20.3.2013
1
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Pavel Čupr
cupr@recetox.muni.cz
Ekotoxikologické biotesty
Testy ekotoxicity s destruenty
2013
Vizitka QR
https://is.muni.cz/el/1431/jaro2013/Bi5620/index.qwarp
20.3. Mikroorganismy - prezentace
ČSN EN ISO 11348-3
Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri
(Zkouška na luminiscenčních bakteriích)
Albrechtová
20.3.2013
2
3
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Správné nasazení testů toxicity
NBEZPEČNOST
Klasifikace
nebezpečných
látek
Chemické
analýzy
Black
box
$
Testy toxicity
Fenol kadmium BaP
………
20.3.2013
3
TEST TOXICITY:
experimentální design
BIOTA (bakterie)
+
KONTAMINANT
vzorek z ŽP
(80 %)
- Testy jsou prováděny v adekvátní ředící řadě!
- Biologický materiál jen ve stejné kvalitě,
- Standardní podmínky testu.
- co nejméně ředit vzorek (80 %) – “falešná nezávadnost”
? EFEKT ?
+ LOEC,
NOEC, EC50, IC50,..
Provedení testu na bakteriích
Testovací kultura
(uchovávání, kultivace)
Vzorek
(odběr, úprava, ředění)
Reakční systém
(optimální podmínky)
Vybraný
parametr
Kvantifikace
(vizuální, instrumentální)
Odpověď
Hodnocení
20.3.2013
4
Provedení testu na bakteriích
Testovaný vzorek Inkubace Odpověď
Hodnocení
Negativní kontrola Inkubace Odpověď
Blank Inkubace Odpověď
Negativní kontrola: vzorek nahrazen rozpouštědlem (!!! Ředící řada!!!
Pozitivní kontrola
Blank: není testovací kultura
vztah "dávka - účinek"
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Intenzita stresu - dávka (koncentrace)
účinek(%)
Převzato z metodického návodu Guidelines for E.R.A. (U.S. EPA 1998).
- Všechny testy toxicity i genotoxicity by měly být aplikovány v experimentech typu „dávkaodpověď“.
Vzhledem k velmi obdobnému tvaru těchto funkčních závislostí pro téměř všechny
navrhované biologické systémy lze vymezit obecné principy hodnocení výstupů.
- Kvantifikované parametry získané z křivek „dávka-odpověď“ doplněné relevantními mírami
variability jsou vstupem do procesu posuzování rizika.
20.3.2013
5
ECHA BIOCIDE Monitor
Impregnace
kultura Bacillus species
indikátorové barvivo
(terzoliového typu)
živné médium
Kontakt se vzorkem
Voda (extrakt) Sediment, pùda, odpad
B ílá R ù ž o v á (te č k o v a n á ) Č e r v e n á
T o x ic k ý M ír n ì to x ic k ý N e to x ic k ý
10 s kontakt se vzorkem
18 - 24 hodin inkubace (dle typu použité bakterie) 35-37 oC
ECHA BIOCIDE Monitor
ECHA Biocide Monitor II.
Organismus Bakterie – rodu Bacillus (G+).
Princip Test je založen na použití malého absorpčního papírku, který je
impregnován testovacím organismem a indikátorovým barvivem
bakteriálního růstu (tetrazoliová sůl). Barvivo se redukuje v závislosti
na koncentraci dehydrogenáz, které produkují přítomné bakterie.
Vyvinutá barva se interpretuje podle přiložené stupnice: toxický vzorek
- bílá, růžová nebo tečkovaná - jako mírně toxický, červená - netoxický,
(Dutka a Gorrie 1989).
Trvání testu Kontakt systému se vzorkem 10 sekund + 18-24 hodinová kultivace až
do vytvoření barvy na proužku s kontrolním vzorkem.
Teplota 35 – 37 o
C.
20.3.2013
6
GIT – růstově inhibiční test (EN ISO 10712, ČSN 75 7730 )
Turbidimetrický test – EN ISO 10712, ČSN 75 7730
Organismus Pseudomonas putida (případně fluorescens) G-.
Princip Principem tohoto testu je kultivace bakteriálního inokula v tekuté živné
půdě se vzorkem. Se zvyšující se rychlostí růstu vzniká intenzivnější
zákal. Průběh testu se sleduje měřením tohoto zákalu turbidimetricky
(Dutka et Kwan, 1982).
18 hodinové bakteriální inokulum se naředí na požadovanou hustotu a
nasazuje se do testovaných vzorků a kontroly ve zkumavkách. Po 16
hodinové kultivaci v termostatu se měří absorbance při 560 nm a
vypočte se % inhibice mikrobiálního růstu ve srovnání s kontrolou.
(Alternativní λ je 650 nm, která je optimální pro Pseudomonas
fluorescens) (Dočkal et Soldán, 1988).
Reakční směs (V) 100 ml dle ČSN, případně nižší.
Předkultivace 18 hodin.
Trvání testu 16 ±1 hodin (6).
Teplota 23 ±1 o
C.
Třepání Urychluje průběh testu (není podmínkou).
Pozitivní kontrola 3, 5 – dichlorfenol.
Aseptická práce Velmi limitující pouze při zakládání testu a při uchovávání kultury.
Doporučení Finančně velmi výhodný test. Vhodný k testování odpadů – toxických
vzorků bez vysokého zákalu a zabarvení.
Miniaturizace testů
20.3.2013
7
Miniaturizace testů
Miniaturizace testů
SPECT RA Rainbow Thermo; Serial num ber: ; Firmware: V2.03; XREAD PLUS Version: V 2.00
User com ment:
M easurem ent m ode: Absorbance
M easurem ent filter: 610
Raw data
<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,0670 0,0650 0,0650 0,0680 0,0670 0,0680 0,0720 0,0750 0,0710 0,0670 0,0680 0,0590
B 0,0550 0,0560 0,1870 0,1650 0,1940 0,1470 0,1150 0,0670 0,0640 0,0800 0,0710 0,0610
C 0,0620 0,0520 0,1680 0,1670 0,1700 0,1500 0,1280 0,0660 0,0620 0,0710 0,0800 0,0600
D 0,0630 0,0560 0,1570 0,1910 0,1680 0,1530 0,1250 0,0670 0,0680 0,0830 0,0760 0,0570
E 0,0620 0,0570 0,2100 0,0880 0,0650 0,0660 0,0750 0,0720 0,0650 0,0780 0,0680 0,0650
F 0,0710 0,0560 0,2150 0,0910 0,0820 0,0700 0,0680 0,0670 0,0650 0,0740 0,0650 0,0540
G 0,0730 0,0550 0,2050 0,0810 0,0720 0,0690 0,0750 0,0680 0,0670 0,0750 0,0790 0,0610
H 0,0780 0,0750 0,0780 0,0640 0,0780 0,0620 0,0670 0,0730 0,0730 0,0690 0,0690 0,0610
Závislost inhibice růstu Pseudomonas putida na
přítomné koncentraci - 3,5-dichlorfenol
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
koncentrace dichlorfenolu
inhibicebakteriálního
růstu
Měřené hodnoty v
uživatelském rozhraní
EXCEL
20.3.2013
8
Postup
Vyhodnocení testů
Testovaný vzorek Inkubace Odpověď
Hodnocení
Negativní kontrola Inkubace Odpověď
Blank Inkubace Odpověď
Aktivita (t1h) - Aktivita (t0h) v.s. negativní kontrola
% inhibice (jako sledovaný efekt)
Negativní kontrola: vzorek nahrazen rozpouštědlem
Blank: není testovací kultura
Pozitivní kontrola
20.3.2013
9
Screeningové testy toxicity - aplikace testů na prokaryotických
mikroorganismech
18
MICROTOX
20.3.2013
10
MICROTOX
Microtox
Organismus Vibrio fischeri (G-)
Princip Jsou to testy na mořské luminiscenční bakterii
Vibrio fischeri (ISO 11348 1998). Po proběhlé
expozici je měřeným paramentrem inhibice
bioluminiscence. Kinetika inhibice je nejčastěji
sledována v následujících expozičních intervalech:
5, 15 a 30 minut s použitím jemné ředící řady vzorku
1:1.
Vzorky by měly být před měřením upravovány: pH,
salinita (2 %). Je-li hodnota pH v rozmezí od 6 - 8,5,
není nutné pH upravovat (BioOrbit 1996).
Při úpravě pH je nutné citlivě připravit roztok HCl či NaOH o takové
koncentraci, která optimálně upraví pH roztoku co nejmenším objemem
– tím lze zabránit nežádoucímu naředění vzorku. Celý test probíhá při
teplotě 15 o
C. Test má také variantu “solid phase”.
Reakční směs (V) 1 ml. Poměr vzorek:inokulum je 500:500 µl, případně i 800:200 µl.
Předkultivace 10 – 15 minutová resuscitace lyofilizované bakterie (15 o
C).
Trvání testu 5, 10, 15, 20, 30 minut. Sleduje se jen jeden endpoint, nebo kinetická
odpověď bakterie v několika zvolených intervalech.
Teplota 15 o
C.
pH Optimum 6 – 8,5 pH.
Třepání Ne.
Pozitivní kontrola ZnSO4.
Aseptická práce Není nutná.
MICROTOX
FMNH2 + RCHO FMN + RCOOH + H2O + 0,1 h
O2
-Celkový kvantový výtěžek bioluminiscence, tj. počet kvant vyzářených na
jednu molekulu spotřebovaného substrátu, činí asi 0,1.
-Bioluminiscenční systém je vlastně boční větví elektronů ve flavoproteinové
části aerobního respiračního řetězce.
- Mezi oběma větvemi toku elektronů existuje soutěživý vztah.
Přitom afinita luciferázového systému ke kyslíku je větší než
systému respiračního, takže při nedostatku kyslíku klesá
rychlost respirace, a to až na 10 % maximální rychlosti, aniž je
dotčena intenzita luminiscence.
-Emise světla je silně
exergonický proces.
20.3.2013
11
MICROTOX
ČSN EN ISO 11348-(1)
Název normy:
Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na
světelnou emisi Vibrio fischeri (Zkouška na luminiscenčních
bakteriích) - Část 1: Metoda s čerstvě připravenými bakteriemi,
Třídící znak: 757734
Vydána: leden 2000
Mutatox
Mutatox
Organismus Využívání bakterie Vibrio fischeri - „dark mutant“ - za normálních
podmínek neluminuje (G-).
Princip Jedná se o mutanta, u kterého je emise světla způsobena až reverzní
mutací za přítomnosti mutagenních látek. (Ulitzur et al. 1980).
Lyofilizované bakterie jsou rehydratovány a exponovány toxickou
látkou. Po 16-24 hodinách se měří emise světla luminometrem. Test je
prováděn s i bez enzymové aktivace S9. Použití +S9 je popsáno v práci
Johnson 1992,
aplikace bez -S9 v článku Kwan et al. 1990.
Reakční směs (V) 500 µl.
Předkultivace 30 minut v 37 o
C vodní lázni.
Trvání testu 16 – 24 h.
Citlivost Dodání S9 směsi má tendenci zvýšit detekční limit a snížit jednotnost
výsledků, což může být vysvětleno nestandardními podmínkami pro
metabolizaci (bakterie vyžaduje jen 15 o
C, zatímco S9 směs byla
vyvinuta pro Ames test při 37o
C). S výsledky Mutatoxu také může
interferovat cytotoxicita (stejný případ i u Ames testu). Zde se však
může provést jako kontrola populačně růstový test založený na buněčné
hustotě. (Willemsen et al. 1995).
Byla potvrzena vysoká 93 % shoda s Ames testem (Legault et al. 1994).
Mutatox byl schopen z 82% správně odlišit (ne)karcinogenní látky ve
srovnání s Ames testem, který měl tuto schopnost nižší (73%).
Teplota 23 ±1 o
C.
Třepání Ne.
Pozitivní kontrola 2-AA, 2-AF, BaP..
Aseptická práce Ano.
Doporučení Test je doporučen provádět v kombinaci s Microtox testem, který mu
musí předcházet (Hauser et al. 1997).
20.3.2013
12
ATP – TOX system
- ATP-TOX system využívá měření aktivity buněčné ATP jako indikátoru růstové inhibice.
- Adenosin trifosfát je velmi důležitá, vysoce energetická sloučenina, kterou syntetizují živé
organismy v buňkách pro ukládání lehce přenosné energie. Ta je využívána v buňkách v
místě aktuální potřeby. Pokud buňka začne z jakýchkoliv důvodů snižovat intenzitu
metabolismu, lze citlivě pozorovat snížení tvorby ATP (aniž by došlo k úplnému odumření
buňky).
- Základní test pro měření ATP je založen na měření světelné luminiscence, která následuje
po reakci luciferinu s ATP za přítomnosti luciferázy a hořečnatých iontů. Tento systém může
být využit pro měření jakékoliv bakterie nebo řasy, která rychle roste v laboratorních
podmínkách:
luciferáza
- luciferin + ATP + O2 --------------> oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + světlo (~562 nm)
Mg2+
- 18-24 hodinová buněčná kultura se naředí na potřebnou hustotu a přidá se k jednotlivým koncentracím
testovaného vzorku. Zkumavky se inkubují na rotační třepačce po dobu 5 hodin a po té se měří celkové
množství vyprodukované ATP pomocí luciferin-luciferázové aktivity (dodává se luciferin-luciferázový
roztok do testované směsi) na luminometru. Vzorek může inhibovat schopnost přidané luciferázy měřit
produkci ATP, proto je třeba ještě ověřit, zda tento jev nenastal. Celý postup měření je stejný jako u ATP,
ale místo bakteriální kultury se používá sterilní médium stejného obsahu, jako je v bakteriálním inokulu.
Testování vzorků, které způsobují vyšší inhibici luciferázové aktivity, by mělo být zopakováno s
podrobnějším ředěním.
ATP – TOX system
= „rozbití“ buněčné stěny a uvolnění buněčného
obsahu včetně ATP
extrakční činidla: TCA, H2SO4, detergent benzethonium
chlorid, DMSO…
možná inhibice luciferázy extrakčním činidlem --->
nutné ředění (TCA) nebo neutralizace (benzethonium
chlorid, H2SO4)
Extrakce ATP
20.3.2013
13
ATP – TOX system
Stanovení ATP
ČAS
A
B
C
ATP StandardATP Reagent
LUMINISCENCE
ATP – TOX system
ATP-TOX systém
Organismus Libovolná kultura.
Princip ATP-TOX system využívá měření aktivity buněčné ATP jako indikátoru
růstové inhibice.
Základní test pro měření ATP je založen na měření světelné
luminiscence, která následuje po reakci luciferinu s ATP za přítomnosti
luciferázy a hořečnatých iontů. Tento systém může být využit pro měření
jakékoliv bakterie nebo řasy, která rychle roste v laboratorních
podmínkách (Dutka 1988). Zkumavky se inkubují na rotační třepačce po
dobu 5 hodin a po té se měří celkové množství vyprodukované ATP
pomocí luciferin-luciferázové aktivity (dodává se luciferin-luciferázový
roztok do testované směsi) na luminometru.
Vzorek může inhibovat schopnost přidané luciferázy měřit produkci
ATP, proto je třeba ještě ověřit, zda tento jev nenastal..
Reakční směs (V) 1 ml. (200 ul roztoku enzymu + 800 ul vzorku)
Předkultivace Závisí na typu kultivovaných buněk (18-24)
Trvání testu Po proběhlé expozici se provede rozrušení stěn buněk (činidlem – TCA,
trichloroctová kyselina, sono – ultrazvuk). Tím dojde k uvolnění ATP do
roztoku, ze kterého se odebírá 800 ul vzorku do reakční směsi.
Teplota Závislá na vybrané kultuře.
Třepání Doporučené.
Pozitivní kontrola Chemické látky musí být vybírány s ohledem na možnou inaktivaci
enzymu (viz princip).
Aseptická práce Ano
20.3.2013
14
ATP – TOX system
Automatický BIOSENZOR
Organismus
(bakterie, řasa, korýš)
Kontaminant
Sorbovaný
podíl
Přirozená vazba
organismů
na pevné částice
Kontakt organismu s
kontaminantem
Částice
Rozpuštěný
podíl
Ka
Testy toxicity se vzorky pevné fáze
20.3.2013
15
Expozice bakterie probíhá přímo ve vzorku pevného skupenství.
Její metabolický stav je hodnocen pomocí měření aktivity dehydrogenáz. Suspenze
buněk B. cerea spektrofotometricky ověřené koncentrace je přidána do suspenze
vody a pevného vzorku.
Po inkubaci (2h, 70 rpm, 25° C) je do suspenze přidán resazurin (oxido-redukční
barvivo indikující aktivitu bakteriální dehydrogenázy) ve fosforečnanovém pufru. Po
15 min. je směs zcentrifugována a reakce přerušena filtrací supernatantu přes
membránový filtr (velikost pórů 0,2 mm). Zredukovaný resazurin mění barvu, je
tudíž možné míru jeho přeměny spektrofotometricky kvantifikovat.
Dehydrogenázní aktivita
Navážka sedimentu
Fosf. pufr + živiny
Inokulum
PP
PP
inkubace (2h, 70 rpm, 25 °C)
+ resazurin
Přesně
definovaná
koncentrace
ONa
O
O
N
O ONaO
N
O
Resazurin
λmax = 601,2nm
modrofialová
barva
Resorufin
λmax = 571,4nm
růžová barva
Dehydrogenázní aktivita
20.3.2013
16
Test na aktivitu dehydrogenáz
Test na aktivitu dehydrogenáz
Organismus Bacillus cereus, G+, (CCM 2010).
Princip Jedná se o test, ve kterém je aplikována sbírková kultura bakterie
Bacillus cereus přímo do vzorku pevného skupenství a její poškození se
sleduje pomocí spektrofotometrického měření změn v množství
specifickoho substrátu resazurinu (601nm), jehož redukce je úměrná
změnám v aktivitě dehydrogenáz sledované buněk.
Alternativou odečtu výsledků je spektrofotometrická detekce
vznikajícího resorufinu (571nm). (Rönnpagel et al. 1995).
Reakční směs (V) 6 ml.
Předkultivace 18 hodin při kontinuálním třepání (220 rpm) při teplotě 21 o
C,
(OD601=0,4).
Trvání testu 4 hodiny.
Teplota 21 o
C.
Třepání Kontinuální třepání 70 rpm.
Aseptická práce Pouze při práci se zásobní kulturou.
Výhody Bezextrakční test matrice pevného skupenství. Tato metoda testuje
účinky i těch kontaminantů, které jsou vázané na povrch pevných
částeček půd a sedimentů.
Výhodou je jeho metodická „benevolentnost“ k přítomnosti kyslíku a
dobrá rozpustnost resorufinu ve vodě a tím jeho jednoduchá
extrahovatelnost.
Toxi - ChromotestTM
Toxi-Chromotest, Toxi-ChromoPad
Organismus Escherichia coli , gramnegativní (G-), K12 OR85.
Princip Princip obou testů je založen na schopnosti toxikantů inhibovat de novo
syntézu β-galaktozidázy v kmeni Escherichia coli, mutantu citlivému
především k pesticidům, mykotoxinům a těžkým kovům (Kilroy et Gray
1995). Toxi-Chromotest je mikrodestičkový test, který slouží k testování
kapalných vzorků a roztoků chemických látek. Při ToxiChromoPad
variantě test probíhá ve zkumavkách. Vzorky se pak aplikují na filtrační
papíry se substrátovou impregnací (test pro sedimenty, půdy).
Lyofilizované bakterie jsou oživeny směsí živného média a specifického
induktoru pro fenotypovou produkci enzymu. Jsou následně smíchány s
testovaným vzorkem, který může inhibovat obnovovací proces a syntézu
β-galaktozidázy. Směs je u Toxi-Chromotestu nanášena do
serologických destiček a množství enzymu je stanoveno
semikvantitativně kolorimetrickou reakcí nebo může být kvantifikováno
na čtecím zařízení pro destičky (Reinhartz et al. 1987). V případě
ToxuChromoPadu jsou výsledky hodnoceny jen srovnáním vytvořené
kontrolní barvy na filtračním papíře s variantou vzorku (EBPI, 1995),
(Kwan 1993, Kwan 1995, Rao et al., 1991).
Citlivost Kwan et Dutka 1990 srovnávali tyto testy s Microtox®
testem.
Především u vzorků sedimentů jsou tyto testy méně citlivé, než Microtox.
Naopak u mykotoxinů a pesticidů byl ToxiChromotest citlivější (Kilroy
et Gray 1995).
Reakční směs (V) U Toxi-ChromoPadu je reakční směs 500 µl, u klasické mikrodestičkové
verze Toxi-chromotestu 250 µl.
Předkultivace Dostatečná doba resuscitace 10 minut.
Aseptická práce Aseptická práce je nutná při jakékoliv manipulaci se zásobní kulturou.
Trvání testu 2 hodiny.
Teplota 37 o
C
20.3.2013
17
Toxi - ChromotestTM
-The activity of the induced (by cocktail containing a specific inducer of ß-galactosidase)
enzyme is detected by the hydrolysis of a chromogenic substrate
-It is sensitive to a wide spectrum of toxic substances such as heavy metals, and organic
and inorganic pollutants, and may be used to detect the presence of toxicants in water and
soil/sediment extracts
- If the sample is not toxic, a distinctive blue (or yellow) colour quickly develops
Toxi - ChromotestTM
Přehled v praxi nejčastěji používaných substrátů pro stanovení beta-
galaktozidázy:
- ONPG BEZBARVÁ - ŽLUTÁ
-CPRG NAŽLOUTLÁ - ČERVENÁ
Chlorophenol red-beta-D-galacto- pyranoside,
monosodium salt
-X-GAL ŽLUTÁ - MODRÁ
-5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranoside,
crystals
20.3.2013
18
Toxichromo-Pad ®
Ukázka KITu na stanovení toxicity v pevné matrici Ukázka KITu na stanovení toxicity v kapalné matrici
Toxichromo-test ®
http://www.ebpi.ca/
Toxi - ChromoPad
Control
3,13 %
6,25 %
12,5 %
25 %
50 %
0,5g of samples
Toxi - ChromoPadTM
20.3.2013
19
MetPad, MetPlate, FluoroMetPlate, MetSoil
Enzymová inhibice
syntézy B-galaktozidázy
MetPad MetPlate
35oC, 90 min., rehydratace lyofilizované kultury
- specifita na těžké kovy X velmi slabá reakce na znečištění organickými polutanty
- test provádět vždy v kombinaci s jiným testem,
- FluoroMetPlate - fluorogenní substrát
MetPlate
Organismus Escherichia coli (G-).
Princip těchto testů je obdobný jako u Toxi-Chromotestu. Bakteriální
odpovědí na toxický vzorek je měřená indukovaná syntéza enzymu β –
galaktozidázy mutantního kmene E. coli (Bitton et al. 1992, Kong et al.
1995). Intenzita syntézy enzymu je závislá na metabolismu buněk.
Reakční směs (V) 1 ml (100 µl inokula + 900 µl vzorku)
Trvání testu 1 hodinu.
Teplota 35 o
C.
MetPlate
20.3.2013
20
TREND:
Testy vzorků pevné fáze
Testy vzorků pevné fáze
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Koncentrace vzorku (mg.ml
-1
)
Inhibice(%)
Vodný výluh
Solid-phase test
Organický extrakt
20.3.2013
21
Testy vzorků pevné fáze – DOPORUČENÍ DO BUDOUCNA
Hodnocení bakteriálních testů
Výhody
nízká finanční a časová
náročnost
citlivost
uchovávání a příprava
testovacích organismů
miniaturizované
provedení
instrumentální metody
Nevýhody
jednobuněčný
organismus
testování extraktů
vliv zákalu vzorků
pouze akutní účinky
laboratorní podmínky
omezená extrapolace
výsledků
20.3.2013
22
Trendy ve vývoji bakteriálních testů
standardizace metod
miniaturizace provedení
moderní instrumentální analytické metody
SPT testy (testování účinků biodostupné frakce)
KOMBINOVANÉ
MARA
MARA (Microbial Assay for Risk Assessment)
The MARA product is a multi-species toxicity test based on
an array of 11 micro-organisms that
is simple to use
provides a ‘battery of tests’ within a test
produces data for 11 test results
can be used to produce toxic fingerprints of
chemicals or environmental samples
requires small sample volumes
20.3.2013
23
MARA
The MARA test includes genetically diverse
organisms from the following groups:
Prokaryotes
• Gram +ve
• Gram –ve
Eukaryote
• yeast
TEST TOXICITY:
experimentální design
20.3.2013
24
47
Protocol
Medium&
Dye
Freeze-dried
micro-organisms
Sample,
Medium &Dye
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H
Control
Test Control
Inoculate from H, A to G
Discard
Reconstitute
SerialDilution
DecreasingSample
Conc.
Microbial Fingerprint (effluent)
A microbial fingerprint can be derived
from the analysis
20.3.2013
25
MARA Software – Image Screen
The plate image is copied into the image analysis
software
060007005
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 20 40 60 80 100
Sample Conc (%)
GrowthInhibition(%)
Sp 1
Sp 2
Sp 3
Sp 4
Sp 5
Sp 6
Sp 7
Sp 8
Sp 9
Sp 10
Sp 11
Species Response
When the data generated by the software is plotted, each of
the species shows a different response to the toxicant.
20.3.2013
26
Mara Starter Pack
Aspekt trofické úrovně
testovaného organismu
Dle cíle hodnocení
a dle typu vzorku
Minimální výběr:
- bakterie
- řasy
- bezobratlí
Zařazení do baterie testů
20.3.2013
27
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Ekotoxikologické biotesty
Testy genotoxicity
2013
Pavel Čupr
cupr@recetox.muni.cz
GENOTOXICITA
toxicita pro genom
genotoxické faktory jsou schopny interagovat s DNA
za vzniku reverzibilních i ireverzibilních změn
poškození genomu může následně vést k
mutagenezi, karcinogenezi, indukci fágů, buněčné
smrti, chromozomálním aberacím a dalším neméně
závažným důsledkům
20.3.2013
28
Společenstvo
Ekosystém
Individuum
Nespecifická
toxicita
Subletální účinekLetální účinek
Specifická
toxicita
Genotoxicita
Karcinogenita
-nepolární narkóza
-polární narkóza
-blokování respiračního řetězce (respiratory
blocator)
-inhibitor AchE
-membránové iritanty
-poškození CNS
Reprodukční
toxicita
Teratogenita
Neurotoxicita
Endokrinní
toxicita
Populace
Parametry
populace
Strukturní a
funkční diverzita
Homeostáze a
homeorhéza
Vitalita/mortalita Růst/inhibice
ÚČINEK
MUTACE
za mutaci je považována jakákoliv změna v genetické
informaci buněk, která není výsledkem rekombinace či
segregace při dělení buněk, a je přenášena do dalších
generací buněk či jedinců.
proces vzniku mutací je označován jako mutageneze.
20.3.2013
29
MUTAGENEZE
několikafázový proces.
genotoxická látka s mutagenními účinky po vstupu do
organismu a na základě své toxikokinetiky proniká v původní či
změněné podobě do buňky (fáze 1).
následně dochází k interakci s DNA v genomu, jejichž
podstatou je kovalentní vazba na molekulu DNA, interkalace
mezi řetězce dvojšroubovice, interakce s mitotickými
strukturami (fáze 2).
mutace, tedy změna v genotypu, která není letální, může
v určitém časovém horizontu vést k transkripci a realizaci
změněné informace, která se následně promítá v podobě
mutantního fenotypu (fáze 3).
procesu mutageneze nemusí být dokončen v případě, že daný
genotoxický zásah je pro danou buňky letální či mutace byla
včas opravena.
GENOTOXICKÉ FAKTORY
Fyzikální faktory
Chemické faktory
Přírodní
faktory
Antropogenní
faktory
20.3.2013
30
AKTIVACE PROGENOTOXINŮ I.
přímé mutageny – skupina látek, jež vykazuje své genotoxické
účinky ve stávajícím stavu díky přítomnosti silně elektrofilní
skupiny.
nepřímé mutageny – látky, jež za normálních podmínek
nevykazují genotoxické účinky, ale v případě enzymatické
přeměny získávají vhodnou molekulární strukturu, která
umožňuje účinnou interakci s DNA.
progenotoxická
látka E aktivovaný
genotoxin
AKTIVACE PROGENOTOXINŮ
Nejčastějí využívaným provedením metabolické
aktivace je příprava mikrosomální frakce (S9 frakce):
jaterní mikrosomální frakce z
potkanů či myší
mikrosomální frakce z plic, ledvin
či mozku potkanů a myší
jaterní mikrosomální frakce
lidských jater
jaterní mikrosomální frakce z ryb
rostlinná mikrosomální frakce
20.3.2013
31
PŘEHLED NEJPOUŽÍVANĚJŠÍCH TESTŮ
GENOTOXICITY A MUTAGENITY
VYHODNOCOVÁNÍ, INTERPRETACE A
EXTRAPOLACE VÝSLEDKŮ TESTŮ
DETEKČNÍ SYSTÉMY GENOTOXICKÝCH ÚČINKŮ
Bakterie
Živočichové
Rostliny
Houby
Detekční
systémy
• Interpretace
• Extrapolace
• Jednoduchost
• Rychlost
20.3.2013
32
PRINCIP BAKTERIÁLNÍCH TESTŮ GENOTOXICITY
Tři principiálně odlišné modely pro detekci genotoxických faktorů:
model 1: DNA léze vede ke změně smyslu informace
V důsledku indukce reverzní mutace dochází k obnovení určité
vlastnosti buněk testovacího kmene, která je následně sledována.
model 2: DNA léze indukuje SOS odpověď zahrnující SOS
mutagenezi
V důsledku indukce poškození DNA je spuštěn systém SOS odpovědi,
která je determinována skupinou SOS genů, jejichž aktivace je následně
sledována na základě přepisu vhodného spřaženého reportérového genu
(specifický fúzní gen SOS gen::reportérový gen).
model 3: DNA léze vede ke smrti buňky
Důsledkem poškození DNA u kmenů buněk, které nejsou schopné
opravovat vzniklá poškození, je buněčná smrt.
PŘEHLED BAKTERIÁLNÍCH TESTŮ GENOTOXICITY
model 1:
model 2:
• Amesův test – vznik histidin-prototrofních CFU (Ames et al., 1975)
• Ara-test – vznik L-arabinóza-rezistentních CFU (Englesberg et al., 1962)
• Ampicilínový test – vznik ampicilín-rezistentních CFU (Lee et al., 1994)
• Reverzní test na E. coli – vznik tryptofan-rezistentních CFU (Bridges, 1972)
• Mutatox – obnovení bioluminiscence buněk (Johnson, 1992)
• GFP test – obnovená schopnost produkce GFP (Cariello et al., 1998)
• SOS chromotest – indukce přepisu sulA::lac-Z (Quillardet et al., 1982)
• UmuC test – indukce přepise umuC::lac-Z (Oda et al., 1985)
• SulA test – indukce přepisu sulA::lac-Z (El Mzibri, 1996)
• RecA test – indukce přepisu recA::luxCDABE (Min et al., 1999)
• Vitotox – indukce přepisu recN::luxCDABE (Van der Lelie et al., 1997)
• Lux-fluoro test – indukce přepisu recA::luxCDABE (Baumstark-Khan et al.,
2001)
model 3: • Reparační test – pokles počtu CFU v důsledku poškození DNA (Green, 1977)
20.3.2013
33
AMESŮV TEST I.
Specifikace
jednoduchý screeningový nástroj, který je nejčastěji
používán a jako jediný všeobecně doporučován
národními normami
Princip
test je založen na indukci reverzních mutacích v
histidinovém lokusu v buňkách geneticky modifikovaného
kmene Salmonella typhimurium
reverzní mutace je spojena s přeměnou histidin-auxotrofních
buněk (His-) na histidin-prototrofní (His+)
histidin-prototrofní buňky jsou následně schopné růst v
médiu bez přítomnosti aminokyseliny histidinu
obnova růstu a metabolické aktivity je signálem
genotoxických účinků testovaného vzorku
Amesův test
Bruce Ames (nar. 1928)
20.3.2013
34
Amesův test
• Umožňuje studium reverzních mutací u histidin – deficientních
kmenů bakterie Salmonella typhimurium. Tyto auxotrofní mutanty
přežívají pouze na médiu obsahujícím histidin.
• Působením mutagenu dojde u některých buněk k reverzní mutaci,
která způsobí „opravu“ genu pro syntézu histidinu. Bakterie s touto
mutací tak znovu získají schopnost tvorby histidinu a přežívají i na
médiu, které histidin neobsahuje.
Bakterie
His– auxotrof
Na normálním
médiu umírá
Médium
s histidinem
Normální
médium
Bakterie
His+prototrof
Reverzní mutace
Mutagen
Amesův test
0
Negativní
kontrola
Pozitivní
kontrola
Miska s
testovanou
látkou
GENOTOXICITA
PROKÁZÁNA
Proč lze i na negativní
kontrole (tj. na misce bez
jakéhokoliv mutagenu)
pozorovat nárůst
bakterií?
SPONTÁNNÍ
REVERTANTI
Interpretujte výsledek
testu? Lze tímto
výsledkem potvrdit
genotoxicitu látky?
Vysvětlete, jaký význam
má pozitivní kontrola (tj.
aplikace známého
mutagenu).
SLOUŽÍ KE KONTROLE
PRŮBĚHU TESTU A PRO
SROVNÁNÍ
?
?
?
20.3.2013
35
Výsledek Amesova testu
Amesův test – automatické
odečtení výsledků
20.3.2013
36
AMESŮV TEST
Fluktuační verze Amesova testu – MutachromoplateTM
(EPBI)
Vyhodnocení: počet pozitivních jamek (žluté) X negativní
kontrola.
(statistické vyhodnocení – Poissonova distribuce).
Případně počítáme mutagenní aktivitu (M.A.).
MUTATOX I.
Specifikace
krátkodobý, velmi citlivý screeningový test založený opět
na indukce reverzních mutacích (model 1.)
Princip
test je opět založen na indukci reverzních mutací v důsledku
iniciace substitucí, translokace, inhibice syntézy DNA nebo tvorby
DNA aduktů genotoxickými látkami v luxCDABE operonu
geneticky modifikované bakterie Photobacterium phosphoreum
(Vibrio fischeri) M 169, která není schopná luminovat (dark
cells)
test probíhá v tekutém médiu !! v kyvetách, či mikrodestičkách
v důsledku reverzní mutace je obnovena schopnost luminiscence
buněk a na základě její kvantifikace je odhadován genotoxický
potenciál testovaného vzorku
20.3.2013
37
recA lexA >20 cílových genů
DNA
reparace a
jiné
SOS funkce
ON
aktivovaný
RecA
signál
+++
C.
OFF
recA lexA >20 cílových
genů
slabá
exprese
A.
pokles úrovně
aktivovaného RecA
reparovaná DNA
D.
pokles úrovně
signálu
akumulace
LexA represoru
DNA
poškození
indukující
signál
aktivace RecA
proteinu
rozštěpení
LecA represoru
B.
Model SOS regulačního systému
testy modelu 2.
Schéma spřažení SOS reparačního mechanizmu s
reporterovým genem = funkce fůzního genu
SOS CHROMOTEST I.
Specifikace
jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením založený na stejném principu jako umuC test
Princip
podstatou SOS chromotestu je indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození DNA genotoxickou látkou
ze skupiny SOS genů (din genů) je využíváno propojení sulA genu s
reportérovým lac-Z genem
cílenou genovou manipulací byl do kmene Escherichia coli PQ 37
vložen specifický fúzní gen sulA::lac-Z
jako kontrola toxicity vzorku je kontinuálně bakterií syntetizována
alkalická fosfatáza, jejíž pokles aktivity signalizuje inhibici buněk
sulA::lac-Z
20.3.2013
38
UMUC TEST I.
Specifikace
Jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením a širokou specifitou k různým skupinám
genotoxických faktorů, který je založený na indukci SOS
odpovědi (model 2)
Princip
podstatou umuC testu je indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození DNA genotoxickou látkou
ve skupině SOS genů (din genů) jsou obsaženy i geny umuC
a umuD, jejichž přepis je zahrnut v komplexním procesu SOS
odpovědi
cílenou genovou manipulací byl do kmene Salmonella
typhimurium TA 1535 vložen plazmid pSK1002 nesoucí
specifický fúzní gen umuC::lac-Z
20.3.2013
39
UMUC TEST X.
Velikost IF v závislosti na koncentraci 4-NQO
0
10
20
30
40
50
60
0,002 0,005 0,010 0,020 0,039 0,078 0,156 0,313 0,625 1,250 2,500 5,000
koncentrace 4-NQO [mikrogr./ml]
IF
Velikost IF v závislosti na koncentraci 2-AA
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
0,002 0,005 0,010 0,020 0,039 0,078 0,156 0,313 0,625 1,250 2,500 5,000
koncentrace 2-AA [mikrogr./ml]
IF
VITOTOX I.
Specifikace
Jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením založený na stejném principu jako umuC test
Princip
podstatou Vitotoxu je opět indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození genomu testovacího kmene Salmonella typhimurium
tentokrát je využíván geneticky manipulovaný kmen Salmonella
typhimurium, jež obsahuje lux operon luxCDABE izolovaný z
Vibrio fisheri a opatřený recN promotorem podléhající regulaci
ze strany lexA proteinu (tedy fůzní gen recN:luxCDABE)
reportérový operon je uložen v plazmidu pMOL1067 nebo
pMOL1068
20.3.2013
40
recA TEST
Specifikace
Jednoduchý, rychlý, screeningový nástroj s miniaturizovaným
provedením založený na stejném principu jako umuC test
Princip
podstatou RecA je opět indukce SOS odpovědi v důsledku
poškození genomu testovacího kmene Escherichia coli
DPD2794
tentokrát je využíván geneticky manipulovaný kmen Escherichia
coli, jež obsahuje fúzní gen recA::luxCDABE
Fúzní gen je tvořen bezpromotorovým operonem lux operon
luxCDBAE izolovaným z Vibrio fisheri, který byl opatřen
promotorem recA genu podléhajícímu regulaci ze strany lexA
proteinu
reportérový operon je uložen v plazmidu
TESTY GENOTOXICITY NA
KVASINKÁCH
20.3.2013
41
RAD54 - GFP
Geneticky modifikovaný
kmen Saccharomyces
cerevisiae
Kopie promotoru pro
reparační gen umístěn před
gen pro GFP protein
vykazující fluorescenci
RAD54 - GFP
Princip testu:
Po poškození DNA dojde
ke spuštění reparačního
procesu a tím i k produkci
tohoto GFPproteinu, který
je detekován měřením
fluorescence
Paralelně sledování
cytotoxicity měřením
absorbance (A600)
20.3.2013
42
Úprava na O.D590 = 1.0Optimalizovaný postup
100 ul inok (O.D. 1.0)
890 ul Yeast media (YG – viz obr)
10 ul VZORKU (či DMSO)
Rozpipetování obsahu Eppendorf zkumavky po 200 ul do 3 jamek (opakování)
Design založení testu v mikrodestičce (černá,
s čirým dnem pro fluorimetrii)
http://toxnet.nlm.nih.gov/cgi-bin/sis/htmlgen?GENETOX
20.3.2013
43
„Možná, že se vám pane
doktore zdá, že tady nikdo
není.
Ale já ji tuším, tu bestii
bakteriální!“
Kresba © Pavel Kantorek
RNDr. Pavel Čupr, Ph.D.
cupr@recetox.muni.cz
VIZITKA: