1
Bi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 A lik á b ěč á bi l iBi8120 Aplikovaná buněčná biologieBi8120 Aplikovaná buněčná biologie
ĚĚDIFERENCIACE BUNĚKDIFERENCIACE BUNĚK
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MU
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MUÚstav experimentální biologie PřF MU
2
Program přednášky:Program přednášky:
• diferenciační potenciál buněk
dif i č í d áh
• diferenciační potenciál buněk
dif i č í d áh• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• indukovaná diferenciace• indukovaná diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
3
Vývoj mnohobuněčného organismuVývoj mnohobuněčného organismu
• identický genom ve všech buňkách
• kontrola na úrovni genové exprese
• identický genom ve všech buňkách
• kontrola na úrovni genové exprese• kontrola na úrovni genové exprese
1. buněčná proliferace
• kontrola na úrovni genové exprese
1. buněčná proliferace1. buněčná proliferace
2. diferenciace buněk
3. buněčné interakce
1. buněčná proliferace
2. diferenciace buněk
3. buněčné interakce
4. pohyb buněk
5. buněčná smrt
4. pohyb buněk
5. buněčná smrt
Lidský organismus:
013 b ěk (2 0 ů ý h ů)
Lidský organismus:
013 b ěk (2 0 ů ý h ů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
1 zygota → 1013 buněk (250 různých typů)1 zygota → 1013 buněk (250 různých typů)
4
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
5
DIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚKDIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚKDIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚKDIFERENCIAČNÍ POTENCIÁL BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
6
Časná embryogeneze u savců:Časná embryogeneze u savců:y g
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
y g
• zygota
• morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
• blastocysta (~ 64 buněk)• blastocysta (~ 64 buněk)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
7
Blastocysta:
• trofoektoderm →
Blastocysta:
• trofoektoderm →
extraembryonální tkáně (placenta)
• inner cell mass (ICM) →
b
extraembryonální tkáně (placenta)
• inner cell mass (ICM) →
bembryo
Gastrulace → 3 zárodečné listy:
embryo
Gastrulace → 3 zárodečné listy:Gastrulace → 3 zárodečné listy:
• ektoderm (neurální a epidermální buňky)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
Gastrulace → 3 zárodečné listy:
• ektoderm (neurální a epidermální buňky)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
• endoderm (epitel vnitřních orgánů)
• mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
• endoderm (epitel vnitřních orgánů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
8
Ektoderm
• CNS
í i č čk
Ektoderm
• CNS
í i č čk• sítnice a čočky
• lebeční a senzorická ganglia a nervy
i t é b ňk
• sítnice a čočky
• lebeční a senzorická ganglia a nervy
i t é b ňk• pigmentové buňky
• pojivová tkáň hlavy
• epidermis
• pigmentové buňky
• pojivová tkáň hlavy
• epidermis• epidermis
• vlasy, ochlupení
• prsní žlázy
• epidermis
• vlasy, ochlupení
• prsní žlázy• prsní žlázy• prsní žlázy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
9
Mesoderm
• lebka a kostra
l á káň (l bk i k í l )
Mesoderm
• lebka a kostra
l á káň (l bk i k í l )• svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
• dermis
ji á tkáň
• svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
• dermis
ji á tkáň• pojivová tkáň
• urogenitální systém
• střevní svalovina
• pojivová tkáň
• urogenitální systém
• střevní svalovina• střevní svalovina
• srdce
• krevní a lymfatické buňky
• střevní svalovina
• srdce
• krevní a lymfatické buňky• krevní a lymfatické buňky
• slezina
• krevní a lymfatické buňky
• slezina
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
10
Endoderm
• žaludek
Endoderm
• žaludek
• tračník
• játra
• tračník
• játrajátra
• slinivka
• močový měchýř
játra
• slinivka
• močový měchýř• močový měchýř
• epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu, 
štítné žlázy, střev
• močový měchýř
• epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu, 
štítné žlázy, střevštítné žlázy, střevštítné žlázy, střev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
11
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
12
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál
Totipotence
• nelimitovaný diferenciační potenciál• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální 
tkáně
• nelimitovaný diferenciační potenciál
• schopnost tvořit embryonální i extraembryonální 
tkáně
• časná stádia rýhování zygoty (1‐4 dny)
Pluripotence
• časná stádia rýhování zygoty (1‐4 dny)
Pluripotenceu pote ce
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5‐14dní)
u pote ce
• schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
• buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5‐14dní)
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
Multipotence
• schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáněp y p yp
• např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální 
kmenové buňky…
p y p yp
• např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální 
kmenové buňky…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
13
totipotentní buňka
(zygota, blastomery)
totipotentní buňka
(zygota, blastomery)
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)(hematopetické kmenové)(hematopetické kmenové)
progenitorové buňkyprogenitorové buňkyprogenitorové buňkyprogenitorové buňky
i ál ě dif éi ál ě dif éterminálně diferencované 
buňky
terminálně diferencované 
buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
14
Rozdíl v diferenciačním 
potenciálu kmenových a 
Rozdíl v diferenciačním 
potenciálu kmenových a p ý
progenitorových buněk
p ý
progenitorových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
15
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 ‐ 1010 molekul)
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 ‐ 1010 molekul)• 5000 různých bílkovin (10 10 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických 
proteinů
• 5000 různých bílkovin (10 10 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických 
proteinů
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně nízké 
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně nízké 
úrovni ve všech buňkách organismu
• housekeeping proteins:
úrovni ve všech buňkách organismu
• housekeeping proteins:housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné 
komponenty
housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné 
komponenty
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
16
Příčiny diferenciace:Příčiny diferenciace:Příčiny diferenciace:
• postupné změny v aktivitě genů
Příčiny diferenciace:
• postupné změny v aktivitě genůpostupné změny v aktivitě genů
(programovány v genomu)
postupné změny v aktivitě genů
(programovány v genomu)
• odpověď na molekulární signály vysílané 
ostatními buňkami
• odpověď na molekulární signály vysílané 
ostatními buňkamiostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatními
ostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatnímiodpověď na fyzikální kontakt s ostatními
buňkami
odpověď na fyzikální kontakt s ostatními
buňkami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
17
Signály regulující diferenciaci
 Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
Rů t é f kt (TGF t f jí í ů t ý f kt• Růstové faktory (TGF‐transformující růstový faktor, 
FGF‐fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, A …)
• Ionty (Ca2+ )• Ionty (Ca , …)
 Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
 Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin, …)
 Polarita a tvar buněk Polarita a tvar buněk 
 Fyzikální parametry prostředí (teplota, parciální tlak O2, …)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
18
Molekulární mechanismy diferenciace
• nejdůležitějším místem regulace je iniciace
Molekulární mechanismy diferenciace
• nejdůležitějším místem regulace je iniciacenejdůležitějším místem regulace je iniciace 
transkripce
• vazba regulačních proteinů na specifické sekvence 
( l č í bl )
nejdůležitějším místem regulace je iniciace 
transkripce
• vazba regulačních proteinů na specifické sekvence 
( l č í bl )DNA (regulační oblasti)
• relativně malý počet strukturních motivů
DNA (regulační oblasti)
• relativně malý počet strukturních motivů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
19
Molekulární mechanismy diferenciaceMolekulární mechanismy diferenciace
• 2 základní mechanismy účinku regulačních proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a transkripčních 
faktorů na promotor
• 2 základní mechanismy účinku regulačních proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a transkripčních 
faktorů na promotorfaktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v oblasti 
promotoru
faktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v oblasti 
promotoru
• kombinace regulačních proteinů 
• u člověka asi 3000 TFs
• kombinace regulačních proteinů 
• u člověka asi 3000 TFsu člověka asi 3000 TFs
• ±5 TFs působí společně a reguluje transkripci jednoho 
genu
u člověka asi 3000 TFs
• ±5 TFs působí společně a reguluje transkripci jednoho 
genu
• jeden TF reguluje více genů (pozitivně i negativně)
• tkáňová specifita
• jeden TF reguluje více genů (pozitivně i negativně)
• tkáňová specifita
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
20
Zachování exprese genů po rozdělení buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
21
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
22
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
23
DIFERENCIAČNÍ DRÁHYDIFERENCIAČNÍ DRÁHYDIFERENCIAČNÍ DRÁHYDIFERENCIAČNÍ DRÁHY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
24
Diferenciace
buňky směřovány do určitého vývojového směru (linie) – tentobuňky směřovány do určitého vývojového směru (linie)  tento 
stav nelze měnit (například buňky erytroidní linie „nepřeskočí“ do 
linie myeloidní)
Dediferenciace
ztráta diferencovaného fenotypu
• je obvyklá in vitro (adaptace na kultivační podmínky)
• in vivo u nižších živočichů (regenerace obojživelníků)
• experimentálně – příprava iPS cellsexperimentálně  příprava iPS cells
Transdiferenciace
h t čitý h b ěk čité tká ě ( č t ě SC bschopnost určitých buněk určité tkáně (včetně SCs nebo 
progenitorů) diferencovat do buněk typických pro jiné orgány 
nebo tkáně (např. hematopoetické)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
25
Epigenetic landscape: H.C. Waddington (1957)
Epigenetic landscape: T. Graf & T. Enver (2009)
role transkripčních faktorů‐ role transkripčních faktorů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
26
Indukovaná transdiferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
27
Diferenciační 
potenciál 
Diferenciační 
potenciál 
hematopoetických 
kmenových buněk
hematopoetických 
kmenových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
28
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
29
Diferenciace 
krevních buněk
Diferenciace 
krevních buněk
‐ vliv růstových 
faktorů a jiných 
cytokinů
‐ vliv růstových 
faktorů a jiných 
cytokinůcytokinůcytokinů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
30
Vliv TFs na diferenciaci 
krevních buněkkrevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
31
Porucha diferenciace krevních buněk 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
32
Průběh neuronální diferenciacePrůběh neuronální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
33
Regulace neuronální 
d fdiferenciace 
TGF‐ superfamilyTGF  superfamily
• TGF‐  (1‐3)
• BMPs• BMPs
• nodal
• activin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
34
Neuronální diferenciaceNeuronální diferenciace
Kmenová buňka:
• nestin
Kmenová buňka:
• nestin
• GFAP
• DNA
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
35
Neuronální 
diferenciace
Neuronální 
diferenciace
Progenitorová 
b ňk
Progenitorová 
b ňkbuňka:
• ‐tubulin III
• GFAP
buňka:
• ‐tubulin III
• GFAPGFAP
• DNA
GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
36
Neuronální diferenciaceNeuronální diferenciace
Neurony:
• ‐tubulin III
Neurony:
• ‐tubulin III
• DNA

• DNA
Gliové buňky:
• GFAP
DNA
Gliové buňky:
• GFAP
DNA• DNA• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
37
Diferenciace příčně pruhované svalovinyDiferenciace příčně pruhované svaloviny
diferenciaci doprovází 
• zástava buněčného cyklu
ě f l i
diferenciaci doprovází 
• zástava buněčného cyklu
ě f l i• změna morfologie 
• fůze v syncytia
• změna morfologie 
• fůze v syncytia
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
38
Diferenciace příčně pruhované svalovinyDiferenciace příčně pruhované svaloviny
• svalové prekurzory exprimují mrf4, myf5 a myoD
• in vitro: po odstanění růstových faktorů se spustí diferenciace
• svalové prekurzory exprimují mrf4, myf5 a myoD
• in vitro: po odstanění růstových faktorů se spustí diferenciace
• exprese svalově specifických proteinů: 
myogenin, svalový aktin, myosin II, tropomyosin ...
• exprese svalově specifických proteinů: 
myogenin, svalový aktin, myosin II, tropomyosin ...
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
39
RŮSTOVÉ FAKTORYRŮSTOVÉ FAKTORYRŮSTOVÉ FAKTORYRŮSTOVÉ FAKTORY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
40
Růstové faktory (Growth Factors)Růstové faktory (Growth Factors)
• vazba na příslušný membránový receptor
• aktivace specifické intracelulární signální dráhy
• vazba na příslušný membránový receptor
• aktivace specifické intracelulární signální dráhy
• stimulace přežívání a růstu buněk (metabolismus, 
zvyšování objemu, antiapoptotické)
• některé fungují i jako mitogeny (např PDGF) resp
• stimulace přežívání a růstu buněk (metabolismus, 
zvyšování objemu, antiapoptotické)
• některé fungují i jako mitogeny (např PDGF) resp• některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF), resp. 
induktory diferenciace
• např. cytokiny, hormony (insulin), ... růstové faktory
• některé fungují i jako mitogeny (např. PDGF), resp. 
induktory diferenciace
• např. cytokiny, hormony (insulin), ... růstové faktory
CytokinyCytokiny
• signální proteiny ovlivňující buněčnou proliferaci, 
diferenciaci a imunitní odpověď 
(interleukiny G CSF GM CSF )
• signální proteiny ovlivňující buněčnou proliferaci, 
diferenciaci a imunitní odpověď 
(interleukiny G CSF GM CSF )
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
(interleukiny, G‐CSF, GM‐CSF...)(interleukiny, G‐CSF, GM‐CSF...)
41
Příklady růstových faktorůPříklady růstových faktorů
EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)
EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) 
→ aktivace RTK kaskády 
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) 
→ aktivace RTK kaskády 
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)y
• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
y
• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
• receptory FGFR1‐4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• receptory FGFR1‐4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie ‐ exprese HIF ‐> VEGF
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie ‐ exprese HIF ‐> VEGF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
42
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
43
TGF (Transforming Growth Factor)TGF (Transforming Growth Factor)TGF (Transforming Growth Factor)
• up‐regulace u některých typů nádorů
TGF (Transforming Growth Factor)
• up‐regulace u některých typů nádorů
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v 
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin) 
( k fá k é b ňk k )
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v 
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin) 
( k fá k é b ňk k )• TGF‐α (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty): 
vývoj epitelu ‐ příbuznost s EGF, vazba na EGFR
TGF  i f  1  2  3 dif i b ěk
• TGF‐α (makrofágy, mozkové buňky, keratinocyty): 
vývoj epitelu ‐ příbuznost s EGF, vazba na EGFR
TGF  i f  1  2  3 dif i b ěk• TGF‐ ‐ isoformy  1,  2,  3: diferenciace buněk, 
vývoj embrya, regulace imunitního systému, apoptóza
• TGF‐ ‐ isoformy  1,  2,  3: diferenciace buněk, 
vývoj embrya, regulace imunitního systému, apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
44
Neurotrofiny (Neurotrophins)Neurotrofiny (Neurotrophins)
• produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů, 
neuronální diferenciace
• produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů, 
neuronální diferenciace
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• NGF (nerve growth factor) 
• BDNF (brain‐derived
• NGF (nerve growth factor) 
• BDNF (brain‐derivedBDNF (brain derived
neurotrophic factor)
NT 3 ( hi 3)
BDNF (brain derived
neurotrophic factor)
NT 3 ( hi 3)• NT‐3 (neutrophin‐3)
• NT‐4 (neutrophin‐4)
• NT‐3 (neutrophin‐3)
• NT‐4 (neutrophin‐4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
45
Pleiotropní efekt BDNFPleiotropní efekt BDNF
Hematopoetic Precursor Cell
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
Hematopoetic Precursor Cell
46
BDNF‐indukovaná neovaskularizaceBDNF‐indukovaná neovaskularizace
HPCs‐ hematopoietic precursor cells, MCs ‐ mural cell, ECs endothelial cells
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
47
EPO (Erythropoietin)
d k l d i á h
EPO (Erythropoietin)
d k l d i á h• produkce v ledvinách 
• stimulace tvorby erytrocytů
• rekombinantní EPO
• produkce v ledvinách 
• stimulace tvorby erytrocytů
• rekombinantní EPO• rekombinantní EPO
TPO (Thrombopoietin)
• produkce ve slezině a v ledvinách
• rekombinantní EPO
TPO (Thrombopoietin)
• produkce ve slezině a v ledvinách• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních destiček
G CSF (G l t C l Sti l ti F t )
• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních destiček
G CSF (G l t C l Sti l ti F t )G‐CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
(
G‐CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
(GM‐CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating
Factor)
GM‐CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating
Factor)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
48
RECEPTOROVÉ TYROZIN‐KINÁZY 
funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj.g p j
lidský genom : 59 genů (+alternativní sestřih) → 20 receptorových rodin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
49
DOMÉNY :
• extracelulární (receptorová)
• transmembránovátransmembránová 
• cytoplasmatická (tyrozin kinázová)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
50
AKTIVACE:
dimerizace vlivem růstových faktorů → cross‐fosforylace
a) → konformační změna – stimulace katalytické aktivity
b) → tvorba vazebných míst pro domény adaptorových           
proteinů (Grb‐2)proteinů (Grb 2)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
51
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
52
INDUKOVANÁ DIFERENCIACEINDUKOVANÁ DIFERENCIACEINDUKOVANÁ DIFERENCIACEINDUKOVANÁ DIFERENCIACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
53
Indukovaná diferenciace
• induktory diferenciace (růstové faktory vitamíny
Indukovaná diferenciace
• induktory diferenciace (růstové faktory vitamínyinduktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny, 
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky…)
• indukce příslušné diferenciační dráhy 
induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny, 
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické látky…)
• indukce příslušné diferenciační dráhy 
• inhibice signálních drah pro „self‐renewal“
ů
• inhibice signálních drah pro „self‐renewal“
ůPříklady induktorů diferenciace in vitro:
• kyselina all‐trans retinová (ATRA)
• 1 25 dihydroxycholekalciferol (1 25(OH) D )
Příklady induktorů diferenciace in vitro:
• kyselina all‐trans retinová (ATRA)
• 1 25 dihydroxycholekalciferol (1 25(OH) D )• 1,25‐dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2‐D3)
• phorbol myristylacetát (PMA) 
• trichostatin
• 1,25‐dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2‐D3)
• phorbol myristylacetát (PMA) 
• trichostatin• trichostatin
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• SU5402 (inhibitor FGFR1)...
• trichostatin
• dimethylsulfoxid (DMSO)
• SU5402 (inhibitor FGFR1)...
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
SU5 0 ( b to G )SU5 0 ( b to G )
54
Kyselina all‐trans retinová (ATRA) y ( )
jako induktor diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
55
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)induktor diferenciace (a morfogeneze)induktor diferenciace (a morfogeneze)
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3 acetylace histonů  aktivace transkripce
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3 acetylace histonů  aktivace transkripce
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
3. acetylace histonů  aktivace transkripce3. acetylace histonů  aktivace transkripce
56
Linie HL‐60:Linie HL‐60:
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all trans retinová (ATRA)
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all trans retinová (ATRA)kyselina all‐trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
kyselina all‐trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1 25‐dihydroxyvitamin D
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1 25‐dihydroxyvitamin D
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
1,25‐dihydroxyvitamin D31,25‐dihydroxyvitamin D3
57
Diferenciace linie HL‐60 do stádia granulocytů:Diferenciace linie HL‐60 do stádia granulocytů:
Induktor: 1mM kyselina all‐trans retinová
Marker: CD‐66b (CD‐67)
Induktor: 1mM kyselina all‐trans retinová
Marker: CD‐66b (CD‐67)( )
Detekce: anti‐CD66b, SwAM‐FITC
( )
Detekce: anti‐CD66b, SwAM‐FITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
58
Granulocytární diferenciace HL‐60: flow cytometrie / CD66bGranulocytární diferenciace HL‐60: flow cytometrie / CD66b
18,26%
33,25% 33,28%
1mM ATRA1mM ATRA 1mM ATRA + 13mM CA1mM ATRA + 13mM CA 1mM ATRA + 52mM CA1mM ATRA + 52mM CA
59
Diferenciace linie HL‐60 do stádia makrofágů:Diferenciace linie HL‐60 do stádia makrofágů:
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
M k CD 14
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
M k CD 14Marker: CD‐14
Detekce:Detekce: antianti‐‐CD14, SwAMCD14, SwAM‐‐FITCFITC
Marker: CD‐14
Detekce:Detekce: antianti‐‐CD14, SwAMCD14, SwAM‐‐FITCFITC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
60
Linie P19:Linie P19:Linie P19:Linie P19:
• myší embryonální karcinom • myší embryonální karcinom 
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• induktory mesodermální diferenciace:• induktory mesodermální diferenciace:• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all‐trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all‐trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all‐trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all‐trans retinová (ATRA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
kyselina all‐trans retinová (ATRA)kyselina all‐trans retinová (ATRA)
61
Schéma diferenciace buněk P19Schéma diferenciace buněk P19
metoda kultivace na 
bakteriologických miskách
metoda kultivace na 
bakteriologických miskách
metoda „visících kapek“
(hanging drops)
metoda „visících kapek“
(hanging drops)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
62
Mesodermální diferenciace buněk P19:Mesodermální diferenciace buněk P19:
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosin II
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosin IIMarker: myosin II
Detekce:Detekce: antianti‐‐skeletal myosin, SwAMskeletal myosin, SwAM‐‐FITCFITC
Marker: myosin II
Detekce:Detekce: antianti‐‐skeletal myosin, SwAMskeletal myosin, SwAM‐‐FITCFITC
63
ATRA – 1.denATRA – 1.den DMSO – 2.den DMSO – 2.den 
50 mm 100 mm
ATRA – 4.denATRA – 4.den DMSO – 4.denDMSO – 4.den
160 mm 50 mm
64
Neuronální diferenciace buněk P19:Neuronální diferenciace buněk P19:
Induktor: 1mM kyselina all‐trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Induktor: 1mM kyselina all‐trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Detekce:Detekce: antianti‐‐neurofilament 160, SwAMneurofilament 160, SwAM‐‐FITCFITCDetekce:Detekce: antianti‐‐neurofilament 160, SwAMneurofilament 160, SwAM‐‐FITCFITC
65
Praktické využití indukované diferenciace:
• základní výzkum
Praktické využití indukované diferenciace:
• základní výzkum
• diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL AML)
• diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL AML)→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
• diferenciační terapie v dermatologii
→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
• diferenciační terapie v dermatologii• diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
ří b ěč ý h d i átů i it
• diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
ří b ěč ý h d i átů i it• příprava buněčných derivátů in vitro• příprava buněčných derivátů in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
66
Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:
Roaccutane
(isotretinoin, 13‐cis‐RA)
Roaccutane
(isotretinoin, 13‐cis‐RA)
Vesanoid 
(tretinoin, all‐trans‐RA)
• akné, neuroblastom• akné, neuroblastom • akutní leukemie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
67
COMBAT
léčba solidních nádorů (meduloblastom , neuroblastom, sarkomy...)( , , y )
celecoxib inhibitor cyclooxygenázy antiangiogenní účinek
etoposid inhibitor topomerázy II zástava b. cyklu
temozolomid alkylační činidlo apoptóza
kys. retinová  diferenciační činidlo diferenciace/apoptóza 
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.
68
Teoretické modely diferenciční terapieTeoretické modely diferenciční terapie
• přímá diferenciace nádorové buňky
• oprava onkogenního mechanismu vede k původní diferenciaci
• přesměrování“ na prekurzor  jiná diferenciační dráha
• přímá diferenciace nádorové buňky
• oprava onkogenního mechanismu vede k původní diferenciaci
• přesměrování“ na prekurzor  jiná diferenciační dráha• „přesměrování  na prekurzor   jiná diferenciační dráha• „přesměrování  na prekurzor   jiná diferenciační dráha
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie ‐ jaro 2013 ‐ 07 / 3.4.