvé a živé buňky?