Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR) QF-PCR Kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (QF-PCR) představuje metodu vhodnou k rychlé diagnostice nejčastějších aneuploidií a umožňuje okamžitý management patologických těhotenství QF-PCR Při analýze se využívá PCR amlifikace chromozom-specifických polymorfních STR markerů. Metody využíváme v prenatální i postnatální diagnostice a analýze potracených plodů Klasické metody vyšetření Vyšetření karyotypu (hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu) Klasické metody vyšetření Karyotyp • je soubor všech chromosomů v jádřě buňky. • V buněčných jádrech určitého druhu je konstantní do počtu, velikosti i tvaru chromozómů a jako takový se používá jako druhový znak • je jeden ze základních objektů cytogenetiky hodnocení barvených metafázických chromozomů v optickém mikroskopu) Vyšetření karyotypu • základní metodou vyšetření karyotypu (nejen) v rámci prenatální diagnostiky chromozomálních aberací Výhody • možnost prohlédnout celý karyotyp, zhodnotit strukturu každého jednotlivého chromozomu - a i jejich počet. Nevýhody • časová náročnost klasické vyšetření karyotypu vyžaduje kultivaci získaných buněk ve speciálním médiu, což výrazně prodlužuje dobu, která uplyne mezi samotným odběrem vzorku a vydáním výsledku. - amniocentéza či odběr choriových klků je nutné počítat v průměru s minimálně dvoutýdenní lhůtou (výsledky CVS bývají obecně o něco dříve díky většímu růstovému potenciálu choriových buněk). - kordocentéza má v tomto případě značnou výhodu rychlého zpracování vzorku (obecně jen několik dní), neboť je odebírána fetální krev (velký růstový potenciál lymfocytů). • omezená schopnost detekovat určité chromozomální přestavby malého rozsahu (například mikrodelece) • určovat původ marker chromozomů apod. V této oblasti pak nastupují metody molekulární cytogenetiky jako je například FISH (fluorescent in-situ hybridization fluorescenční in-situ hybridizace). QF-PCR - nová metoda neboli kvantitativní fluorescenční polymerázová řetězová reakce (Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction) • speciální aplikací klasické PCR metody, sloužící k namnožení definovaného úseku DNA. • V rámci prenatální diagnostiky se lze také setkat s označením amnioPCR (v souvislosti s amniocentézou - jako metodou, použitou k získání vzorku). • Tato metoda umožňuje vyloučit / potvrdit numerické odchylky vybraných chromozomů a to v extrémně krátkém časovém období jednoho, maximálně dvou dnů. • Nejčastěji jde o chromozomy, jejichž numerické abnormality tvoří většinu (cca 90 %) chromozomálních aberací: 13, 18, 21, X a Y. QF-PCR • Ze vzorku AMC, CVS se pomocí některé ze standardních metod nejprve izoluje DNA. • Polymerázová řetězová reakce-PCR QF-PCR Pro vlastní PCR metodu jsou připravené speciální „kity" s fluorescenčně značenými primery. Tyto primery ohraničují specifické lokusy na příslušných chromozomech (13, 18, 21, X a Y), které se pro potřeby této metody též označují jako markery. Jedná se o takové úseky, které obsahují vysoce polymorfní sekvence mikrosatelitní DNA - krátké tandemové repetice STR (Short Tandem Repeats). QF-PCR Metoda PCR amplifikuje STR oblasti a vytváří fluorescenčně značené amplikony za pomocí lokus specifických primerů QF-PCR Multiplex PCR QF-PCR 7 markerů pro diagnostiku chromosomu 21 7 markerů pro diagnostiku chromosomu 18 7 markery pro diagnostiku chromosomu 13 7 markerů pro diagnostiku chromosomů XY. Multiplex PCR QF-PCR • Vzniklé PCR produkty jsou separovány a analyzovány pomocí automatického genetického analyzátoru. • Relativní množství každé STR alely je kvantifikováno pomocí výpočtu poměru obsahu píků, příp. jejich výšek. • STR se liší mezi jedinci velikostí, podle toho, kolikrát se opakují trojice, čtveřice nebo pětice nukleotidů. QF-PCR • V případě diploidie, je signál dvou alel 1:1, když se jedná o homozygota, pak jeden peak s dvojitým signálem. • Při trizomii dostaneme signál 2:1, 1:2, nebo 3 peaky 1:1:1. • Chybějící chromozom X u Turnerova syndromu je detekován pomocí poměru X vs. 7. chromosom. U normální ženy je tento poměr 1:1, u postižené je 1:2. QF-PCR • DNA amplifikovaná z normálního heterozygotního jedince (má alely s různou velikostí)pro specifickou STR sekvenci bude mít dva píky s odlišnou délkou v daném rozsahu • DNA amplifikovaná z trinomických jedinců vykáže buď další pík (tři různé alely) se stejnou plochou nebo jen dva píky (dvě různé alely), z nichž jeden má dvojnásobnou plochu, než ten druhý Trizomický troj-alelický marker (poměr ploch 1:1:1) Trizomický dvoj-alelický marker (8.3: poměr ploch 2:1; 8.4: poměr ploch 1:2) Heterozygotní marker (poměr ploch 1:1) QF-PCR •QF-PCR Homozygotní jedinci (mají alely se stejnou délkou) nebo monozomní vykážou pouze jeden pík Homozygotní/monozomní marker Jedinci homozygotní nebo monozomní jsou největším problémem pro testování abnormalit pohlavních chromozomů. Pokud použijeme STR specifické pro chromozom X, některé vzorky z normální ženy XX můžou vykázat homozygotní QF-PCR výsledek, který nelze odlišit od vzorků s jediným X, jako při Turnerově syndromu. Začleněním dalších STR markerů chromozomu X do analýzy redukuje pravděpodobnost homozygotnosti, ale neeliminuje ji zcela.Problém monosomie X řeší 7X marker pro relativní kvantifikaci chromozomů 7 a X. Pro normální ženu je poměr 7X 1:1 Pro normálního muže a ženu s monosomií X je typický poměr 2:1 Normální muž s poměrem 7X 2:1. .Normální žena s poměrem 7X 1:1. . Artefakty QF-PCR •Stutter píky jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jednu nebo několik repetic menší, než aktuální STR alela. Typický stutter pík má obsah menší, než 15% vůči příslušnému STR píku. . •-A píky (obr. 8.9) jsou detekovány jako samostatné píky, které jsou o jeden pár bazí kratší, než PCR produkt s plnou délkou (+A pík) -A +A QF-PCR Typical electrophoretogram (Mix 1) showing the profile of a trisomic sample (47, XY +21) Hodnocení QF-PCR Výhody QF-PCR •odstraňuje nutnost opakovat některé testy s nejasným výsledkem (jako u kayotypizace), protože je každý syndrom analyzován pomocí mnoha STR současně. •pro každý chromozom jsou zahrnuty i velmi krátké STR úseky, díky nimž lze analyzovat i částečně degradovanou DNA. •test odhalí kontaminaci mateřskými buňkami, není nutné analyzovat současně vzorky rodičů. •test zjistí i případný mosaicismus •detekce Turnerova syndromu •reagencie v alikvotech zjednodušují použití a snižuje možnost kontaminace •. analýza trvá méně než 5 hodin, takže lze mít výsledky ještě týž den. • Hands-on doba je cca 90 minut