Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas 1
1
ZkouZkoušška inhibice rka inhibice růůstustu
sladkovodnsladkovodnííchch řřasas
Test ekotoxicity látky podle normy:
ČSN EN 28692
2
Používané druhy řas (inokulum):
Scenedesmus subspicatus
Selenastrum capricornutum
3
Princip
Metoda je založena na sledování inhibičního
efektu zkoumané látky na růst biomasy
sladkovodních planktonních řas.
Jednotlivé řasové kmeny se kultivují po dobu
několika generací v definovaném médiu
roztoku živin, vody a zkoumané látky.
Zkoušená látka je v médiích přítomna v
podobě koncentrační (geometrické) řady.
Doba inkubace testu je minimálně 72 hodin
za konstantních podmínek (Osvětlení,
teplota...)
4
Příprava a průběh testu
Připravíme si sadu zásobních roztoku živin podle
normy.
Nechá se ustanovit kyslíková rovnováha mezi
atmosférou a roztokem. Zkontrolujeme pH (8,3 +-
0,2)
Řasové inokulum se připraví z exponenciálně
rostoucí kultury. Předkultivace trvá 3 dny.
Zásobní roztok živin se smíchá s požadovaným
množstvím deionizované vody a přidá se takový
objem řasové kultury, aby po desetinásobném
zředění vodou byla výsledná hustota buněk 10 000 v
1 ml.
5
Koncentrace zkoušené látky se volí v geometrické
řadě a měla by pokrývat alespoň 4-5 řádů v
rozmezí 10-90% inhibice růstu kultury.
Jako nádobu lze použít Erlenmayerovy baňky.
Koncentrovaný roztok živin by měl tvořit 1/10
celkového objemu roztoku v baňce.
Do některých baněk se nepřidá testovaná látka a
tyto budou použity jako kontrolní varianty.
Každá testovaná koncentrace 3x opakování
Kontrola 6x opakování.
6
Inkubace
Nádoby se inkubují při cca 23°C
Za stálého osvitu bílým světlem dané
intenzity a kvality.
Vlnová délka ideálně 400-700 nm.
Každých 24 hodin se odebere malý
průběžný vzorek a stanoví se počet
buněk v 1 ml vzorku
Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas 2
7
Měření testu
Z baňky se pipetou odebere malý objem
kultury (5ml) a spočítá se obsah buněk.
Vzorek se zpět nevrací.
Pro počítání buněk se používá mikroskop s
počítací komůrkou, počítač částic, nebo se
použijí nepřímé metody detekce
(spektrofotometrie, turbidimetrie,
fluorescence).
Na začátku a konci pokusu se změří pH
všech pokusných variant
8
Interpretace výsledků
Sestavíme tabulku pro koncentrace látky a
konečnou hustotu kultury.
Vypočteme procenta inhibice.
Vytvoříme graf (y= % inhibice, x= koncentrace)
Určíme hodnotu NOEC, EC50, růstovou rychlost a
plochu pod růstovou křivkou.
sestavíme protokol o zkoušce (Zkoušená látka,
organismus, teplota, osvětlení, složení média,
datum počátku a trvání, zkoušené koncentrace,
pH, metoda měření, výsledky měření, vypočítané
inhibice).
9
Možné uspořádání testu:
10
Kritéria platnosti testu:
Hustota buněk u kontrolního vzorku se
musí zvýšit alespoň 16x za 72 hodin
(růstová rychlost 0,9 za den).
Změna pH nesmí být větší než 1,5
jednotky.