Zkouška inhibice růstu řas VYPRACOVALI TEREZA DVOŘÁKOVÁ JINDŘICH ŠMÍD ČSN EN 28692: Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas Scenedesmus subspicatus a Senastrum capricornutum NAŘÍZENI KOMISE (ES) č. 440/2008: sekce C.3. Zkouška inhibice růstu řas Cíl: stanovit účinky látky na růst jednobuněčných zelených řas Podstata zkoušky: Exponenciálně rostoucí kultury vybraných zelených řas jsou po několik generací vystaveny za definovaných podmínek různým koncentracím zkoušené látky. Kultivace 72 hodin Měření hustoty buněk minimálně každých 24 hodin Limitní zkouška ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Neprovádí se • Koncentrace 100 mg/l nebo odpovídající rozpustnosti látky • Cíl: prokázat, že EC50 je vyšší než tato koncentrace • Minimálně 3x se stejným počtem kontrol • Stanovení biomasy i růstové rychlosti • Pokles oproti kontrole 0 25 % a více —> provedení úplné zkoušky Testovací organismy ČSN EN 28692 z? NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Doporučené organismy: 0 Selenastrum capricornutum, napr. 86.81 SAG,ATCC 22662, nebo CCAP 278/4 0 Scenedesmus subspicatus, napr. 86.81 SAG,ATCC 22662, nebo CCAP278/4 • Rychle rostoucí druhy, přednostně: 0 Selenastrum capricornutum, např. ATCC22662, nebo CCAP 278/4, 0 Scenedesmus subspicatus, např. 86.81 SAG. • Jiné musí být uvedeny ve zprávě ČSN EN 28692 Kvalitní destilovaná nebo deionizovaná Destilační přístroj bez medených časti 4 zásobní roztoky NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 Kvalitní destilovaná nebo deionizovaná voda s vodivostí menší než 5 jliS/ cm Destilační přístroj bez medených časti 4 zásobní roztoky Sterilizace membránovou filtrací nebo v autoklávu pH přibližně 8 Zásobní roztoky ________________n__________________ Tuhtilka 1 - Zásobní roiíoky živili divina Koncentrace v zásobním roztoku Konečná koncentrace ve tktnišemim roztoku Zásobní roztok. ] makrosložky živín E/" mg/L 1.5 15 MgCJ2Ď>[:0 í.2 12 . ■OiCli.ZHiO 1,8 13 1,5 15 KH:PO, 0,16 1,6 Zásobní rýŕlíík 2 Fí-EDTA mg/l i. Hg/1 FeCJj.6H30 SO 80 Na3EDTA.2H:0 100 100 Zásobní roztok 3 stopoví prvky mg/l IR5 135 Mna2.4H20 415 415 ZriCl2 3 ■i , 3 CoCl2 6H20 1,5 3,5 0,01 0,01 NaiMoOj 2HsO 7 7 Zastihni roztok 4 NaHCOj g/l mg/l 50 50 Kultivační zařízení ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Teplota 23°C ± 2°C • Stálé a rovnoměrné osvětlení - 400-700 nm • Intenzita 60-120 uE* m-2/so(35- 70 x 1018 fotonů m_2/s) při měření v rozsahu 400-700 nm • 6 000-10 000 lx • Teplota 21-25°C ± 2°C • Stálé a rovnoměrné osvětlení - 400-700 nm • Intenzita 60-120 uE-m"2/so(35- 70 x 1018 fotonů m_2/s) při měření v rozsahu 400-700 nm • 6 000-10 000 lx ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 Zásobní roztoky: příprava rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo kvalitní destilované Sterilizace zásobních roztoků přes membránový filtr (0,2 |um), nebo v autoklávu při 120°Cpo 15 minut Úprava pH (při jeho výrazných změnách) na pH ředící vody pomocí H Cl a NaOH Zásobní roztoky: příprava rozpuštěním látky v deionizované vodě nebo kvalitní destilované s vodivostí menší než 5 |iS/cm KoncentracejDomočných látek (org. rozpouštědla, emulgátory, dispergátory) minimální, ne víc než 100 mg/l média Úprava pH (při jeho výrazných změnách) na pH ředící vody pomocí H Cl a NaOH Měření hustoty ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Prijjiepopjtaiii pomoci 3QČita& častíc, netjp , Tiikrpskopem s počítací komůrkou • Nepřímé počítání za v předpokladu dostatečné citlivosti (10000 buněk na 1 ml) a prokázané dobré korelaci s hustotou buněk, mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie, spektrofotometrie) • Přímé počítání živých buněk, např. pod mikroskopem s počítacími komůrkami • Za předpokladu dostatečné citlivosti a prokázané dobré korelace s buněčnou hustotou mohou být použity i jiné postupy (fotometrie, turbidimetrie...) Zkušební postup ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Orientační zkoušky —> koncentrační rozmezí • Objem in oku la by měl být takový, aby hustota buněk byla cca 10 4 buněk/ ml • Koncentrační řada by měla obsahovat 4-5 koncentrací od 10-90% inhibice růstu • Orientační zkoušky —> koncentrační rozmezí • Počáteční hustota: cca 10 4 buněk/ml • Geometrická řada nejméně 5 koncentrací 0 Nejnižší žádný pozorovatelný činek 0 Nejvyšší omezení růstu nejméně 0 50 % Zkušební postup ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • 3 opakování pro každou koncentraci • 6 stejných kontrolních vzorků bez látky • 3 opakování pro každou koncentraci • 3 kontroly bez látky • 3 kontroly s pomocnou látkou Provedení zkoušky ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Přidání zkoušené látky k prekultuře řas • V kultivačním zařízení třepání, míchání nebo probublávání • Stanovení hustoty po 24, 48 a 72 hodinách • Měření pH na začátku a po 72 hodinách, nemá se měnit 0 víc než 1,5 • Přidání zkoušené látky k prekultuře řas • V kultivačním zařízení třepání, míchání nebo probublávání • Stanovení hustoty po 24, 48 a 72 hodinách • Jako blank filtrované médium • Měření pH na začátku a po 72 hodinách, nemá se měnit 0 víc než 1,5 ČSN EN 28692 Pro každou zkoušenou koncentraci a růstový vzorek se sestrojí růstová křivka, v podobě grafu logaritmu střední hodnoty buněk v závislosti na čase. Vypočte se inhibice v procentech o Výpočtem plochy pod růstovou křivkou (integrál biomasy) o Výpočtem růstové rychlosti EC50 se určí sestavením tabulky a sestrojením růstového grafu a od oka proložením přímky NOEC NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 EC50 pro každý čas měření: o Z růstové křivky (hustota buněk x čas) o Z grafu snížení specifické růstové rychlosti proti logaritmu koncentrace NOEC Kritéria jakosti ČSN EN 28692 NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 440/2008 • Hustota buněk v kontrole se zvýši za 3 dny alespoň i6x • pH v kontrole nesmi změnit svoji hodnotu 0 více než 1,5 jednotky • Hustota buněk v kontrole se zvýši za 3 dny alespoň i6x • Koncentrace zkoušené látky nesmí klesnout pod 80 % původní hodnoty Parametry zkoušky se v obou porovnávaných dokumentech výrazně neliší, rozdíly jsou většinou minimální Hlavním rozdíly: o Nařízení komise (ES) č. 440/2008 povoluje před samotnou zkoušku zařadit provedení limitní zkoušky o Liší se kritéria jakosti o Liší se požadavky na koncentrační řadu Děkujeme za pozornost