Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Adultní a nádorové
kmenové buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 17.4.2013
doc. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
• Adultní kmenové buňky (ASCs)
biologické vlastnosti a diferenciační potenciál
transdiferenciace, EMT
mikroprostředí (niche) ASCs
využití ASCs pro buněčné terapie  24.4.2013
• Nádorové kmenové buňky (CSCs)
biologické vlastnosti a hypotézy vzniku CSCs
markery CSCs
možnosti cílené protinádorové terapie
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
ADULTNÍ KMENOVÉ BUŇKY
(ADULT STEM CELLS, ASCs)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Typy ASCs:
• mozek
• krev
• rohovka
• sítnice
• srdce
• tuková tkáň
• kůže
• dřeň zubu
• kostní dřeň
• cévy
• kosterní svalstvo
• střeva
• pupečníková krev
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Lidské SCs kostní dřeně
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Diferenciační potenciál
hematopoetických a stromálních SCs
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Plasticita hematopoetických SCs
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Izolace
hematopoetických
SCs pomocí FACS
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Transdiferenciace
= schopnost buněk diferencovat do fenotypu
charakteristického pro jiný typ tkáně nebo
orgánu, než byla tkáň původní
• hematopoetické SCs → kardiomyocyty,
hepatocyty
Ratajczak et al. 2006
• populace velmi malých buněk v kostní dřeni,
které se podobají ESCs, mají morfologii a
markery shodné s nediferencovanými SCs
• in vitro diferenciace do fenotypu kardiomyocytů,
neurálních a pankreatických buněk
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Příklad transdiferenciace neurálních SCs
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Epiteliálně mezenchymální tranzice (EMT)
= biologický proces, při němž polarizovaná epiteliální
buňka, která svým bazálním povrchem interaguje s
bazální laminou (ECM), prochází řadou
biochemických změn, díky nimž získá
mezenchymální fenotyp (zesílená schopnost
migrace, invazivita, vyšší rezistence k apoptóze a
zvýšená produkce komponent ECM)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
"Niche" (hnízdo) SCs
• mikroprostředí (microenvironment):
podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní
molekuly a signální molekuly
• ASCs - po celou dobu života organismu
buňky tvořící niche
SCs (mitóza)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
NÁDOROVÉ KMENOVÉ BUŇKY
(CANCER STEM CELLS, CSCs)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Nádorové kmenové buňky (Cancer SCs, CSCs)
• prokázány u hematologických malignit i různých
typů solidních nádorů
Vlastnosti
• proliferační a diferenciační potenciál
• schopnost self-renewal
• metastatický potenciál
• sekrece růstových faktorů, cytokinů
• vysoká telomerázová aktivita
• specifické markery (CD133…)
• specifické signální dráhy (Wnt, Notch, Hedgehog)
• rezistence vůči apoptóze
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Důsledek:
zásadní změna pohledu na biologii nádorů
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Heterogenní prostředí
solidního nádoru
TICs = tumor initiating cells (= CSCs)
TACs = transiently amplifying cells
TD = terminally differentiated cells
C = kapilára
N = nekróza
TAM
= tumor-associated
marcophages
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Mikroprostředí (niche) CSCs v solidních nádorech
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Komponenty mikroprostředí v solidních nádorech
• hypoxie, ECM, mezibuněčné interakce,
extracelulární (secernované) faktory a signály,
"tissue makeup"
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Hypotézy vzniku CSCs
• aberantní depozity ESCs (transformovaných)
• nádorová transformace ASCs, resp.
progenitorových buněk
• mutace podmiňující dediferenciaci a imortalizaci
diferencovaných buněk ve tkáni
Nádor jako "onemocnění kmenových buněk"?
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
lidské CSCs
lidské ESCs
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
SCs normální tkáně:
• hematopoetické SCs
• neurální SCs
• neuroektodermální SCs
• epiteliální SCs prsní žlázy
• epiteliální SCs renálních
tubulů
• SCs jaterní tkáně
• ovariální epiteliální SCs
• cervikální epiteliální SCs
• epiteliální SCs sítnice
Odpovídající typ nádoru:
• leukemie
• nádory mozku
• neuroblastom
• nádor prsu
• Wilmsův tumor
.
• hepatoblastom
• karcinom vaječníků
• karcinom děložního krčku
• retinoblastom
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Hypotézy vzniku CSCs:
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Hypotézy vzniku CSCs:
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Vznik nádoru
v důsledku
transformace ASCs
nebo progenitorů:
karcinom prsu
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Možné fenotypové
rozdíly mezi
primárním
nádorem a
metastázami:
karcinom prsu
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Markery různých typů CSCs:
Orgán Markery
kostní dřeň CD34+, CD38-, Thy1-, Linprs
CD44+, ESA+, CD24- , Linků
že CD20+, MCAM+, CD166+, Nestin+
prostata CD44+, α2β1hi, CD133+
GIST CD133+
ústní dutina CD44+
CNS CD133+, Nestin+, Musashi-1+
pankreas CD24+, CD44+, CD133+, ESA+, ABCG2
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Markery CSCs u nádorů mozku:
• nestin (IF protein, nediferencované buňky CNS)
• Musashi-1 (neural RNA-binding protein)
• CD44 (CAM, CNS nádory)
• CD133 (transmembránový protein, neurální SCs)
• Sox2 (transkripční faktor, neurální SCs)
• Bmi-1 (self-renewal, proliferace SCs)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
In vitro diferenciace
CSCs z nádoru mozku:
• neurony
• astrocyty
• nediferencované
CSCs
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Markery CSCs u nádorů dětského věku:
(Friedman and Gillespie, Cancers, 2011)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
CD133 (Prominin-1)
• membránový glykoprotein
• 4p15.32, 865 AA, 97 kDa
• 5 transmembránových segmentů: 5-TM family
• organizace membránových protruzí
• SCs i CSCs (epitop AC133)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
CD133Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
M/15
Nestin
Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
F/14
Nestin
Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Buněčná linie Saos-2 (ATCC) – osteosarkom
CD133 / DAPI Nestin / DAPI
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Identifikace markerů CSCs
v sarkomových buněčných liniích
OsteosarkomRhabdomyosarkom
CD133
Nestin
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Funkční testy (functional assays) na fenotyp CSCs
• tvorba sfér (sphere formation assay)
• tvorba kolonií (colony forming assay)
• testy klonogenity (clonogenicity assay)
• testy tumorigenicity (tumorigenicity assay)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Tvorba sfér (sphere formation assay)
• vytváření suspenzních buněčných agregátů
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Tvorba kolonií (colony-forming assay)
• vysetí naředěné buněčné suspenze do měkkého
agaru  vytváření kolonií
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Testy klonogenity (clonogenicity assay)
• inokulace izolovaných buněk do 96-jamkových
destiček (ředěním nebo pomocí mikropipety)
• proliferace a tvorba kolonií (>50 buněk)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Testy tumorigenicity (tumorigenicity assay)
• subkutánní injekce buněčné suspenze NOD/SCID
myším (koncentrace cca 107/ml)
• monitorování růstu nádorů, histologická analýza
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Příklad komplexní
analýzy CSCs
in vitro
(osteosarkom)
(Tirino et al.,
FASEB J, 2011)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (osteosarkom)
(Tirino et al., FASEB J, 2011)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Hypotéza CSCs:
Důsledky pro
protinádorovu léčbu
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Konvenční vs. cílená protinádorová léčba:
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Problém cílené terapie:
chemorezistence a radiorezistence CSCs
Předpokládané mechanismy chemorezistence a
radiorezistence u nádorů dětského věku
(Friedman and Gillespie, Cancers, 2011)
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Rizika neselektivní léčby cílené proti CSCs:
poškození ASCs v nenádorové tkáni
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
Terapie cílená proti CSCs:
možné strategie
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013
(Patel et al., Oncol Rev, 2010)
Terapie cílená proti CSCs:
Příklady konkrétních strategií u vybraných typů nádorů
Bi8120 Aplikovaná bun• čná biologie / 09 / 17.4.2013