Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Studium buněk
v podmínkách in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 20.2.2013
doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
10 µm
fibroblasty v buněčné kultuře
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
• vývoj kultivací buněk in vitro
• podmínky kultivace eukaryontních buněk
in vitro
• typy kultivací (terminologie)
• vlastnosti normálních a transformovaných
buněčných linií
• praktické aplikace
• archivace, sbírková pracoviště
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
VÝVOJ KULTIVACÍ
BUNĚK IN VITRO
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
• 1907: kultivace nervových vláken izolovaných
z žabích embryí (Harrison)
• 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a
srdeční svaloviny (Carrel; Burrows)
• 1916: trypsinizace a pasážování (Rous & Jones)
• 1943: stabilizace první buněčné linie -myší
fibroblasty: L-cells (Earle et al.)
• 1948: první buněčný klon - L929 (Sanford et al.)
• 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom
děložního krčku: HeLa (Gey et al.)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.)
• karcinom děložního krčku
• Henrietta Lacks (1920-1951)
• Johns Hopkins University Hospital (Baltimore, USA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Linie HeLa:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
mikrotubuly (anti-Tu)
mikrofilamenta (phalloidin)
jádra (DAPI)
Linie HeLa:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
KULTIVAČNÍ PODMÍNKY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Kultivační podmínky pro savčí a lidské buňky
• co nejpodobnější podmínkám v původním
organismu:
 teplota 37oC,
 maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2
 neutrální pH (6,8 až 7,2)
 živiny
• sterilní prostředí
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Stabilní prostředí pro kultivace
CO2 inkubátory
• definovaná stabilní teplota (37oC)
• maximální vlhkost vzduchu
• definovaný stabilní obsah CO2 (5%),
příp. i O2 (řízená hypoxie)
• vodní nebo vzduchový plášť
• vnitřní povrch: měď nebo nerez
• připojení tlakových lahví přes redukční ventily
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bazální médium
• tekuté nebo práškové
• soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdroj
energie, indikátor pH
+ krevní sérum / růstové faktory
Kompletní médium
ŽIVNÉ MÉDIUM
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Voda pro tkáňové kultury:
• ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm
• TOC (total organic carbon) < 10 ppb
(parts per bilion)
Úprava vody pro tkáňové kultury:
• reverzní osmóza
• absorbce na aktivní uhlík
• iontoměniče
• elektrodeionizace
• UV záření
SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Vyvážené solné roztoky (BSS, balanced salt solutions):
• udržování pH a osmolality
• udržování membránového potenciálu buněk
• kofaktory enzymů
• tvorba fokálních adhezí (růst na pevném substrátu)
• ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4
2-, PO4
3-, HCO3
•
stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se …
Hlavní typy BSS:
DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)
HBSS (Hank's balanced salt solution)
EBSS (Earle's balanced salt solution)
ESSS (Eagle's spinner salt solution)
SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Pufrovací systém:
• NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulphonic
acid)
Aminokyseliny:
• esenciální, resp. vzácné (člověk, myš):
arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin,
fenylalanin, threonin, tryptofan, valin
• in vivo syntetizované ve specifických orgánech
(játra, resp. ledviny):
cystein, glutamin, tyrosin
• lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké
peptidy)
SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
• voda
• anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky)
• aminokyseliny
----------------------------------------------------------------
• vitamíny (zejména skupina B)
• lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…)
• hormony, růstové faktory (inzulín, hydrokortizol)
• glukóza (zdroj energie)
• fenolová červeň (indikátor pH)
• antibiotika (penicilin + streptomycin)
SLOŽENÍ BAZÁLNÍHO MÉDIA:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Krevní sérum:
• fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské...
• nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších
složek
• obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk
• bezsérová média pro speciální aplikace
(definovaná směs růstových faktorů - tzv. serum
replacement)
Nejdůležitější látky obsažené v séru:
• růstové faktory
• albumin
• transferrin
• anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin)
• attachment factors (fibronectin, laminin,
fetuin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Výhody použití séra:
• směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a
proliferaci buněk
• univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných
typů
• ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a
toxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů,
endotoxiny, proteolytické enzymy)
Nevýhody použití séra :
• potíže s reprodukovatelností (původ zvířat,
krmení, roční doba…)
• riziko kontaminace
• dostupnost a cena
• vliv na produkci proteinů do média
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Typy médií pro savčí buňky:
• Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace
(např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM)
• RPMI média
(např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640)
• další média užívaná se sérem
(např. Fischerovo, Williamsovo)
• média užívaná bez séra
(TC199, MCDB)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Sterilní prostředí
• práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry)
- typ podle úrovně Biosafety Level (BSL)
• jednorázový plastik
(sterilizováno radiací)
• sterilní sklo, nástroje a roztoky
(horkovzdušná sterilizace, autoklávování)
• antibiotika
(běžně směs Pen/Str, případně gentamycin,
amphotericin, nystatin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
BSL-1
• mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u
zdravých dospělých; standardizované lidské a
živočišné buněčné linie
BSL-2
• běžné patogeny středního rizika, mohou
způsobovat různě závažná onemocnění, která lze
dobře léčit (HBV, Salmonella, Toxoplasma, klinický
materiál - krev, tělní tekutiny, tkáně; některé
sbírkové linie - např. HeLa)
ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA
= BIOSAFETY LEVELS (BSLs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Laminární box - biohazard třída I
horizontální vertikální
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Laminární box - biohazard třída II
HEPA filtry
(částice > 0,3 mm)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
BSL-3
• lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika,
respiračně přenosné, způsobují závažná a
potenciálně letální onemocnění, která jsou obtížně
léčitelná
• Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St.
Louis, antrax
BSL-4
• extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné,
způsobují letální onemocnění, proti nimž
neexistuje léčba ani vakcinace
• hemorrhagické viry (Ebola, Marburg)
ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA
= BIOSAFETY LEVELS (BSLs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
BIOSAFETY LEVEL 3 (BSL-3)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
BIOSAFETY LEVEL 4 (BSL-4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Typy kontaminací
• mykoplazmata
• viry
• bakterie, plísně, kvasinky
• kontaminace jinou buněčnou linií
(cross-contamination)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Kontaminace – mykoplazmata
Detekce mykoplazmat:
a) fluorescencenční mikroskopie
(značení DNA)
b) PCR
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
KULTIVAČNÍ POSTUPY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
invertovaný mikroskop
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Typy buněčných kultur:
• adherované:
rostou přichycené na pevném podkladu
• suspenzní:
rostou volně v médiu
Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer):
• obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty,
peritoneální makrofágy)
• hybridomy, embryonální kmenové buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Suspenzní kultury
• odstranění starého média centrifugací
• naředění buněk v čerstvém médiu
• přenesení do nové kultivační lahvičky/misky
s čerstvým médiem
Adherované buňky
• odstranění starého média, oplach v pufru
• uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních
adhezí (trypsin)
• inaktivace trypsinu přidáním séra
• alternativa: mechanické uvolnění (škrabky)
• centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu
• přenesení do nové kultivační lahvičky/misky
s čerstvým médiem
SUBKULTIVACE (PASÁŽOVÁNÍ)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
DĚLENÍ BUNĚK
V PODMÍNKÁCH IN VITRO:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
TYPY KULTIVACÍ
(TERMINOLOGIE)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
TKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURES
• orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture)
trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která
si uchovává histologické znaky a vlastnosti
původní tkáně v prostředí in vivo
• buněčná kultura (cell culture)
kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už
nejsou spojeny do struktury tkáně
• primokultura / primární kultura (primary culture)
buňky v kultuře jsou získány přímo z původní
tkáně nebo fragmentu orgánu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
primokultura multiformního glioblastomu - 5. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
primokultura multiformního glioblastomu - 12. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
primokultura multiformního glioblastomu - 12. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Buněčná linie
• populace buněk odvozená z primokultury při
první pasáži a dále udržovaná v podmínkách in
vitro
(pasáž = přenos buněk z jedné kultivační
nádobky do nádobky nové)
• diploidní (normální nenádorové buňky)
• stabilizovaná (nádorově transformované buňky)
• charakterizace buněčné linie:
označení (název), druh organismu, pohlaví, věk,
výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové
parametry, morfologie, karyotyp, markery
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Buněčný kmen
• buněčná populace, získaná subkultivací
z původní linie - vyselektována na základě
exprese určitého znaku
Buněčný klon
• buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné
buňky, izolované z původní linie
• všechny buňky v buněčném klonu teoreticky
identické, avšak v praxi určitý stupeň
heterogenity
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
NORMÁLNÍ A TRANSFORMOVANÉ
BUNĚČNÉ LINIE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Růstové parametry buněčných linií:
• generační doba
období mezi dvěma mitózami = délka
buněčného cyklu
• population doubling time (PDT)
čas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v
populaci
• lifespan (délka života)
geneticky naprogramovaný počet dělení buňky
• kontaktní inhibice
zástava proliferace po dosažení určité limitní
saturační density
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Kontaktní inhibice
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Diploidní buněčné linie:
• normální nenádorové buňky
• omezená délka života in vitro
• standardní karyotyp (diploidní)
• obvykle anchorage-dependent
(vyžadují substrát k přichycení)
• schopnost kontaktní inhibice
• tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a
růstových parametrů se vzrůstající dobou v
podmínkách in vitro
• LEP (lidské embryonální plíce)
HPLC (lidské lymfocyty periferní krve)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Stabilizované buněčné linie:
• nádorově transformované buňky
• neomezený generační potenciál = nesmrtelnost
v podmínkách in vitro
• kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu
• obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní
• často bez schopnosti kontaktní inhibice
• lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7, Saos-2…
lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S…
L929, 3T3 (myší fribroblasty),
CHO (chinese hamster ovary)
MDCK (Madine-Darby canine kidney)
VERO (African green monkey kidney)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Rozdíl v počtu chromosomů během kultivace
normální buňky
(gliové buňky)
transformované buňky
(maligní melanom)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
PRAKTICKÉ APLIKACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
• základní výzkum (buněčná biologie,
cytogenetika, onkologie, imunologie, biochemie,
molekulární biologie, virologie…)
• prenatální diagnostika
• toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků,
implantátů
• reprodukční medicína (IVF)
• klinická onkologie (typizace nádorů, testování
multidrug resistance, hodnocení markerů)
• výroba očkovacích látek (virové vakcíny)
• průmyslová výroba specifických buněčných
produktů (transgenní linie)
• příprava buněčných a tkáňových derivátů (např.
kůže)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
KRYOKONZERVACE, ARCHIVACE,
SBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚ
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Kryokonzervace živočišných buněk
• kultura v exponenciální fázi růstu
• po trypsinizaci resuspendování v zamražovací
směsi:
90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum
(DMSO, glycerol)
• dvoustupňové zamražování:
"pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu)
"rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -8OoC do -
15OoC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC
(kontejnery s tekutým dusíkem)
• rozmražování:
nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak
pomalé přidávání vychlazeného média (cca 1ml za
minutu)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Příklady
kryoprotektiv:
glyceroldimethylsulfoxid
(DMSO)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Vliv rychlosti zamražování na přežití buněk:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
American Type Culture Collection (ATCC)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013
European Collection of Cell Cultures (ECACC)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2013