Definice genového inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů nebo přípravou nových („nepřirozených") kombinací genů a jejich zaváděním do genomu organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu a vytvářet tak geneticky modifikované anebo transgenní organismy. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (klonování genů a jejich úpravy) a cílené změny genetické informace prováděné in vivo Aplikace Gl: moderní (molekulární) biotechnologie Genové inženýrství (sylabus přednášky 2013) 1. Osnova přednášky, definice genového inženýrství a jeho stručná historie, studijní literatura. Mutageneze in vitro (metody založené na restrikčních místech, metody založené na mutagenních oligonukleotidech, kazetová mutageneze, využití modifikovaných tRNA) 2. Optimalizace exprese klonovaných genů (faktory ovlivňující expresi genů v cizích hostitelích; úroveň transkripce, translace, export proteinů) 3. Klonování genů v grampozitivních bakteriích 4. Klonování genů v kvasinkách 5. Klonování genů v rostlinách 6. Klonování genů v živočišných buňkách, vektory pro přenos genů do savčích buněk, selekční markery pro vyhledání klonů obsahujících cizorodou DNA 7. Vnášení genů do zárodečných buněk myší, příprava transgenních savců 8. Cílená exprese cizorodých genů v buňkách a tkáních vyšších organismů 9. Opravy dědičných defektů u zvířat metodami genového inženýrství 10. Genová terapie u člověka - základní principy 11. Příprava farmakologicky významných látek v prokaryotických a eukaryotických organismech. Využití metod rekombinantní DNA k přípravě vakcín a protilátek. Identifikace produktů rekombinatních genů. 12. Pravidla pro práci s geneticky modifikovanými organismy, zákon 78/2004 Sb., rizika Gl Doporučená literatura Watson J.D. a kol. Rekombinantní DNA, krátký kurz. Academia Praha 1988. Watson J.D. et al., Recombinant DNA, 2nd ed., W.H.Freeman, New York 1992. Old R.W., Primrose S.B., Principles of gene manipulation. An introduction to genetic engineering. Blackwell Science, 1995. 5. vydání. Strachan T., Read A.P. Human Molecular Genetics, 3. Vydání. Garland Science, London 2004. Glick B.R., Pasternak J.J. Molecular Biotechnology, 3. vydání, ASM Press, Washington 2003. Reece R. Analysis of Genes and Genomes. Wiley 2004 Primrose S.B.,Twyman R.M. Principles of gene manipulation and genomics. Blackwell Publ., 2006, 7. vydání. Snustad D.P., Simmons M.J.: Genetika (překlad originálu Principles of Genetics), MU Brno, 2009 Základní metody: Šmarda J. a kol.. Metody molekulární biologie, Brno, 2005. Internetové zdroje, IS muni.cz Využití genového inženýrství Ve výzkumu: studium struktury, funkce a exprese genů (genomů) V praxi (Moderní biotechnologie): 1. Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu • vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier 2. Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících genů nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj. 3. Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů - vytváření geneticky modifikovaných n. transgenních organismů (GMO) • příprava mikroorganizmů pro biotechnologie, • zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) • genové terapie Předpoklady pro cílené genetické manipulace • Identifikovat geny a stanovit jejich funkce • Izolovat geny a cíleně je in vitro (in vivo) pozměňovat • Přenést vhodným způsobem upravené geny do původních nebo nepříbuzných organismů a zajistit jejich expresi (heterologní expresní systémy) Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství Poznání základních procesů přenosu genetické informace 1970 - izolace prvního restrikčního enzymu 1972 - příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 - začátek klonování genů 1975 - Asilomarská konference, moratorium NIH (1976) 1976 - první pravidla práce s rekombinantní DNA 1977 - první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 - sekvenování DNA 1978 - příprava lidského inzulínu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně), založení Genentech zavedení technik mutageneze in vitro - proteinové inženýrství příprava transgenních organismů (bakterie, kvasinky,rostliny, živočichové) 1980 - první pokusy o genovou terapii 1997 - klonování živočichů Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneza reverzní genetika*, genetika „naruby" klasická genetika DNA (genotyp) =^ fenotyp reverzní genetika * Reverzní genetika - „vypínání genů" navozování nulových mutací genů nebo potlačování jejich exprese (knokauty genů, transpozonová inzerční mutageneze, anti-sense RNA, RNAi) Mutageneze in vitro Mutace se vnášejí do vyizolované DNA (= in vitro) Typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: Výzkum: • Analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK • Objasnění funkce genů a regulačních oblastí Praxe: • Cílené změny aminokyselin v proteinech - příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství) • Příprava geneticky modifikovaných a transgenních organismů Nevýhody klasické mutageneze (chemické, fyzikálni, biologické mutageneze) 1. V organizmu může být zmutován kterýkoliv gen 2. Frekvence mutací v žádaném genu může být nízká 3. Žádaný fenotyp může být výsledkem mutací v různých genech 4. Rekombinační analýzou nelze zjistit, zda mutace v genu vznikla substitucí jedné báze, nebo delecí či inzercí Mutageneze in vitro Mutageneze in vitro náhodná manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneza in korporace chybných bazí vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA mutace lil GEN cílená oligonukleotidová mutageneza (umístění do konkrétního místa) syntéza genů (kazetová mutageneza) záměny bazí nebo kodonů cílené změny struktury proteinů Obecná strategie při mutagenezi in vitro 1. Klonování genu (sekvence DNA) určené k mutagenezi 2. Vlastní proces mutageneze in vitro 3. Selekce klonů obsahujících mutované geny (sekvence) 4. Stanovení funkce mutovaných genů 5. Ověření charakteru vnesené mutace (stanovení sekvence) Stanovení sekvence pozměněného genu Test for function using genelic screen or selection Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Vytváření mutací v restrikčním místě Štěpení EcoRI S1 nukleáza Exonukleáza Exolll -rozsáhlejší delece DNA polymeráza + dNTP ▲ Výběr dNTP - inzerce pouze vybraných bází i DNA ligáza Delece 4 bp Inzerce 4 bp Inzerční mutageneze pomocí linkem k vyhledání funkčních oblastí transpozonu Soubor náhodně linearizovaných molekul Vložený linker inaktivuje různé geny Tronsposon AmpR DNase I Mn2+ íons molecules > štěpení rekombinantní DNA na různých místech Introduce into E. coli Test for transposition Připojení EcoRI-linkerů (= vložení inzerce inaktivující zasažený gen) Selekce klonů se ztrátou transpoziční aktivity, např. vyhledání genu pro transponázu (oblasti, která je pro její funkci nezbytná) Chemická mutageneze bisulfitem HíVidlII Příprava ssDNA Cyíosiíi* Plazmidová dsDNA Síngle-sfrofided DNA Cyfosiie Urocil C — U T 1 1 1 G A A GC AT Urocil T Připojení primeru Proti U je začleněn A Odstranění poškozeného vektoru Vložení inzertů do nového vektoru Knihovna klonů obsahujících mutované inzerty Působení bisulfitem modifisd plůsmids DNA polymeráza, dNTP, replikace Vyštěpení mutovaných inzertů (HindlII-EcoRI) Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů 1. Klonování sekvence (genu) do vhodného vektoru (M13, fágemid, fasmid), izolace jednořetězcové formy rekombinantní DNA 2. Příprava syntetického oligonukleotidů (mutagenního oligonukleotidů) nesoucího žádanou mutaci (jeho sekvence je komplementární ke klonované sekvenci vyjma místa, do něhož má být mutace vnesena) 3. Připojení (přihybridizování) mutagenního oligonukleotidů in vitro 4. Dosyntetizování druhého (komplementárního) řetězce DNA-polymerázou, spojení DNA-ligázou 5. Transformace buněk E. coli heteroduplexní molekulou DNA, selekce mutantních molekul (příp. selekce in vitro a transformace mutantními molekulami DNA) 6. Pomnožení mutantní molekuly DNA v E. coli, ověření mutace stanovením sekvence DNA Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů syntéza druhého řetězce DNA-polymerázou selekce klonů s mutací rekombinantní dsDNA (fragment DNA klonovaný ve vektoru) I O O příprava jednořetězcové formy rekombinantní molekuly DNA (rekombinantní ssDNA) mutagenní oligonukleotid obsahující mutaci hybridizační připojení mutagenního oligonukleotidů přenos do buněk E.coíi a jejich replikace rodičovský fenotyp stanovení fenotypového projevu mutace Substituce delece inzerce A-T > A-C > G-C Zvýšení výnosu mutant začlenením uracilu do templátové DNA DNA klonovaná do M13 vektoru Přenos do kmene E. coli ung-, príprava ssDNA In vitro Prenos do E. coli ung+, selekce AmpR Většina kolonií obsahuje mutantní plazmid Řetězec s mutací (bez U) se replikuje ung- (uracil-N-glykozidáza-) (rep-) duí- (dUTPáza-) - zvýšení koncentrace U Do templátové DNA je začleněn U Pripojení mutagenního oligonukleotidu Replikace, ligace Řetězec standardního typu (templátový, materský) je degradován Ověření mutace stanovením sekvence DNA žádaná mutace Nitrocellulose Vyhledání mutantních klonů pomocí sondy -tou je značený mutagenní oligonukleotid X-ray film Mixture of colonies containing mutant and wild-type plasmids Make o replica filter Labeled probe ^^íto^j^^. hybridizes j^^^^^^bi ořroom %^r^^^l!8i^^ temperature to ^^^^^P^ both mutant and wild-type DNA Autoradi ography Mutants Wild-type missing Wash" at higher temperature Probe remains bound to mutant Probe dissociates from wild-type DNA Isolate mutant DNA from colony sonda Master plate Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů ampr pBR322 Afl III a Bglll DNA - Polymeráza DNA - Ligáza ampr Afl III tetr Netransformuje 2. selekce pomocí RE; cílová sekvence = GEN TETR 1 Afl NNACPuPyGTNN Bgl II NNAGATCTNN Připojení dvou primerů 1. Mutantní deleční oligonukleotid 2. Selekční oligonukleotid Bgl II I ampr Bglll ampr Deletovaný plazmid Bglll Transformace E. coli tet£ Izolace DNA i i Štěpení selekční RE Afl III tets Transformace výsev na AM P vyhledání klonů TET* Komerční soupravy pro snadné vytváření mutací a selekci Methylation i i Melhytatwl = \ I š plasmíd 5 i Mutagenní oligonukleotidy } Mutagenesis In vitro recombination reaction Transformation } } Plasmid template PCR Reagents Methyl Transferase Reagents I PCR sample 10X Enzyme Mix Reactior buffer Add 1 uL 0.5 M EDTA to stop the reaction Use 2 uL of recombination reaction sample for transformation Incubate on ice for 15 minutes Heat shock 1or 30 secords Add 250 ul SOC Recover for 1 hour at 37X Methylate pi as mi rj DNA and amplify the pasmid in a mutagenesis reaction with tv/o overlapping primers containing the laryel mutation Perform the in vitro recombination reaction, which enhances the colony output 3- to 10-fold Transfomn the sample into DH5a™-T1n competent E coli. The host cell circularizes the linear mutated DMA, and McrEC endonuclease in the host cell digests the methylated tanplate DNA, leaving only unmethylated, mutated product Modifikace subtilizinu se změněným požadavkem na kofaktory (postupná mutagenze pomocí mutagenních oligonukleotidů) nativní subtilizin vyžadující Ca Vysoká enzymová aktivita Ztráta aktivity po deleci domény vázající Ca Mutantní varianty s nízkou aktivitou Kombinace mutantních variant: vysoká aktivita i bez navázaného Ca Kazetová mutageneze Hindi II EcoRI I Clegve with Hmďlll and FcoRI Remove small fragment Two synthetic oligonucleotides. Wild-iype DNA Hindlll Wild-type EcoRI DNA Transform E. coli All colonies contain mutant plasmid Syntéza genů postupným spojováním kratších oligonukleotidů DNA sequence or amino acid sequence DNA ligase ■^^B Isolate double-stranded HB^I^IH DNA molecule Express recombinant protein in B. ee/i Mutageneze pomocí kazet tvořených mutantními „doped" oligonukleotidy dna synthesizer A bottle G bottle c bottle T bottle a a _g g c c .TI S a a t g g icc At t ata gag cac tCt a a G ké „kontaminované" zásobní roztoky nukleotidů Wild-type sequence ggt tacaaac T Mutont oligonucleotides ,gg|iacaaact ,gBt tacaaact 'gg|t a|aaac t ggttacaaact -•ggt taca|ac t\ Wild-type ggttacaaabt / oligonucleotides Ligare Transform £*. coli Prepare pigsmid DNA from each colony r Skríning např. fágovým displayem 546 klonů 224 wt 218 - lx subst. 104 - více subst. Wild-type plasmids and mutants with multiple substitutions Plasmids containing a single nucleotide change Test for function Mutageneze pomocí „doped" oligonukleotidů Oligonukleotid obsahující inosin pro zajištění párování s náhodnými nukleotidy/kodony kodony pro různé aminokyseliny Oligonukleotid obsahující dva náhodné kodony Arg Glu lie T CGA GAA ATC -> CTT TAG *** Glu Met *** Glu Ala Val Ser Met NNg GAG ATG NNg GAA GCG GTT AG C ATG •4- III CTC TAC III CTT CGC CAA TC Kazeta s dvěma náhodnými kodony AGCT GTAC Xhol Sphl N = kterýkoliv ze 4 nukleotidů NTG/C = hydrofóbní aminokyseliny (fenylalanin, izoleucin, leucin, methionin a valin) Alternativní způsob nasyntetizování druhého nukleotidu PCR Záměna helixu v represorovém proteinu mutagenezou in vitro (příklad kazetové mutageneze) 434R expression vector (o) Trcnscriptíciíci! terminator Transform F. co/j 434 repressor P22 repressor Promcier [b) Duel ---Gl^Thr-G! 434 a helix 3 P22 a helix 3 P22-5pecific hybrid a helix 3 Kpn\ site Připravená kazeta Záměna aminokyselin v doméně represoru zodpovědné za rozpoznání operátoru P22 pefe) site C TCT AAT OTT TCG ATC T CG CAG_Č_TC GAA CGC GGG AAA AC Výhody PCR • jednoduché provedení • možnost vytváření různého typu mutací • není nutná následná selekce pro zvýšení proporce mutant • nezávislost na RE místech • není vždy nutné následné klonování mutovaného genu do vektoru (po PCR je možný přenos amplikonu do buněk transformací) Vytváření náhodných mutací = „error-prone" PCR I-5' • využívají se DNA-polymerázy 1 bez korektorské funkce ▼ 3—5' „ _ , 3—5 3'-5' 5' (např. Taq-polymeráza) i Errorprone • reakční podmínky PCR lze změnit ^ PCR t tak, aby se počet chyb zvýšil a aby I S % každý amplifikační produkt 5; x 3; obsahoval jednu mutaci 3 * 5, (např. zvýšení Mg++ nebo přidání & I' Mn++, koncentrace reakčních 5'-*-3' složek atp) 5; k 3; • nevýhoda: převaha určitého typu 5 mutace (např. transice, zatímco 5' x 3' 3'-*-5' transverze nevznikají) 5'-*-x-3' Využití PCR k vytváření mutací in vitro 5' 3' Z' 5' Místo, do něhož má být vnesena mutace Reakce Primer 2 5' 3' Reakce 2 5' 3' -X- 3' 5' 5' 3' Primer 4 3'— 5\ Primer PCR -1 Vznik dvou PCR-produktů nesoucích mutaci 5-^3-Primer 3 3' 5' I PCR 5' 3' 3' 5'Í 3' 5' Primery 2a3 = mutagenní primery Nemůže dojít k prodloužení od 5'konců klonování 5' 5' 3'- -Ä-3' 3'-A— 1 Smíchání, denaturace a rehybridizace 3' tzv. neproduktivní spojení 5' produktivní spojení Prodloužení DNA-polymerázou a PCR-amplifikace pomocí primerů 1 a 4 3' 5' Vnášení mutací pomocí PCR mutagenesis— --:-——---,——(-J r '\"":" Vložená sekvence (extenze primeru na jeho 5'konci) (extenze jsou vzájemně komplementární) ftatíon changes insertions ths nssrtion can be / iorger than the overlap ý 0V9r|ap extension; \ product AD with insertion I I ! ^ deletions ^ \ 5' end of 'c' matches here Toverlap extension __1 V inner segment deleted Deletovaná sekvence (extenze jsou komplementární k sekvenci vedle místa delece) Amplifikace „produktivních" spojení pomocí primerů a a d Náhrada části genu sekvencí z příbuzného genu Gen A analogie mutagenního oligonukleotidu Gen B Sekvence genu A Sekvence genu B I ^Sticky feet' Denature and hybridize Sticky feeť <— 5' Single-strand vector Polymerase plus ligase + original vector Část genu B je nahrazena částí genu A Konstrukce genu pro chimérickou protilátku Light chain Y2b heavy chain IgG Y2b j CH2 domain YiCH2 domain Expression vector for heavy chain Make containing single stranded DNA Does not activate -4 complement Gene for heavy chain (Y2b isotype) Sticky foot- Polymerase chain reaction ^ ^y— pgr 4 400 bp „ Primers Antibody with chimeric heavy chain Activates complement Heat to denature strands ike uracil- \v Jf inina sinale-^^^^ Coexpress in mammalian cells with light chain Těžký řetězec typu y2b zodpovídá za lyži buněk závislou na komplementu Protilátka s těžkým řetězcem y1 tuto lyži nenavozuje. Která oblast y2b za tuto vlastnost zodpovídá? Doména CH2 y2b 1 Transform ung+ E. coli Isolate mutant DNA Doména CH2 odpovídá za aktivaci komplementu pro lyzu buněk Chimérický těžký řetězec Inzerce abnormálních aminokyselin do proteinu supresí amber mutace in vitro s využitím chemicky modifikovaných tRNA Mutagenesis -> Vytvoření amber kodonu AGC TAG (amber) Transkripce in vitro Translace in vitro Supresorová tRNA s navázanou chemicky modifikovanou aminokyselinou 1 Mutantní forma proteinu (lysozym aktivovaný světlem) Table 4.4 Nonsense Suppressors Employed to Generate Altered Proteins Suppressor efficiency <%) References A. přirozené Sul (supD) UAG Serine 6-54 a, b Su2 (sup£) UAG Glutamine 0.8-20 a, b SU2-89 [supE) UAG Glutamine 32-60 c, h Su3 (iupf) UAG Tyrosine 11-100 a, b Su5 (supG) UAA UAG Lysine 0.2-2 6-30* a, b, h h Su6 (supP) UAG Leucine 30-100 a, e Su9 UGA Tryptophan 0.1-30 •a,f B. Uměle připravené tRNA cuA UAG Phenylalanine 48-100 g UAG 85% Glutamic acid 15% Glutamine 8-100 h,i UAG Cysteine 17-51 g tRNAcuA UAG Histidine 16-100 h, i tRNA cca* UAG Proline 9-60 h,i tRNA tuk UAG Lysine 9-29 h,i tRNA UAG Alanine S-S3 h,i tRNA UAG Glycine 39-67 h,i FTORI 26 UAG Arginine 4-28 4-47* J h Příklad: 160 variant genu pro lysozym s amber mutacemi na různých místech poskytlo v supresorových kmenech 2 000 variant lysozymu Vytváření mutací in vitro přímo na plazmidech (QuickChange) E. coli dam+ Smíchání plazmidu s primery nesoucími mutaci, syntéza komplementárních řetězců Štěpení ▼ Dpnl ▼ 1 ( »i Přenos do E. coli jako templát je využita dsDNA plazmidu po proběhnutí PCR se vytvoří dva komplementární řetězce nesoucí mutaci ve stejném místě, které jsou schopny se párovat za vzniku kružnice s posunutými zlomy po proběhnutí PCR jsou produkty štěpeny Dpnl, která je schopná štěpit jen metylovanou DNA rodičovské molekuly DNA jsou metylovány, neboť plazmidy byly izolovány z dam+ kmenů E. coli - proto jsou Dpnl rozštěpeny (odstranění rodičovského templátu bez mutace). nově syntetizované molekuly nejsou metylovány a tudíž nejsou štěpeny po transformaci do E. coli dojde k reparaci zlomů a nově nasyntetizované plazmidy obsahující mutaci se replikují