Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Asistovaná reprodukce
živočichů a klonování
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 20.3.2013
doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
• asistovaná reprodukce u živočichů
přehled a praktické aplikace
• klonování živočichů
partenogeneze
splitting techniky
klonování pomocí tvorby chimér
metoda transferu jader (SCNT)
tvorba cybridů
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
ASISTOVANÁ REPRODUKCE
U ŽIVOČICHŮ
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Inseminace u hospodářských zvířat:
• možnost kryokonzervace spermií (40. léta 20.
stol.)
• minimalizace počtu chovných býků
• experimenty s transplantací
spermatogonií: umělá
produkce vynikajících
plemeníků
• třídění spermií
(uplatnění v cíleném chovu skotu
na mléko nebo na maso)
úspěšnost ~90%
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Asistovaná reprodukce u hospodářských zvířat:
• hormonální stimulace  superovulace 
inseminace  výplach embryí  transfer embryí
(ET) / kryokonzervace embryí
• úspěšnost: 60-75% po transferu čerstvých embryí
35-45% po kryoembryotransferu
Ryuzo Yanagimachi (1998)
• experimenty s lyofilizací spermií
• nutnost ICSI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
In vitro fertilizace u hospodářských zvířat:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Obchodování s embryi skotu
• rychlé zkvalitnění chovu zvířat (aukce embryí)
• superovulace , inseminace , výplach embryí
(od 1 krávy 5-6 embryí, max. kolem 20)
• produkce embryí pomocí IVF
(odběr oocytů z těl krav na jatkách nebo živých
zvířat - opakovaně i během březosti)
Problémy u ostatních hospodářských zvířat:
• ovce, kozy - neekonomické
• prasata - problémy s polyspermií při IVF
• koně - nutnost ICSI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Teruhiko Wakayama a
Ryuzo Yanagimachi
(1998)
• vytváření funkčních
oocytů transferem
jádra z pólocytu u
myší (úspěšnost
metody 30-57%)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Snaha získat potomstvo od zvířat v co nejnižším věku
• hormonální stimulace nedospělých zvířat
(jehničky: 6 týdnů, jalovice: 2-6 měsíců)
• odběr oocytů z nenarozených samičích plodů
John Eppig (Jackson Lab)
živé potomstvo z primordiálních
oocytů kompletně kultivovaných in
vitro
(myšák Egbert)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
KLONOVÁNÍ ŽIVOČICHŮ
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Metody klonování živočichů
• partenogeneze
• splitting techniky
• tvorba chimér
• přenos jádra somatické buňky
(SCNT, Somatic Cell Nucleus Transfer)
• vnitrodruhové klonování
• mezidruhové klonování = tvorba cybridů
(= cytoplazmatických hybridů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
(1) PARTENOGENEZE
• přirozeně u bezobratlých (hmyz) i obratlovců
(ještěrky, hadi, ryby, obojživelníci)
Savci - aktivace partenogeneze in vitro:
• myš (forelimb bud stage), ovce, kráva, prase, králík
(11 dní), opice, primáti (implantační stádium)
• poruchy v regulaci diferenciace (extraembryonální
tkáně a mesoderm) – genetický imprinting
• životaschopné myši (partenoti) – rekonstruovaná
embrya ze dvou maternálních genomů
(Kono et al., Nature 428, 860-864, 2004)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Partenogeneze u člověka
• spontánně in vivo u některých typů germinálních
tumorů (teratomy ovarií)
• partenogenetický chimerismus u pacientů s
vývojovými nebo sexuálními poruchami
• indukovaná partenogeneze in vitro (stádium
blastocysty: 5-6 dní vývoje)
Cibelli et al., 2001
Advanced Cell Technology
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
(2) SPLITTING TECHNIKY
• rozdělení embrya během časných stádií vývoje
mikromanipulačními technikami
• 1892 – Hans Driesch (mořská ježovka)
1902 – Hans Spemann (žába)
• praktické aplikace v chovu skotu (v kombinaci s
dalšími metodami AR)
• úspěšnost při dělení na max. 4 části
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2000 - Gerald Schatten
• klonování makaka splitting technikou
• rozdělení embrya na 4 části:
1 živé mládě - samička Tetra
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
(3) KLONOVÁNÍ METODOU TVORBY CHIMÉR
• fúze embryonálních kmenových buněk = ESCs
(somatické buňky) s tetraploidním embryem:
tetraploidní buňky  trofoblast
diplodní ESCs  embryoblast
• Janet Rossant et al. (PNAS 1993): klony myší
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
(4) PŘENOS JÁDRA SOMATICKÉ BUŇKY (SCNT)
• jádro somatické buňky vneseno do enukleovaného
oocytu:
a) elektrofúze
b) intracytoplazmatická injekce diploidního jádra
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
tzv. dvojitá metoda klonování
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
• 50. a 60. léta 20.stol.:
experimenty na obojživelnících, rybách
• později SCNT embryonální buňky savců
• Dolly: poprvé SCNT buňky dospělého savce
(Ian Wilmuth et al. 1997, Roslin Institute, UK)
• dosud metodou SCNT naklonováno 19 druhů savců:
ovce, kráva, myš, koza, gaur (tur), prase, jelen,
muflon, mula, kůň, kočka, králík, potkan, fretka, pes,
bizon, vlk, pyrenejský kozorožec, velbloud
• neúspěchy při klonování primátů (poruchy
mitotického aparátu v důsledku enukleace)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Robert Briggs (A ; 1911-1983)
Thomas J. King (B ; 1921-2000)
1952 – SCNT u obojživelníků (žáby)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
1970: John Gurdon
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
1984 (1986) – Steen Willadsen
• poprvé klonování ovcí metodou SCNT
• jádro z buněk rýhujícího se embrya, enukleovaný
oocyt
???
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Dolly
1996 - 2003
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Dolly
Bonnie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
1998, Japonsko (Ishikawa):
• 2 klonovaná telata
• "Roslin method", druhé klonování dospělého savce
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
1998, USA (Honolulu, Hawai):
• myšák Fibro
• první samčí klon (fibroblasty ze špičky ocásku
dospělého samce)
Ryuzo Yanagimachi
Teruhiko Wakayama
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2000, USA (Virginia) – PPL Therapeutics:
• 5 klonovaných selat
• modifikovaná metoda (tzv. dvojitá)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2001, USA (Texas):
• kočka Cc (Copy cat, Carbon copy)
• "Roslin method"
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2003, USA (University of Idaho):
• mula – hřebeček Idaho Gem
• fetální fibroblasty muly, enukleované oocyty koně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2005, Korea (Seoul National University):
• štěně SNUPPY (= Seoul National University Puppy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2008 - první komerční klonování zvířat
• RNL Bio (South Korea) - zaváděcí cena 50 000 USD
• pitbull Booger • 5 klonovaných štěňat
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2008 – myš klonovaná z buňky mrtvé myši, která
byla zamražena 16 let při teplotě -20oC
• Wakayama et al. 2008, PNAS
• metoda: ntESCs + tetraploidní embryo
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2009, Spojené arabské emiráty:
• velbloudice Injaz
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2009, Jižní Korea: Ruppy (Ruby Puppy)
První klonovaný transgenní pes na světě:
• příprava transgenní linie psích fibroblastů (gen
pro RFP z mořské sasanky)
• reprodukční klonování s využitím této linie (SCNT)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
2009, Jižní Korea:
• štěně Ruppy (Ruby Puppy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Jang G, Kim MK, Lee BC:
Current status and applications of somatic cell nuclear
transfer in dogs.
Theriogenology 74: 1311-1320, 2010
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Březen 2013: Sériové "reklonování" myši
Wakayama et al.:Cell Stem Cell 12, 293-297, 2013
• ve 25 generacích celkem 598 klonovaných myší
• stejná efektivita klonování s využitím inhibitoru
histonových deacetyláz (TSA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Klonování metodou tvorby cybridů
Cybrid (cytoplazmatický hybrid)
• organismus / embryo vznikající vnesením jádra
somatické buňky jednoho živočišného druhu do
enukleovaného oocytu jiného druhu (SCNT)
• 2000 – muflon (• ovce), gaur (• kráva)
září 2007: v UK povoleno experimentování s cybridy
• vkládání jádra lidské somatické buňky do zvířecího
enukleovaného oocytu (kráva, králík)
• cílem izolace hESCs
• cybridy budou udržovány max. 14 dní in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Postup při tvorbě cybridů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013
Klonování metodou tvorby cybridů
• plejtvák sejval (Balaenoptera borealis) • prase
• krysa • prase
• makak • kráva
• šimpanz • kráva
• panda červená (Ailurus fulgens) • králík
• člověk • kráva, králík, koza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 5 / 20.3.2013