Luminiscenční spektroskopie excitace1 k1 k4 k5 k4 k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k2 k3 k4 A hn hn hn Luminiscenční spektroskopie excitace Luminiscenční spektroskopie Fluorescenční spektroskopie Fosforescenční spektroskopie Chemiluminiscenční spektroskopie Základní pojmy Excitace a emise emise Interakce s rozpouštědlem Singletový excitovaný stav Singletový základní stav Základní pojmy Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu nm Dl F Absorpce Emise Základní pojmy 2 l3 l2 l1 Základní pojmy Excitovaný stav – střední doba života 10-7 – 10-9 s. O O Základní pojmy Kvantový výtěžek fluorescence F = počet kvant emitovaných/počet kvant absorbovaných F F = ke/(ke + S kk) ke = rychlost emise kk = rychlost konverzních procesů Intenzita fluorescence látky = f (e, F, N) Základní pojmy Doba života excitovaného stavu Doba potřebná k poklesu fluorescence na hodnotu 1/e Io Střední doba života t t= 1/ kf t If = I0 e – t/ t lifetime Přirozená doba života to Definovaná pro F = 1 ∞ t0 = 2,88.10-9.n2.nA2 . ∫ e(n)dn 0 n- refrakční index rozpouštědla e – molární abs. Koeficient n – vlnočet abs. maxima A n Základní pojmy Střední doba života fluorescence Fluorescein 4,6 ns Chininsulfát 15 – 40 ns NADH 0,5 ns F = t/t0 Biochemicky významné fluorofory fluorofory Instrumentace schémaflu Instrumentace mercury xenon lamp Zdroj: Xenonová lampa Rtuťová výbojka Laser Světelné diody - LED (430, 450, 505, 592, 612 and 637 nm) lasery_a_barviva Instrumentace bandpass Monochromátor - mřížka - filtry shorpass Instrumentace schemafluo Instrumentace Shimadzu RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu Instrumentace Měření střední doby života fluorescence mereni_lifetime Podmínky fluorescence polarita1 Závislost na polaritě a viskozitě polarita Nitrobenzoxadiazol Pokles polarity 6 – 1. Podmínky fluorescence Závislost fluorescence na teplotě 20 40 °C F 80 40 Podmínky fluorescence Stabilita fluorescenčního signálu chininsulfátu 40 80 min F 80 40 Podmínky fluorescence 1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl) 2 Fluorescenční emise 3 Ramanův rozptyl 1 3 2 Excitace 450 nm Emisní spektrum 450 nm 600 nm 3 Kvantitativní fluorimetrie Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky F = f (I, e, c, F) F = Io F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0 F = Io F.2,3.ed.c F c Kvantitativní fluorimetrie aminy Stanovení koncentrace aminokyselin 390/464 nm 340/455 nm 450/550 nm Kvantitativní fluorimetrie CBCQA-protein Stanovení bílkovin CBCQA CBCQA Kvantitativní fluorimetrie Detekce bílkovin v gelu (barevně: Coomasie blue, stříbrné barvení) Fluorimetricky: SYPRO Orange (Molecular probes) – citlivost 1 – 2 ng Kvantitativní fluorimetrie ethidium Detekce nukleových kyselin Ethidium bromid detekceDNA rRNA 16 a 23s barvená SYBR Green II Molecular Probes Fluorogenní substráty galaktosidasy galatosidasy1 Galaktosidasy 4-methylumbelliferyl-a-galaktosid Fluorescein-digalaktosid Fluorogenní substráty peroxidase resorufin Peroxidasy – amplex red, vznik resorufinu Fluorogenní substráty peptidasy1 Proteinasy, peptidasy 1)Fluorescenční konjugáty proteinů a peptidů 2) peptidasy Fluorogenní substráty PLA Fosfolipasa A Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující fluorofor H2O H2O F nm Emisní spektrum Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí t (min) F310 substrát > Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí fluosceinspek fluopH Fluorescenční konjugáty Karboxyfluorescein – (494/520 nm) Absorpce/emise fluoresceinu při pH 9 CF OG CF-karboxyfluorescein OG oregon green oregongreen Oregon Green - (496/524 nm) karoxyfluo Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí tetrametrhod tetrametrhodspek kumarrin Fluorescenční konjugáty Teramethylrhodamin – 545/580 nm) kumarinspek Kumariny – 350/450 nm) Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí dansyl dansylspek benzoxadiazol Fluorescenční konjugáty bezoxadiazolspek Dansyl Benzoxadiazol –N-sukcinimid Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí konjugace Fluorescenční konjugáty konjug Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Interakce makromolekul s ligandy polarita F koncentrace makromolekuly Ligand volný Ligand vázaný L + M « LM Kd = Lf.Mf/LM Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí F = Ff + Fb F = Cf .Ff + Cb. Fb F = (C-Cb) Ff + Cb. Fb F = CFf – CbFf + Cb. Fb F = Fo + Cb (Fb – Ff) Cb = (F – Fo)/ (Fb – Ff) Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu Cb,Cf – koncentrace vázaného, volného Ligandu C – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí parinar AOC16 Interakce makromolekul s ligandy Použití fluorescenčních analogů FluorescPL Kys. cis-parinarová Anthroyloxypalmitát Fluorescein-PE Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Použití značené makromolekuly Fluorescence značené bílkoviny F Koncentrace ligandu Fluorescenční rezonanční transfer energie (Försterův přenos) transfer2 Nezářivý přenos energie z donoru na akceptor (1 – 10 nm) Fluorescenční rezonanční transfer energie schematrans F nm DONOR A F Fluorescenční rezonanční transfer energie schematrans F nm DONOR A F AKCEPTOR Fluorescenční rezonanční transfer energie schematrans F nm DONOR A F AKCEPTOR Fluorescenční rezonanční transfer energie F nm A Fo F Donor h = 1 – F/Fo Fluorescenční rezonanční transfer energie transfer1 h= Ro6/(Ro6 + R6) Ro6 = 1,66.10-33.t.J/n2no2 t – doba života exc. stavu J – překryvový integrál n – refraktivní index rozpuštědla n – vlnočet emise donoru 7 Fluorescenční rezonanční transfer energie Použití – změření vzdálenosti mezi dvěma molekulami v bílkovině Tryptofan (290/340) vs. NADH (340/450 nm) priklad_transfer Fluorescenční rezonanční transfer energie prikladtransfer2 Fluorescenční anizotropie polar_princip Fluorescenční anizotropie polarf Polarizační filtry Fluorescenční anizotropie polar2 Fluorescenční anizotropie polarizace Fluorescenční anizotropie Rotační relaxační čas Fluorescenční anizotropie r = Iv – Ih I I = Iv + 2Ih ro/r = 1 + 3t/r t, střední doba života fluorescence r, rotační relaxační čas molekuly ro – anizotropie nepohyblivé molekuly r = Vh/RT V objem h viskozita ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro = (3 cos2a -1)/5 a excitace Fluorescenční anizotropie Využití: Interakce makromolekuly s ligandem F mg makromolekuly r polarizace Fluorescenční anizotropie Využití: Měření viskozity prostředí ro/r = 1 + 3tRT/Vh ro/r = 1 + K/h h = 2,4r/(0,362 – r) r 20 30 40 50 °C Fl. anizotropie DPHT Vázaného v liposomech DPPC Chemiluminiscence luminol luminol1 Luminol luminol2 Chemiluminiscence Luciferin luciferin Chemiluminiscence Aequorin – Aequoria victoria aequorea Chemiluminiscence celenter Aequorin – Aequoria victoria aequor_coeln Chemiluminiscence aeq_spek Aequorin – Aequoria victoria aequo_anim Průnik vápníku do mitochondrií Aktivuje oxidaci