Aplikace genového inženýrství – příprava farmakologicky nebo průmyslově významných látek • Hormony, • Růstové faktory • Vakcíny, • DNA-vakcíny • Protilátky, • Abzymy, • Imunotoxiny • Další biologicky aktivní látky (interferon, krevní srážecí faktory aj) Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin preprohormon proinzulin prohormon aktivní inzulin zralý hormon DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B Beta-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor Příprava lidského růstového hormonu (hGH) v bakteriích Met není u přirozeného hGH Příprava formy hGH sekretované v bakteriálních buňkách Příprava tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) P T Amplifikace genů tPA tPA Štěpení plazminogenu plazmin Degradace fibrinu – rozpouštění krevních sraženin Komerční výroba Příprava podjednotkové vakcíny viru HBV v kvasinkách Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu Product Company Therapeutic indication Date approved Příklady rekombinantních vakcín (vakcín obsahujících rekombinantní antigeny) Přehled hlavních typů vakcín A. vakcíny vyrobené tradiční technologií: - živá vakcína -- virulentní (dnes se již nepoužívá) -- heterologní -- atenuovaná - inaktivovaná vakcína -- celobuněčná -- toxoidová - subjednotková -- s purifikovaným antigenem -- se syntetickým antigenem -- ribozomální B. rekombinantní vakcíny: - subjednotková -- s deletovaným genem -- vektorová C. DNA vakcíny D. antiidiotypové vakcíny - Vakcína připravená z protilátek, které považují jiné protilátky za antigen a navážou se na ně. Antiidiotypové vakcíny mohou stimulovat organizmus k vytváření protilátky proti nádorovým buňkám Vazba na receptory mukózy vlastní toxin Struktura choleratoxinu Strategie pro vytvoření delece části peptidu A1 choleratoxinu – příprava kandidátního vakcinačního kmene Vyštěpení části sekvence kódující peptid A1 (klonované v plazmidovém vektoru) – vyštěpí se ~ 90% aminokyselin) Cirkularizace vektoru (připojení XbaI-linkeru, štěpení XbaI, ligace) Přenos vektoru do kmene, v němž je uvnitř genu pro A1 začleněn gen pro rezistenci k tetracyklinu (A1 je inaktivován, buňky jsou TetR) – potenciální reverze A1 vyčleněním tetR – proto není vhodný jako vakcína Vektor se po několika generacích spontánně vyředí Selekce buněk TetS, obsahujících deletovanou formu A1 – tyto buňky tvoří složku A2 a B, a jsou proto imunogenní – reverze není možná Vibrio cholerae Příprava podjednotkové vakcíny proti HSV v buňkách CHO (chinese hamster ovary) Glykoprotein D (gD) imunogenní složka HSV HSV – onkogenní virus, sexuálně přenosná onemocnění, encefalitida, infekce oka Membránově vázaná forma, Úprava genu pro plášťový glykoprotein (gD) HSV pro získání rozpustné formy gD Kompletní gen pro gD obsahující C-terminální úsek kódující transmembránovou doménu – tato forma gD je obtížně purifikovatelná V genu pro gD byla oblast kódující transmembránovou doménu deletována, výsledný produkt je rozpustný a lze jej snáze purifikovat Klonování a exprese genu v savčích expresních systémech (CHO) Využití patogenního druhu Shigella flexneri jako živého vektoru k přenosu DNA pro genetickou imunizaci do savčích epiteliálních buněk Exprese klonovaného genu v cytoplazmě (!euk. P), tvorba produktu, imunizace β-semialdehyd dehydrogenáza Perorální podání Buňky invadují do epiteliálních buněk, ale nemnoží se – vhodný vektor pro přenos DNA Patogenní bakterie – nelze použít k vnesení imunizační DNA ~ nepatogenní bakterie Bakterie není patogenní, nemnoží se, plazmid přechází do cytoplazmy host. buněk Plazmidová DNA s genem pro antigen Deleční mutant Struktura protilátky Fab (antigen binding fragment) Fc Fv Papain (hydrolýza) Stejný primer pro všechny Kombinace milionů klonů pro těžké a pro lehké řetězce Klonování cDNA pro přípravu rekombinantních protilátek Soubor cDNA pro těžké řetězce Lymfocyty získané z imunizované myši (přeskupené geny) Soubor degenerovaných 5´-primerů klonovaná cDNA pro těžký řetězec, stejným způsobem se klonuje cDNA pro lehký řetězec Příprava specifické protilátky Příprava milionů cDNA nesoucích informaci pro L a H řetězce Amplifikace genů pro L a H řetězce pomocí PCR, klonování do fágového vektoru Každý fág obsahuje náhodnou kombinaci L a H Soubor fágů představující kombinatorickou fágovou knihovnu Překlonování do expresního savčího nebo bakteriálního vektoru Miliony „monoklonálních“ protilátek Příprava kombinatorické knihovny VL- a VH- oblastí protilátek v E. coli ve vektoru lambda Lidské B-lymfocyty PCR cDNA H a L řetězců mají odlišná místa pro různé RE, což umožňuje jejich oddělené klonování Mnoho různých kombinací – každý „kombinatorický vektor“ obsahuje jednu kombinaci. selekce Využití v diagnostice/terapii Překlonování vybraných kombinací do plazmidu (fág buňky lyzuje a není možné získat větší množství produktu) Konstrukce kombinatorické knihovny Fv ve vektoru bakteriofága lambda cDNA řetězců L a H separátně klonované ve vektorech lambda (knihovny L-řetězců a H-řetězců) Ligace jednotlivých L a H řetězců a jejich klonování v lambda vektoru Vytvoření kombinatorické knihovny Fv protilátek ve vektoru fága M13 (fágemidech) Klonováním do genu 3 vzniká fúzní protein, který je lokalizován na povrchu fága Spojovací peptid Selekce (ELISA-like) • Lidské chromozomy v hybridomech vytvořených po fúzi lidských lymfocytů s myšími myelomovými buňkami jsou nestabilní, takže se takové hybridomy produkující monoklonální protilátky vytvářejí jen vzácně • Nejsou k dispozici linie lidských myelomových buněk, které by mohly nahradit myší myelomové buňky při tvorbě hybridomů • I kdyby bylo možné vytvářet lidské hybridomové buněčné linie, bylo by to proti lékařským etickým zásadám (injikování specifických antigenů do člověk za účelem jiným než terapeutickým, a odběr části sleziny pro získání lymfocytů) Transgenní myši s geny pro lidské imunoglobuliny v YAC (jejich vlastní geny pro Ig knokautovány, pak imunizace, např. tetanotoxinem – tvoří lidské protilátky) Důvod pro přípravu humanizovaných protilátek: obtížná příprava lidských monoklonálních protilátek konvenční hybridomovou technologií Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské CDRs -complementarity determining regions Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou scFv - single chain antibody variable region fragments (SCA) scFv – terapeutické agents – nové vazebné schopnosti, nižší imunogenicita v důsledku chybění Fc domény, snadnější penetrace do cílového místa (pevné nádory atp). Linker je nutný pro vytvoření konformace schopné vázat antigen Disulfidické můstky (glycin4serin)3 a) b) c) Imunotoxin = MAB s navázaným toxinem (ricin, difterický toxin aj) Date of approval Type of antibody Company Therapeutic use Some therapeutic monoclonal antibodies that have been approved for human use in either the United States or European Union Terapeutické protilátky Aktivace plazminogenu na plazmin, degradace fibrinu Figure 10.16 Structure of an immunotherapeutic thrombolytic agent. Antifibrin antibody, a monoclonal antibody that is specific for the fibrin found in blood clots, is coupled to plasminogen activator (PA). After the complex binds to the fibrin of a blood clot, the plasminogen activator causes plasmin to accumulate in the vicinity of the clot. The plasmin then degrades the clot. Struktura imunoterapeutické trombolytické protilátky. Antifibrinová protilátka (monoklonální protilátka specifická pro fibrin, který se nachází v krevní sraženině) je vázána s aktivátorem plazminogenu (PA). Když se protilátka naváže na fibrin, PA vede k akumulaci plazminu v blízkosti sraženiny. Plazmin (proteáza fibrinolyzin) pak degraduje krevní sraženinu. Schematické znázornění struktury „single-chain“ Fv imunotoxinů (scFv) Záměna peptidového linkeru za disulfidický můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití - exotoxin A Pseudomonas - difterický toxin - ricin Protinádorové působení (vazba na receptory a povrchové proteiny nádorových buněk) Např. fúzní protein HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1 A B human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product. 10-25 aa • An abzyme (from antibody and enzyme), also called catmab (from catalytic monoclonal antibody), is a monoclonal antibody with catalytic activity. Molecules which are modified to gain new catalytic activity are called synzymes. Abzymes are usually artificial constructs, but are also found in normal humans (antivasoactive intestinal peptide autoantibodies) and in patients with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus, where they can bind and hydrolyze DNA. Abzymes are potential tools in biotechnology, e.g., to perform specific actions on DNA. • Enzymes function by lowering the activation energy of the transition state, thereby catalyzing the formation of an otherwiseless-favorable molecular intermediate between reactants and products. If an antibody is developed to a stable molecule that's similar to an unstable intermediate of another (potentially unrelated) reaction, the developed antibody will enzymatically bind to and stabilize the intermediate state, thus catalyzing the reaction. Abzym (Ab-enzym) catmab (catalytic monoclonal antibody) Reaction course Energy Hydrolýza esteru Snížení aktivační energie enzymem nebo abzymem Fosfonátový ester Izolace celkové mRNA RT-PCR cDNA Amplifikace variabilních oblastí L a H řetězců Klonování a skríning Příprava protilátky s enzymovou aktivitou (abzymu) Konjugace analogu k nosičovému proteinu Přenos DNA: • biolistická metoda: rekombinantní plazmid (E. coli) nesoucí gen pro antigen pod kontrolou virového promotoru je vnesen např. do boltce myši • injekce velkých množství DNA (100 mg rek. plazmidu) přímo do svalů zvířat – účinnost přenosu až 70% • elektroporace Výhody: • antigen je správně posttranslačně upraven a není třeba jej purifikovat • na jednom plazmidu mohou být v jednom kroku přeneseny geny pro více antigenů Nevýhoda: • neznalost osudu přenesené DNA v buňkách, začlenění do genomu hostitele a přerušení genů – proto je výhodnější transientní exprese (extrachromozomální stav) Příklady virových antigenů: chřipka, HIV, bovinní HV, vzteklina, HBV, rotavirus, slintavka a kulhavka, aj. Bakteriální antigeny: Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Genetická imunizace - DNA vakcíny Gen kódující antigen je vnesen do buněk zvířete, v nichž je pak tento antigen produkován a zvíře vytváří protilátky. A. Využití mutageneze in vitro pro záměnu klíčových aminokyselin (bodové mutace) • zvýšení termostability proteinů (lysozym aj) • rezistence proteinů k oxidativnímu stresu • zvýšení bioaktivity proteinů druhá generace farmak s vylepšenou farmakokinetikou, strukturou, stabilitou a biologickou dostupností (inzulin – zvýšení schopnosti absorpce, tkáňový plazminogenový aktivátoru – zvýšení poločasu oběhu) Příklad: Subtilizin – hydrolýza proteinů, např. v detergentech prakticky každá vlastnost této serinové proteázy byla pozměněna/optimalizována: • rychlost katalýzy, • substrátová specifita, • tolerance k pH, • tolerance k oxidačním látkám, • termostabilita. • zvýšená stabilita v org. rozpouštědlech (změna konformace proteinu) Proteinové inženýrství Navrhování, vyvíjení a příprava proteinů s vylepšenými charakteristikami (pozměněné nebo zcela nové proteiny) • Klenowův fragment DNA polymerázy, který postrádá 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. • Přidání aminokyselin = stabilizace cizích proteinů v E. coli. • Zvýšení afinity proteinů k iontům kovů vložením sekvence His-X3-His do alfa-helixu – zvýšení rezistence k denaturaci. • Jeden gen je fúzován s druhým za vzniku kompletně nového proteinu. Varianty protilátek – jednořetězcové protilátky (SCA – single chain antibodies) jsou umělé protilátky složené z vazebných oblastí těžkého a lehkého řetězce, které jsou spojeny chemicky a vytvářeny v mikroorganismech pomocí expresních vektorů. • Příprava purifikovaných imunogenních složek v prokaryotických nebo eukaryotických systémech (vakcína proti hepatitidě B ve kvasinkách, vakcína proti Salmonella typhimurium – oslabení kmene vnesením mutace do genomu) • Nepatogenní mikroorganismy použité jako vektory pro expresi cizích genů zodpovědných za imunogenicitu (rekombinantní vakcíny, které stabilně exprimují cizí geny: u Vibrio cholerae byl připraven kmen s delecí v genu pro cholerový toxin – mutace byla vnesena rekombinací do standardního kmene. Výsledný kmen produkoval imunogenní, avšak netoxický „toxin“ (netoxickou B podjednotku toxinu). • viry jako vektory pro expresi imunologicky aktivních proteinů (virus vakcinie – rekombinantní vakcíny proti vzteklině) B. Makromodifikace proteinů Část genu se eliminuje vyštěpením restrikčního fragmentu nebo nahradí chemickou syntézou části genu. • Genetickou úpravou lze připravit bakterii, která by produkovala modré barvivo používané na džínovinu. Výroba barviva by byla mnohem ekologičtější nežli současná chemická syntéza, která ročně produkuje asi 16 000 tun tohoto barviva. • Podle evropské legislativy budou muset být takové džíny na viditelném místě označeny nápisem: "Vyrobeno z geneticky modifikovaných organismů". Genové inženýrství Genové inženýrství se zabývá vytvářením pozměněných či nových genů a jejich zaváděním do organizmů s cílem rekonstruovat jejich genetickou výbavu. Metodickým základem genového inženýrství jsou manipulace s DNA in vitro (zejména klonování genů a jejich cílené úpravy). Objevy, které umožnily cíleně manipulovat s DNA restrikční endonukleázy a další enzymy rozštěpení DNA v přesně definovaném místě spojení dvou cizorodých DNA (DNA z různých organismů) syntéza DNA ve zkoumavce sekvenování DNA stanovení molekulární struktury genu klonování genů zavedení genu do nepříbuzných organismů (překonání mezidruhových barier) pomnožení genu do neomezeného množství cílené zavádění mutací do genu studium projevu pozměnených genů (mutace funkce) Etapy vzniku a vývoje genového inženýrství 1965 – objev plazmidů 1970 – izolace prvního restrikčního enzymu 1972 – příprava prvních rekombinantních molekul DNA in vitro 1973 – začátek klonování genů 1975 – Asilomarská konference 1977 – první rekombinované molekuly DNA nesoucí savčí geny 1977 – sekvenování DNA 1978 – příprava lidského inzulinu v bakteriích (od r. 1982 vyráběn komerčně) **** mutageneze in vitro – proteinové inženýrství **** příprava transgenních organismů (rostliny, živočichové) 1980 – genové terapie 1997 – klonování živočichů Využití genového inženýrství - Základní výzkum: studium struktury a funkce genů a genomů - Praktické aplikace: Příprava látek významných v lékařství, zemědělství a průmyslu vnášení cizorodých genů do nepříbuzných organizmů a získávání produktů ve velkém množství - překonání reprodukčních barier Příprava látek s novými vlastnostmi pozměňováním stávajících nebo vytvářením nových genů - enzymy, protilátky, vakcíny aj. Pozměňování a zlepšování vlastností organizmů příprava mikroorganizmů pro biotechnologie, zvyšování výnosů kulturních rostlin a užitkovosti hosp. zvířat (odolnost vůči chorobám, škůdcům nebo zevním vlivům, produkce cizích látek v tělech rostlin a zvířat) Genová terapie - léčba genetických chorob transformace elektroporace infekce mikroinjekce nastřelení Cizorodá DNA Klonování genů pomocí vektorů Klonování genů pomocí PCR Konstrukce (lidské) genomové knihovny © Espero Publishing, s.r.o. Soubor klonovaných fragmentů genomové DNA, které dohromady reprezentují celý genom příslušného organismu. Cizorodá DNA Klonovaná cizorodá DNA Rekombinantní molekula DNA Selekční marker Příprava rekombinantních molekul DNA Štěpení vektoru restrikční endonukleázou, spojení vektoru a cizorodé DNA enzymem DNA-ligázou Mutageneze in vitro site-directed mutagenesis místně cílená (řízená) mutageneze lokalizovaná mutageneze Mutace se vnášejí do izolované DNA (= in vitro) typy mutací: substituce, delece, inzerce Cíle: analýza vztahu mezi strukturou a funkcí NK Objasnění funkce genů a regulačních oblastí Cílení změny aminokyselin v proteinech Příprava proteinů s novými vlastnostmi (proteinové inženýrství) Příprava transgenních organismů DNA (genotyp) fenotyp klasická genetika reverzní genetika reverzní genetika, genetika „naruby“ Mutageneze in vitro Mutageneze in vitro náhodná cílená manipulace s restrikčními místy inzerce linkerů chemická mutageneza inkorporace chybných bazí vyhledání genu nebo funkčních oblastí na DNA oligonukleotidová mutageneza (umístění do konkrétního místa) syntéza genů (kazetová mutageneza) záměny bazí nebo kodonů cílené změny struktury proteinů GEN mutace Způsoby používané při mutagenezi in vitro 1. Manipulace s restrikčními místy a enzymatické úpravy DNA 2. Oligonukleotidová mutageneze (extenze primeru) 3. Chemická mutageneze 4. Kazetová mutageneze 5. Metody založené na PCR 6. Mutageneze pomocí supresorových tRNA Stanovení sekvence pozměněného genu Testování funkce pozměněného genu Obecná strategie při mutagenezi in vitro Vytvoření mutace Vytváření inzercí nebo delecí v sekvenci genu Vytváření mutací v restrikčním místě exonukleáza výběr dNTP Substituce delece inzerce GGT A CTCT CCA C GAGT CCACGAGT T GGTACTCT GGTGCTCT CCACGAGT GGT A CTCT CCA T GAGT Mutageneze pomocí mutantních oligonukleotidů Mutageneze pomocí mutagenních oligonukleotidů Rodičovská (nemutantní) DNA Nově syntetizovaná (mutantní) DNA Nově syntetizovaná mutantní DNA Mutagenní oligonukleotid Dvojřetězcová heteroduplexní DNA mutantní homoduplex Přenos do E. coli rodičovský homoduplex „umělý“ gen Kazetová mutace Proteinové inženýrství Cíl: změna struktury a funkce proteinů prostřednictvím technologie rekombinantní DNA změny vazebných oblastí proteinů termostabilita rychlost a substrátová specifita reakcí citlivost k oxidaci a toxickým látkám Předpoklady pro vytváření funkčních proteinů klonovaných genů 1. Transkripce genu přítomnost funkčních regulačních oblastí pro transkripci promotor, terminátor 2. Translace přepisu genu přítomnost signálů pro translaci SD, iniciační a terminační kodon výběr kodonů pro tRNA daného organizmu 3. Posttranslační modifikace 4. Transport proteinu signální sekvence funkční v daném hostiteli Zajištění exprese cizorodých genů bakteriální gen eukaryotický gen P RBS/transport kódující oblast T P/E RBS/transport kódující oblast cDNA Syntéza DNA de novo Hybridní (chimerický) gen Fúzní protein zralý proteinštěpení, purifikace Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin (preprohormon) proinzulin (prohormon) aktivní inzulin (zralý hormon) DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B β-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu Příprava podjednotkové vakcíny viru hepatitidy B (HBV) ve kvasinkách Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské CDRs -complementarity determining regions Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou Jednořetězcové protilátky a imunotoxiny Záměna peptidového linkeru za disulfidický můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití - exotoxin A Pseudomonas - difterický toxin - ricin Protinádorové působení (vazba na receptory a povrchové proteiny nádorových buněk) Např. fúzní protein HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1 A B human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product. Přenos cizích genů do rostlin pomocí Ti-plazmidu Živné medium s růstovými faktory Transgenní rostlina přenášející geny do potomstva Protoplast disky Ti-vektor nesoucí cizí gen T-DNA Využití genového inženýrství u rostlin A. Potraviny a krmiva Ovlivňování agronomických vlastností Rezistence k herbicidům Rezistence k patogenům (hmyzu, virům, plísním apod.) Tolerance ke stresům (vodní stres – sucho, mráz; osmotický stres – zasolení půd) Modifikace posklizňových vlastností Prodloužení skladovatelnosti Zpomalení zrání a navození rezistence k skládkovým chorobám Vylepšování nutriční hodnoty a chuti Využití genového inženýrství u rostlin B. Produkce sekundárních metabolitů Studium a přenos genů pro klíčové enzymy biosyntetichých drah Farmakologické přípravky C. Technické plodiny Produkce škrobu a olejů pro průmyslové využití Biodegradovatelné plasty D. Fytoremediace Transgenní rostliny A. Rezistence k virům Zavedení genu pro plášťový protein VTM do Ti-plazmidu, přenos do tabáku, rajčat Vakcína je multivalentní, působí na jiné virózy B. Rezistence k hmyzím škůdcům Vnesení genu pro endotoxin z Bacillus thuringiensis působícího na hmyzí škůdce (BT-rostliny: kukuřice, tabák, brambor, aj.) Nepřímý způsob – naklonování genu pro tvorbu toxinu do bakterií kolonizujících rostliny (listy, kořeny) – např. Pseudomonas fluorescens C. Rezistence k herbicidům Např. glyfozátu (nejpoužívanější neselektivní herbicid) inhibuje enzymy tvorby esenciálních aminokyselin 1. Vnesení genu pro tvorbu cílového enzymu (větší množství zajistí odolnost rostlin) 2. Vnesení genu pro tvorbu pozměněného (méně citlivého) enzymu 3. Vnesení genu pro tvorbu enzymu, který inaktivuje herbicid Transgenní rostliny D. Vylepšení nutričních hodnot plodů a semen nebo rostlinných produktů využívaných průmyslově Rajče FlavrSavr fy Calgene – transgen: antisense mRNA genu pro polygalakturonidasu – prodloužená konzumní zralost Rýže – vhodná pro alergiky Řepka – olej ze semen obsahující zvýšený podíl kys. Laurové (mýdla a detergenty) Řepka – olej ze semen bohatý na myristát (kosmetika) nebo kys. Eruková (mazadla a výroba nylonu) Arabidopsis a řepka – tvorba biodegradovatelných polymerů v chloroplastech využitelných jako plasty (polyhydroxybutyrát, polymery podobné polyesteru ve vláknech bavlníku) E. Produkce vakcín rostlinami („jedlé vakcíny“) Syrová zelenina obsahující antigen (vakcínu), který indukuje tvorbu imunoglobulinů mukózního imunitního systému v zažívacím traktu Povrchový antigen viru hepatitidy B Podjednotka B toxinu cholery Bt-rostliny Rostliny rezistentní k hmyzím škůdcům Promotor Ligace Binární vektor Terminátor Bacillus thuringiensis Klonovaný gen pro toxin Štěpení restrikčními enzymy Fragment genu kódující aminokyseliny 454-615 Přenos do Agrobacterium Infekce rostlin Regenerované transgenní rostliny exprimující vysoké hladiny Bt toxinuNapadení larvami hmyzu List z rostliny, usmrcující larvy, zůstává nepoškozen List z kontrolní rostliny je napaden Syntetický gen pro toxin kódující aminokyseliny 1-454 Transgenní BT-kukuřice Obsahuje navíc dva až tři geny: 1.Gen(y) podmiňující odolnost rostlin proti hmyzím škůdcům (bakteriální gen z Bacillus thuringiensis zodpovědný za tvorbu deltatoxinu, který je jedovatý pro některé skupiny hmyzu, ale zcela neškodný pro savce a člověka) 2.Gen pro odolnost vůči herbicidu Basta (jeden z nových herbicidů, který má krátkou životnost a je šetrný k prostředí). Gen pochází z bakterie Streptomyces. 3. Gen pro odolnost k antibiotiku ampicilinu (selekční marker použitý pro selekci transgenních rostlin (buněk) při jejich přípravě). Gen pochází z bakterie. Cíle studia přenosu genů do živočišných buněk 1. Studium funkce genů a způsobu jejich regulace 2. Příprava transgenních organismů studium fungování genů v rámci celého organismu příprava živočichů s cíleně upravenými geny modely pro studium genetických chorob příprava zvířat s lepšími užitkovými vlastnostmi, vytváření cizorodých proteinů hledání možností pro genovou terapii Způsoby přenosu cizích genů do savčích buněk DNA klonovaná ve vektoru nebo infekce virovým vektorem Sledování exprese mRNA v žabích oocytech Projádro transfekce DNA (Ca-korecipitace, elektroporace) Buňky ve tkáňových kulturách embryonální kmenové buňky infekce rekombinantním retrovirem náhrada jader Transgenní zvíře (+/- mozaikové) Začlenění DNA homologní rekombinací Selekce a přenos do blastocyst mikroinjekce DNA vývoj embrya v náhradní matce blastocysta infekce rekombinantním retrovirem mikroinjekce DNA Příprava transgenních savců Vytváření transgenních myší mikroinjekcí cizího genu do oplozeného vajíčka DNA SV40, tkHSV, lidský inzulin, B-globin, interferon Důkaz transgenu, např. PCR, in situ hybridizací Úspěšnost uchycení 10-30% exprese umlčení Až 40% potomstva obsahuje transgen začleněný náhodně, obvykle tandemově ve více kopiích v jednom chromozomu Manipulace s embryonálními kmenovými buňkami Terapeutické klonování, náhrada tkání a orgánů Vnesení genů Vrstva fibroblastů, LIF Transfekce, elektroporace, retrovirová infekce Příklady transgenních živočichů Zvířata (myši, drůbež, hospodářská zvířata, ryby) obsahující gen pro růstový hormon – rychlejší růst, změna vlastností produktů Přežvýkavci obsahující ve střevě GMO-mikroorganismy, které redukují toxicitu některých rostlin (rozšíření potenciálu krmiv) Drůbež s pozměněnými trávicími schopnostmi (celulóza, lignin, tuky) Drůbež se zvýšeným obsahem lysozymu ve vejcích (využití v průmyslu a farmakologii) Ovce s vylepšenou srstí Myši s pozměněnými nebo inaktivovanými geny studium lidských genetických poruch: neurodegerativní, imunitní, hormonální choroby, vliv faktorů na organismus faktorů (např. léků, mutagenů) studium poruch paměti Zvířata jako dárci orgánů pro transplantace (xenotransplantáty) orgány s pozměněnými antigeními vlastnostmi vhodné pro člověka Zvířata produkující cizorodé látky v mléce, moči, krvi nebo tkáních (animal farming: zvířata jako bioreaktory) Myš nesoucí gen pro lidský růstový hormon Zvířata jako bioreaktory: „animal farming“ Příklady látek vytvářených v transgenních zvířatech Antikoagulans krveLidský protein Cprase Léčba cystické fibrózyRegulátor CFTRovce, myš Léčba nanismuLidský růstový hormonkoza Náhražka krve při transfúzihemoglobinprase Navození srážení krveFaktor pro srážení krve VIII, IXovce Rozpouštění krevních sraženinTkáňový aktivátor plazminogenukoza Léčba rozedmy plicAlfa-1-antitrypsinovce VyužitíLátkaZvíře Klonování savců Možné způsoby léčby genetických onemocnění 1. Úprava diety - karenční terapie (galaktosemie, fenylketonurie) 2. Substituční terapie (hemofilie, diabetes, nanismus) 3. Genová terapie (kauzální léčba) vnesení funkčního genu (funkční alely) do genomu cílená záměna poškozeného genu homologní rekombinací cílené usmrcování geneticky pozměněných buněk cílená inhibice exprese genů zodpovědných za genetickou poruchu Genové terapie Léčba genetických chorob dědičných nádorových Podle typu buněk, do nichž jsou geny vneseny: A. genová terapie zárodečných buněk B. genová terapie somatických buněk Podle způsobu přenosu genů: A. genová terapie in vitro (ex vivo) B. genová terapie in vivo Příklady lidských chorob podmíněných monogenně a připadajících v úvahu pro genovou terapii v současnosti Genová terapie in vitro Vlastnosti buněk vhodných jako vektory pro zavádění genů do organismu 1. Snadné získání buněk z těla 2. Snadná kultivace v kulturách in vitro 3. Odolnost k manipulacím spojeným se zaváděním genů 4. Schopnost navrácení buněk do organismu, kde se musí pomnožovat přetrvávat po dostatečně dlouhou dobu Kmenové buňky kostní dřeně Kožní fibroblasty Hepatocyty Myelocyty Schéma postupu při genové terapii deficience na adenozindeaminázu Schéma genové terapie melanomu TIL = tumor infiltrující lymfocyty; TNFα = tumor nekrotizující faktor Viry jako vektory nejpoužívanější v GT, velmi dobře infikují lidské buňky. Asi 70% pokusů s GT Onkoretroviry: transgen začleňují do chromozomu do dělících se buněk výhoda při léčbě nádorů (např. nádory mozku). Riziko inzerční inaktivace endogenů Adenoviry: infikují nedělící se buňky, DNA zůstává jako epizom v jádře. Jsou bezpečné, ale exprese je krátkodobá. Problém je imunogenicita. Uplatnění tam, kde je nutná vysoká exprese během krátké doby, např při léčbě rakoviny pro zabití buněk. Adenoasociované viry AAVs: Nepatogenní, schopné infekce jen s využitím adenovirů jako pomocných virů k replikaci. Integrují DNA do chromozomu na specifické místo, umožňující dlouhodobou expresi bez rizika inzerční mutageneze. Lentiviry: HIV (retrovirus) – infikují nedělící se buňky. Do chromozomu se integrují náhodně - dlouhodobá exprese. Nutnost odstranění virových genů a zachování schopnosti infikovat nedělící se buňky. Herpes simplex viry: Mají tropii pro CNS, v latentní infekci jsou epizomální, tj. dlouhodobě exprimují transgen a šíří jej do okolní synaptické sítě. Hlavní úloha: přenos genů do neuronů pro léčbu nervových chorob (Parkinsonova ch.) a tumory CNS. Zábrana exprese genů navozená protismyslovou RNA Genová terapie nádorů 1. Dodání genu: obnova funkce nádorových supresorových genů 2. Inaktivace genu: zábrana exprese aktivovaného onkogenu 3. Genetická manipulace: vyvolání apoptózy nádorových buněk 4. Modifikace nádorové buňky tak, aby byla více antigenní a byla zničena imunitním systémem 5. Modifikace dendritických buněk ke zvýšení nádorověspecifické imunitní odpovědi 6. Použití geneticky upravených onkolytických virů selektivně usmrcujících nádorové buňky 7. Genetická modifikace nádorových buněk zajišťující konverzi netoxického prekurzoru na toxický produkt Příklady léčby nádorů pomocí genové terapie Použitá strategie genové terapie Genová terapie in vivo Do nádoru jsou injikovány buňky, do nichž byl in vitro vnesen retrovirový vektor, který obsahuje gen pro tymidinkinázu (TK). Vektor se uvolňuje a infikuje okolní nádorové buňky, v nichž se pak vytváří TK (retrovirus je schopen infikovat jen dělící se buňky!). Do těla pacienta je intravenózně podána netoxická látka gancyklovir (gcv), která je TK konvertována na toxický gancyklovir-trifosfát usmrcující nádorové buňky. Transpozony - mobilní genetické elementy Tvoří pravidelnou součást genomu prokaryot i eukaryot (až 50% genomu) Navozují mutace genů (inzerční inaktivace, polární mutace, změny exprese genů) Jsou zodpovědné za přestavby chromozomů nebo plazmidů (tvoří "přenosné" úseky homologie, podmiňující homologní rekombinace, interakce mezi složkami genomu) Přenášejí nové znaky (např. AntR, onkogeny) mezi organismy (horizontální přenos genů) Základní typy transpozonů a jejich klasifikace DNA-transpozony • Transpozony „cut and paste“ (prokaryota a eukaryota) – vyčlení se z původního místa a začleňují se do nového • Replikativní transpozony (prokaryota) – během transpozice se replikují (jedna kopie zůstává v půsovním místě, druhá se objeví v novém místě) - Konjugativní transpozony (bakterie) 3. Retrotranspozony (eukaryota) – během transpozice se transkripcí sekvence transpozonu vytváří RNA, která se převádí na DNA, která se pak začleňuje do nového místa - retroviry, - retrovirům podobné elementy, retrotropozony - retrony (bakterie) Struktura mobilních elementů bakterií Inzerční sekvence (IS) Složené transpozony (Tn) transponáza Příklady složených transpozonů bakterií Vedle místa začlenění Mobilní elementy u kukuřice (Ac/Ds) (Elementy B. McClintockové) Ac element Ds elementy Autonomní elementy schopné zajistit vlastní transpozici Neautonomní elementy schopné transpozice za přítomnosti Ac elementů Transpozice Ds elementu u kukuřice Funkční gen pro purpurovou barvu obilek Vyčlenění Ds elementu z genu zprostředkované transponázou Ac elementu Gen pro purpurovou barvu obilek přerušený transpozonem Znovunabytí funkce genu pro purpurovou barvu obilek v buňkách, v nichž došlo k vyčlenění transpozonu. Náhodnost procesu vyčlénění má za následek vznik skvrnitých obilek Transpozony u kukuřice Transpozony u Antirrhinum Mozaikovitost květu je způsobena pohyby transpozonů, které jsou začleněny do obou alel genu pro anthokyanin. Vyčlenění transpozonů vede k vytváření červených sektorů. Mobilní elementy Drosophila melanogaster - P elementy Transpozony navozující dysgenezi hybridů K transpozici dochází jen v zárodečných buňkách, kde se tvoří aktivní transponáza mariner – různé druhy drosofil, aj. Typy transpozice - intramolekulární - intermolekulární Mechanismy transpozice „cut and paste“ Vznik přímých repeticí v cílovém místě po začlenění transpozonu Cílové místo Vytvoření posunutých zlomů transponázou Doplnění komplementárních úseků Začlenění transpozonu do cílového místa Duplikovaná cílová sekvence transpozon Vznik kointegrátu Rozklad kointegrátu homologní rekombinací Nová kopie transpozonu Replikativní transpozice Mechanismus replikativní transpozice Chromozomová přeskupení navozená transpozony = transpozon Delece úseku mezi transpozony Inverze úseku mezi transpozony přímá opakování obrácená opakování rekombinace rekombinace Delece pozorované v místě začlenění IS1 v lokusu gal E. coli Úloha transpozonů při evoluci R-plazmidů - každý transpozon může být přenášen nezávisle (obsahují LTR) RT neautonomní nemají LTR Mobilní elementy kvasinek - Ty elementy LTR Enzymy zajišťující zpětnou transkripci a integraci DNA do nových míst v genomu Retrovirům podobné ellementy Retroelementy u drozofily Copia elementy Gypsy elementy F, G a I-elementy HeT-A, TART (telomere associated retrotransposons) – transpozice v telomerách, regenerace konců chromozomů ztracených při replikaci Inaktivní nejméně 50 milionů let Alu Transpozice neretrovirových retrotranspozonů (sekvence LINE 1) místně specifickou rekombinací Iniciační fáze, při níž endonukleáza (součást RT) připojená na L1 RNA štěpí cílovou sekvenci - uvolněná 3´OH skupina funguje jako primer pro reverzní transkripci - vytváří se ssDNA napojená na cílovou DNA. V dalším kroku se vytvoří dsDNA, která se začlení do cílového místa Mechanismus transpozice L1 v lidském genomu Vznik upravených pseudogenů Původní funkční gen Sestřih a připojení polyA Reverzní transkriptáza některé transkripty konvertuje na cDNA Vytvořená cDNA je začleněna do jiných míst genomu - vzniká pseudogen, který není funkční v důsledku chybění promotoru hnRNA mRNA DNA Retrotranspozice „homing retro-intronů“ skupiny II Intron začleněný v jedné z kopií genu kopie genu neobsahující intron Vytvoření enzymu s dvojí aktivitou Štěpení genu v cílovém místě dvouřetězcový zlom dsDNA kopie intronu Transpozice retrovirů nebo retrotranspozonů místně-specifickou rekombinací RNA RT Štěpení konců transpozonu integrázou Atak cílových sekvencí na chromozomu 3-12 nt HIV - Human immunodeficiency virus AIDS = acquired immune deficiency syndrom (syndrom získaného selhální imunity) Th-lymfocyt (+ další typy buněk virus je polytrofní) HIV-1 se váže na specifický receptor Th-lymfocytu, CD4 Vznik retrovirů přenášejících onkogeny retrovirus Inzerční aktivace protoonkogenu pomalu transformujícími retroviry nádor Transdukce onkogenu akutně transformujícími retroviry nádor Akutně a pomalu transformující retroviry po mnoha generacích mobilní elementy Vznik „odpadní“ DNA jako důsledek transpozice a následné inaktivace mobilních elementů Transpozony - mobilní genetické elementy Tvoří pravidelnou součást genomu prokaryot i eukaryot (až 50% genomu) Navozují mutace genů (inzerční inaktivace, polární mutace, změny exprese genů) Jsou zodpovědné za přestavby chromozomů nebo plazmidů (tvoří "přenosné" úseky homologie, podmiňující homologní rekombinace, interakce mezi složkami genomu) Přenášejí nové znaky (např. AntR, onkogeny) mezi organismy (horizontální přenos genů) Základní typy transpozonů a jejich klasifikace DNA-transpozony • Transpozony „cut and paste“ (prokaryota a eukaryota) – vyčlení se z původního místa a začleňují se do nového • Replikativní transpozony (prokaryota) – během transpozice se replikují (jedna kopie zůstává v půsovním místě, druhá se objeví v novém místě) - Konjugativní transpozony (bakterie) 3. Retrotranspozony (eukaryota) – během transpozice se transkripcí sekvence transpozonu vytváří RNA, která se převádí na DNA, která se pak začleňuje do nového místa - retroviry, - retrovirům podobné elementy, retrotropozony - retrony (bakterie) Struktura mobilních elementů bakterií Inzerční sekvence (IS) Složené transpozony (Tn) transponáza Příklady složených transpozonů bakterií Vedle místa začlenění Mobilní elementy u kukuřice (Ac/Ds) (Elementy B. McClintockové) Ac element Ds elementy Autonomní elementy schopné zajistit vlastní transpozici Neautonomní elementy schopné transpozice za přítomnosti Ac elementů Transpozice Ds elementu u kukuřice Funkční gen pro purpurovou barvu obilek Vyčlenění Ds elementu z genu zprostředkované transponázou Ac elementu Gen pro purpurovou barvu obilek přerušený transpozonem Znovunabytí funkce genu pro purpurovou barvu obilek v buňkách, v nichž došlo k vyčlenění transpozonu. Náhodnost procesu vyčlénění má za následek vznik skvrnitých obilek Transpozony u kukuřice Transpozony u Antirrhinum Mozaikovitost květu je způsobena pohyby transpozonů, které jsou začleněny do obou alel genu pro anthokyanin. Vyčlenění transpozonů vede k vytváření červených sektorů. Mobilní elementy Drosophila melanogaster - P elementy Transpozony navozující dysgenezi hybridů K transpozici dochází jen v zárodečných buňkách, kde se tvoří aktivní transponáza mariner – různé druhy drosofil, aj. Typy transpozice - intramolekulární - intermolekulární Mechanismy transpozice „cut and paste“ Vznik přímých repeticí v cílovém místě po začlenění transpozonu Cílové místo Vytvoření posunutých zlomů transponázou Doplnění komplementárních úseků Začlenění transpozonu do cílového místa Duplikovaná cílová sekvence transpozon Vznik kointegrátu Rozklad kointegrátu homologní rekombinací Nová kopie transpozonu Replikativní transpozice Mechanismus replikativní transpozice Chromozomová přeskupení navozená transpozony = transpozon Delece úseku mezi transpozony Inverze úseku mezi transpozony přímá opakování obrácená opakování rekombinace rekombinace Delece pozorované v místě začlenění IS1 v lokusu gal E. coli Úloha transpozonů při evoluci R-plazmidů - každý transpozon může být přenášen nezávisle (obsahují LTR) RT neautonomní nemají LTR Mobilní elementy kvasinek - Ty elementy LTR Enzymy zajišťující zpětnou transkripci a integraci DNA do nových míst v genomu Retrovirům podobné ellementy Retroelementy u drozofily Copia elementy Gypsy elementy F, G a I-elementy HeT-A, TART (telomere associated retrotransposons) – transpozice v telomerách, regenerace konců chromozomů ztracených při replikaci Inaktivní nejméně 50 milionů let Alu Transpozice neretrovirových retrotranspozonů (sekvence LINE 1) místně specifickou rekombinací Iniciační fáze, při níž endonukleáza (součást RT) připojená na L1 RNA štěpí cílovou sekvenci - uvolněná 3´OH skupina funguje jako primer pro reverzní transkripci - vytváří se ssDNA napojená na cílovou DNA. V dalším kroku se vytvoří dsDNA, která se začlení do cílového místa Mechanismus transpozice L1 v lidském genomu Vznik upravených pseudogenů Původní funkční gen Sestřih a připojení polyA Reverzní transkriptáza některé transkripty konvertuje na cDNA Vytvořená cDNA je začleněna do jiných míst genomu - vzniká pseudogen, který není funkční v důsledku chybění promotoru hnRNA mRNA DNA Retrotranspozice „homing retro-intronů“ skupiny II Intron začleněný v jedné z kopií genu kopie genu neobsahující intron Vytvoření enzymu s dvojí aktivitou Štěpení genu v cílovém místě dvouřetězcový zlom dsDNA kopie intronu Transpozice retrovirů nebo retrotranspozonů místně-specifickou rekombinací RNA RT Štěpení konců transpozonu integrázou Atak cílových sekvencí na chromozomu 3-12 nt HIV - Human immunodeficiency virus AIDS = acquired immune deficiency syndrom (syndrom získaného selhální imunity) Th-lymfocyt (+ další typy buněk virus je polytrofní) HIV-1 se váže na specifický receptor Th-lymfocytu, CD4 Vznik retrovirů přenášejících onkogeny retrovirus Inzerční aktivace protoonkogenu pomalu transformujícími retroviry nádor Transdukce onkogenu akutně transformujícími retroviry nádor Akutně a pomalu transformující retroviry po mnoha generacích mobilní elementy Vznik „odpadní“ DNA jako důsledek transpozice a následné inaktivace mobilních elementů