MolekulMolekuláárnrněě genetickgenetickáá diagnostika:diagnostika: Iveta ValIveta Valášáškovkováá OddOdděělenleníí lléékakařřskskéé genetiky FN Brnogenetiky FN Brno LLéékakařřskskáá fakulta MUfakulta MU Budoucnost medicBudoucnost medicííny:ny: tahounem bude genetikatahounem bude genetika Prof. MUDr. AntonProf. MUDr. Antoníín Dolen Doležžal, DrSc.al, DrSc. 30.30. prosinceprosince 2008, MF Dnes2008, MF Dnes DNA deoxyribonukleová kyselina je pro život nezbytnou látkou je nositelkou genetické informace všech organismů je molekulární paměť disponující úžasnou kapacitou ve své struktuře kóduje a zadává buňkám jejich program a tím předurčuje vývoj a vlastnosti celého organismu James Watson Francis Crick „We have discovered the secret of life! Rosalind Franklin Science Museum Exhibition Road, South Kensington, London SW7 2DD. • "Watson and Crick staring up at their model of the Double Helix is one of the most iconic pictures of the 20th Century. A replica of the model now gathers dust in a glass case in a dark corner of the top floor of the Science Museum. Here, a man glances at it as he walks past. Does he know the story?" • Dave Kinahan. Crick and Watson's DNA molecular model, 1953. 4 báze A,T,C,G se opakují mnohomilionkrát v každém chromozomu Ústřední dogma molekulární biologie přenos genetické informace mezi biopolymery Francis Crick James Watson ”Mysleli jsme si, že náš osud je zapsán ve hvězdách. Nyní víme, že z velké části je zapsán v našich genech“ Genotypy jedincGenotypy jedincůů stejnstejnéého druhu mohou být rozdho druhu mohou být rozdíílnlnéé Genom u jedincGenom u jedincůů stejnstejnéého druhu je stejnýho druhu je stejný Human Genome Project Projekt lidský genom Human Genome Project Projekt lidský genom 1986: Santa Fe1986: Santa Fe James Watson:James Watson: „„vstoupit na cestu od dvojivstoupit na cestu od dvojiššrouboviceroubovice k 3 miliardk 3 miliardáám schodm schodůů lidsklidskéého genomuho genomu““ 1988: Kongres USA schv1988: Kongres USA schváálil 15 letýlil 15 letý projekt a dotaci 3 mld USDprojekt a dotaci 3 mld USD 1990: za1990: začčáátek projektutek projektu 2005: p2005: přředpokladanedpokladanéé ukonukonččeneníí $ 3 Billions • Walter Gilbert: „až budeme mít v ruce úplnou sekvenci lidského genomu, budeme vědět, co dělá člověka člověkem.“… Human Genome Project Projekt lidský genom UrUrččitit úúplnou sekvenci genomu (3,2 Gb)plnou sekvenci genomu (3,2 Gb) Identifikovat a mapovat geny,Identifikovat a mapovat geny, ururččit jejiich strukturuit jejiich strukturu a funkci v zdrava funkci v zdravíí i v patologiii v patologii Identifikovat dIdentifikovat důůleležžititéé mimogenovmimogenovéé sekvencesekvence VVššechny data uloechny data uložžit v veit v veřřejnejněě ppřříístupnýchstupných databdatabáázzííchch Sekvenovat genomy modelových organizmSekvenovat genomy modelových organizmůů (drozofila, my(drozofila, myšš,, C. elegansC. elegans,, A. thalianaA. thaliana a i.)a i.) Zkoumat etickZkoumat etickéé, pr, práávnvníí a socia sociáálnlníí aspektyaspekty Cíle The Genome International Sequencing Consortium: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409,860-621,2001 Venter, J.C. et al.: The sequence of the human genome.Science 291:1304-1351,2001 Human Genome Project Projekt lidský genom V roce 2003 vědci popsali DNA sekvenci 3 miliard párů bazí tvořících lidský genom Human Genome Project Projekt lidský genom Frank Collins Konsorcium HUGO Craig Venter Celera Genomics „Molekulární genetici jsou povinni využít poznatky o lidských genech v boji s chorobami.“ Frank Collins Craig Venter Člověk, který dal ke zkoumání svoji DNA „Myslím, že největší překvapení je, že se jeden od druhého lišíme více, než jsme čekali.“ Faster and faster we go, so hang on! Projekt lidského genomu • 3-5% z ročního rozpočtu jde na ELSI (=Ethical, Legal, Social Issues), etické, právní, sociální otázky • Vznikl tak největší etický projekt v historii planety • Právo na genetické soukromí – před pojišťovnami a zaměstnavateli • Opačný problém: zruinování pojišťoven díky tomu, že klient zná svůj genom a volí optimální pojišťovací strategii Etické otázky HGP • je identifikováno čím dál tím víc lidských genů • pokud budou objeveny geny, které indikují náchylnost ke kriminalitě, inteligenci nebo homosexualitě, jak by na to měla společnost reagovat? • genetika versus kriminalita: když u zločinců manipulujeme prostředí vězením, nemohli bychom též manipulovat jejich genomem? Etické otázky plynoucí z HGP • Kdo bude mít přístup k osobním informacím o složení genomu jedince a jak budou tyto informace využívány? • Kdo je majitelem informace o genomu jedince? • Jak ovlivní informace o složení genomu jedince sebechápání daného člověka a jak tato informace ovlivní přijetí tohoto jedince společností? • Jak informace o genomech jedinců ovlivní přijetí minoritních skupin společností? • Jak připravíme lékaře na nástup „nové genetiky“ a jak připravíme na nástup nové genetiky veřejnost? • Jak připravíme veřejnost, aby byla schopna uvážlivě a kvalifikovaně provést informovanou volbu? Etické otázky plynoucí z HGP • Jak společnost vyváží nutná vědecká omezení a sociální risk s dlouhodobým prospěchem? • Mělo by se provádět genetické testování, pokud neexistuje terapie? • Měli by mít rodiče právo nechat testovat děti na nemoc, která propukne až v dospělosti? • Jsou genetické testy spolehlivé a interpretovatelné lékařskou komunitou? • Způsobují geny, že se lidé chovají určitým způsobem? • Mohou lidé vždy kontrolovat své chování? • Kde se nachází linie mezi léčbou a vylepšením? • Kdo vlastní geny a další sekvence lidské DNA? • Bude patentování sekvencí DNA omezující pro jejich nedostupnost a zbrzdí se tím vývoj užitečných produktů? Etické otázky plynoucí z HGP • 1. Vzrůstající informovanost a genetické konstituci jedince a celých populací vede k otázce, kdo by měl kontrolovat získávání těchto informací a kde by tyto informace měly být přístupné. Do této otázky spadají otázky týkající se presymptomatického testování, screening přenašečů, genetický screening prováděný zaměstnavatelem za účelem zjištění vhodnosti uchazeče k dané práci atd. • 2. V nedaleké budoucnosti budu zcela jistě možné manipulovat genom embryí za účelem změny genotypu i fenotypu • 3. Vzrůstající informovanost obhledně genetického základu behaviorálních projevů zřejmě změní naše sebepochopení a ovlivní sociální instituce.[1] • [1] Murray, T.H., (1991) Ethical issues in human genome research FASEB Journal 5,55-60 Lidský genom • má přibližnou velikost 3,2 Gb (haploidní stav) • z nichž je 2,95 Gb tvořeno euchromatinem. • 28% sekvencí je transkribováno do RNA a z těchto 28% je pouhých 5% přepisováno do proteinů; což je 1,1%- 1,4% absolutní velikosti celého genomu člověka. • Přes 50% genomu je tvořeno repetitivními sekvencemi: • 45% genomu je tvořeno jedním ze čtyř typů parazitických DNA elementů, • 3% genomu tvoří repetice jen několika bází • 5% genomu je tvořeno recentními duplikacemi velkých segmentů DNA. . • Lidský genom tak z určitého úhlu pohledu připomíná moře repetitivních sekvencí s malou příměsí genů. PARAZITICKPARAZITICKÁÁ DNADNA REPETITIVNREPETITIVNÍÍ SEKVENCESEKVENCE EUKARYOTICKEUKARYOTICKÉÉHO GENOMUHO GENOMU Nekódující DNA (98,5%) nachází se mezi geny (extragenová) nebo v genech (intragenová) Single Copy DNA jedinečná Repetitivní DNA 50 % celkové jaderné DNA Mírně repetitivní Vysoce repetitivní (tandemová) LINEs Long interspersed elements. např. lidské Kpn segmenty AT-rich 1.5-6 kb 104-106 bp Satelitní DNA dlouhé repetice kolem centromer a telomer Minisatelity VNTR Variable numberVariable number Tandem RepeatsTandem Repeats 15bp repetice náhodně roztroušené Mikrosatelity STR ShortShort Tandem RepeatsTandem Repeats 2-6 bp repetice náhodně roztroušené a variabilní v počtu opakování v rámci populace SINEs Short interspersed elements. např. lidské ALU segmenty GC-rich 300 bp 105-106 bp 101-105 kopií >105 kopií repetitivní geny (histony, rRNA, tRNA) Lidský genom • 22 287 genů kódujících proteiny méně genů než se očekávalo: předpovídalo se 150,000 (před sekvenací), 30-40,000 (2001) • Průměrně 9 genů na 1Mb • Celkem 232 000 exonů (průměrně 10,4 exonu / gen) • Identifikovaných asi 20 000 pseudogenů Solitární gen: • v celém genomu v jediné kopii (asi polovina genů) Genová rodina: • skupina genů evolučně pocházející z jediného genu, v evoluci postupná diverzifikace sekvence a funkce Pseudogen: • gen který zmutoval natolik že nemůže být přepisován (v celém genomu > 20 000) Zpracovaný (“processed”) pseudogen: • pseudogen vzniklý zpětným přepisem mRNA a integrací do genomu Gen Structural elements of a gene: Exons: Protein-coding DNA sequences of a gene Introns: Non-coding DNA sequence of a gene located inbetween exons 5' Untranslated Region (UTR): Non-coding DNA sequence upstream of the translation start site 3' Untranslated Region (UTR): Non-coding DNA sequence downstream of the translation stop site Transcription control regions of a gene: TATA Box/Promoter Region: Binding site for transcription factors and RNA polymerase. Promoter Proximal Elements: Transcription control regions that are located 100- 200 base pairs upstream of the transcription start site. Enhancer Elements: Transcription control regions that are located further away (sometimes thousands of base pairs from the start site). These elements may occur upstream or downstream of the start site, or they may even occur within an intron of the gene. Struktura genu organismus Velikost (Mbp) počet genů člověk (Homo sapiens) lidská mitochondriální DNA 3 200 0.016 22 000 37 laboratorní myš (M. musculus) 2 600 ± 25.000 rýže (Oryza sativa) huseníček (A. thaliana) kukuřice (Zea mays) pšenice (Triticum aestivum) 430 125 2 500 15 000 ± 60.000 25.498 ± 40-60.000 ± 40-60.000 hlíst (C. elegans) 97 ± 19.000 octomilka (D. melanogaster) 137 13.472 kvasinka (S. cerevisiae) 12.1 5.770 bakterie (E. coli) 4.6 4.377 virus (HIV) 0.009 9 Lidský genom odlišnosti uvnitř druhu Homo sapiens v rámci celého genomu 0.1 – 0,5% (většina je v nekódujících sekvencích) • 1,5 milionu pb - rozdíl mezi matkou a dítětem • 2,25 milionů pb - rozdíl mezi babičkou a vnučkou • 3 miliony pb - rozdíl mezi dvěma náhodnými lidmi na Zemi Všichni lidé si jsou nápadně podobni 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 Pea* Fly Fish Human Humans show little genetic variation compared with other speciesGenetickávariabilita(%) π 0 0,1 0,2 0,3 0,4 Orang-utan Gorilla Chimpanzee Human π Lidský genom lidé sdílí překvapivé množství genetického materiálu s ostatními organismy •99% homologie s ostatními primáty (v genech), 96% (celkem) Kreacionismus je mrtvý Tento „strom života“ vznikl POUZE na základě podobností sekvence DNA, nebylo přihlíženo ke stávajícícm zoologickým systémům či vnější podobě organismů Collins, F., (2006) The Language of God. Free Press, New York, p. 128) Lidský genomLidský genom Jaderný genom 3 000 Mb cca 22 000 genů Mitochondriální genom 16,6 kb 37 genů Kódující DNA Intragenová DNA 22 tRNA genů 13 strukturárních genů 2 rRNA geny Nekódující DNA Pseudogeny Genové fragmenty Introny Nepřekládané oblasti Unikátní sekvence Repetitivní sekvence Tandemové sekvence Roztroušené sekvence 1% DNA kóduje nějaké znaky Extragenová DNA Lidský genom • jaderný • mitochondrialní Buněčné jádro obklopené mitichondriemi Jaderný genom Každý ze 46 chromosomů člověka je tvoře jednou molekulou dvoušroubovicové Každá DNA molekula je sbalena do chromosomu Chromosomes are tighly coiled microscopic structure basic proteins called histones provide a core around which DNA is wound in a double loop composing approximately 146bp of DNA - NUCLEOSOME if stretched out, the DNA from a single cell would extend approximately 2 meters in lenght an elaborate system of coling, which also seem to be involved in the control of gene expression is present in memmalian cells mitotic chromosome is 50 000 times schorter than its exteded lendht Nuclear genome . Uvnitř buněčného jádra je genetická informace soustředěna do molekul DNA, "zabalených" do chromozómů. Jaderný genom The four bases are repeated millions of times to form each chromosome Lidský chromosom je délky od 50 milionů do 263 milionů bazí Each of the trillions of cells in the human body contains a complete set of chromosomes (with a few exception e.g. red blood cells) Nuclear genome Nuclear genome Mendelian inheritance Mitochondrial genome Mitochondrial genome Mitochonriální dvoušroubovicová DNA tvoří jednu kruhovou molekulu Mitochondria have their own DNA, a relic from the distant past when they were free-living organisms. •Evidence of this is the slightly different genetic codes found in nonplant mitochondria. For example: Organism Code Amino Acid (standard) All nonplant species UGA Tryptophan (stop) Mollusks AGA Serine (Arginine) Yeast CUU Threonine (Leucine) Mitochondrial genome Exclusively maternal inheritance mtDNA vs. choroby • cyclic vomiting syndrome –přestavby rozáhlých segmentů mtDNA • Leber hereditary optic neuropathy - mutace v genech MT-ND1, MT-ND4, MT-ND4L, and MT-ND6 • mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes - mutace v genech MT-ND1, MT-ND5, MT-TH, MT-TL1, and MT-TV • myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - mutace v genech MT-TK, MT-TL1, MTTH, and MT-TS1 • neuropathy, ataxia, and retinitis pigmentosa - mutace v genu MT-ATP6 • nonsyndromic deafness - mutace v genech MT-RNR1 a MT-TS1 • cancer, including breast, colon, stomach, liver, and kidney tumors, cancer of bloodforming tissue (leukemia) and cancer of immune system cells (lymphoma) – somatické mutace • age-related disorders: heart disease, Alzheimer disease, and Parkinson disease somatické mutace The human nuclear and mitochondrial genomes differ in many aspects of their organisation and expression 22 000 1 – 2 % Polymerázová řetězová reakce PCR Genetici potřebují pro své analýzy značné množství studovaného úseku DNA PCR zmnoží zvolený úsek DNA Rychle a spolehlivě Kery Mullis V roce 1983 PCR metodu vynalezl a postaral se o jednu z největších revolucí v molekulární genetice Kdyžž v r. 1993 Kary Mullis z rukou žšvédského krále přijímal Nobelovu cenu za objeva realizaci PCR, sám skromně charakterizoval svùj obdivuhodný nápad a deset let práce na jeho uskutečnění jako žsouběh náhod, vědecké naivity a série šťastných omylùž. Polymerázová řetězová reakce PCR Molekulárně - genetická diagnostika • Diagnostika infekcí diagnostiky detekujících virová, bakteriální, mykotické a parazitální patogeny v různých tělních tekutinách • Diagnostika geneticky podmíněných chorob postnatální, prenatální, preimplantační diagnostika, populační screening • Diagnostika nádorových onemocnění analýza tumorsupresorových genů a onkogenů, diagnostická vyšetření zaměřená na detekci kauzálních markerů a prognostických faktorů ve vztahu k onkologickým onemocněním, monitorování terapie rakoviny, zjišťování minimální reziduální choroby. • Farmakogenetika stanovení tolerance k farmakům • DNA typizace osob (soudní lékařství, transplantologie) Molekulárně - genetická diagnostika • Diagnostika infekcí diagnostiky detekujících virová, bakteriální, mykotické a parazitální patogeny v různých tělních tekutinách Cílem je detekovat infikované buňky na pozadí mnohonásobně početnějších neinfikovaných buněk Provádí se za použití PCR na DNA nebo cDNA cizirodých organismů Konvenční diagnostické metody -vypěstování organismu v kultuře -detekce přítomnosti organismů za použití protilátek Časově náročné Někdy málo citlivé Molekulárně - genetická diagnostika • Diagnostika infekcí HIV Přítomnost virová RNA naznačuje aktivní infekci Lze prokázat provedením PCR za použití cDNA jako templátu vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk Tuberkulóza Pomocí PCR prokazován některý z vysoce konzervativních genů mykobakterií pomocí primerů připraveným k těmto sekvencím Amplifikovaný fragment je hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný kmen Lze detekovat je 10 bacilů na 10000000 eukaryotických buněk Molekulární diagnostika geneticky podmíněných chorob Srpkovitá anemie mutace E6V v HBB genu Cystická fibróza mutace F508del v CFTR genu Huntingtonova chorea, Myotonická dystrofie, Fragilní X nestabilní expanze trinukletidových repeticí Hemofilie A velka inverze v genu pro faktor 8 Duchennova muskulární dystrofie 60-70% mutací tvoří velké delece Tay-Sachsova choroba inzerce 4pb v exonu 11 genu HEXA Lebrova optická atrofie mitochondriální mutace nukleotidu v pozici 3460, 11778, 14484 Amplifikace úseku s předpokládanou delecí detekce delecí Restrikční analýza PCR produktu mutací vzniká nebo zaniká specifické místo v DNA, rozlišované restikčním enzymem Hybridizace PCR produktu s alelově specifickými oligonukleotidy detekce bodových mutací PCR s alelově specifickými primery (ARMS test) detekce bodových mutací PCR s primery ohraničujícími předpokládané delece v DNA úspěšná amplifikace odhalí přítomnost specifické přestavby v DNA Analýza teploty tání PCR produktu pomocí real-time PCR změna teploty tání v porovnání s pozitivní a standartní kontrolou odhalí specifickou sekvenční změnu Triplet Primed PCR detekce expanze trinukleotidových repeticí v DNA Multiplex Ligation Probe Amplification MLPA detekce rozsáhlých delecí a duplikací, vhodná pro stanovení SNP genotypů a testovanání metylací v promotorové oblasti genů Metody detekce znMetody detekce znáámých mutacmých mutacíí (scoring)(scoring) detekce určité kauzální mutace pro danou chorobu specifickou metodou Přímá DNA diagnostika •• Metody pMetody přříímméého vyhledho vyhledáávváánníí neznneznáámých mutacmých mutacíí (scanning)(scanning) postupnpostupnéé nebo multiplexnnebo multiplexníí screenovscreenováánníí úúseksekůů genugenu asociovanasociovanéého s danou chorobou pomocho s danou chorobou pomocíí vyhledvyhledáávacvacííchch metodmetod odhalí jakékoliv odchylky v analyzované sekvenci DNA pacienta ve srovnání se standartní sekvencí neodliší patogenní a nepatogenní změny v sekvenci DNA jsou náročnější časově i finančně Přímá DNA diagnostika Jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA neohaluje pozici změny Denaturační gradientová elektroforéza (DGGE) vysoká citlivost nutné primery s GC-clampy neodhaluje pozici změny Heteroduplexní analýza (HD) jednoduchá metoda doporučuje se pro krátké sekvence DNA omezená citlivost neodhaluje pozici změny Detekce zkráceného proteinu (PTT) vysoká citlivost pro terminační mutace pouze pro terminační mutace odhaluje pozici změny Analýza teploty tání na real-time PCR, HRM vysoká citlivost doporučuje se pro sekvence cca 250 bp neodhalí pozici změny Sekvenování detekce veškerých změn v DNA nadbytek informací plně charakterizuje mutace Metody pMetody přříímméého vyhledho vyhledáávváánníí neznneznáámých mutacmých mutacíí (scanning)(scanning) Scoring RYR1 kauzálních mutací Scanning RYR1 genu Restrikční analýza ARMS Hybridizace Analýza teploty tání (Real-time PCR) Vyhledávací metody (SSCP,DGGE, DHPLC) Přímé sekvenování Identifikace dosud nepopsanIdentifikace dosud nepopsanéé mutacemutace ?????? PPřříímmáá DNA diagnostikaDNA diagnostika Aby mohla být sekvenční varianta detekována k prediktivnímu genetickénu testování potřeba nezávislého důkazu, že je patogenní •genetická charakterizace - aspekty evoluční konzervace - kosegregace mutace s chorobou v nejméně 2 rodinách - absence u 100 zdravých kontrol (<1%) •funkční charakterizace -rekombinantní in vitro exprese na definovaném genetickém pozadí -zkouška funkce proteinu s charakterizovanou mutací v ex vivo tkáních PPřříímmáá DNA diagnostikaDNA diagnostika neznneznáámmáá mutacemutace –– kauzkauzáálnlníí mutace???mutace??? Databáze DNA laboratoří v ČR http://www.uhkt.cz/nrl/db Mezinárodní databáze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim http://www.eurogentest.org/web/ http://www.genetests.org/ http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/index.php VyVyššetetřřovanovanéé genovgenovéé chorobychoroby