Kalibrace a diagnostika spektrometru Viktor Kanický Kurs ICP 2009 Spektroskopická společnost Jana Marka Marci Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity pro svetra X = b0 + b1 . c XL = B + ksB = b0 + b1.cL cL = k.sB/b1 b1 = (X-B)/c = S/c cL = k sB. c /S cL = k.c.RSDb/SBR Analytické parametry Nulová linie Pozadí Spektrální čára BEC = 1/(S/B) cL = 3RSDB ´ BEC IL S = IL/cA Koncentrace ekvivalentní pozadí a mez detekce RSDL Δλ RSDB B (= IB) Optimalizační kritéria ØSignál S při jednotkové koncentrací = citlivost ØPoměr signálu k pozadí S/B, SBR ØPoměr signálu k šumu S/N, SNR ØRelativní standardní odchylka pozadí RSDB • §Přesnost (opakovatelnost) RSDS= (S/N)-1 §Mez detekce cL 4 • Závislost standardní odchylky celkové intenzity čáry a pozadí sL+B a relativní (sL+B)r na koncentraci analytu. cB = koncentrace ekvivalentní pozadí sL+B =stand. odchylka sL+B = rel. stand. odchylka sL,r= 0,38% sB.r= 0,60% Obr.39 Závislost směrodatné sL+B a relativní směrodatné odchylky (sL+B)r intenzity celkové emise čáry a pozadí IL+B na koncentraci zavislost chyby na signalu1oriznute IL+B = IL + IB sL+B2 = sL2 + sB2 IN = IL+B - IB sN2 =sL+B2 + sB2= sL2 + 2sB2 Závislost standardní a relativní standardní odchylky čisté intenzity emise čáry IL a korigovaní intenzity emise čáry IN na koncentraci zavislost chyby na signalu2_1text zavislost chyby na signalu1xtext Závislost standardní a relativní standardní odchylky čisté intenzity emise čáry IL a korigovaní intenzity emise čáry IN na koncentraci Analytické parametry Vliv rozlišení na mez detekce Efektivní šířka spektrální čáry ovlivňuje: ØIntenzitu emise čáry ØIntenzitu spojitého záření pozadí SBR RSDb § Efektivní šířka čáry Dleff zahrnuje příspěvek fyzikální šířky, DlL a instrumentální šířky čáry Δλins § Poměr signál/pozadí je nepřímo úměrný efektivní šířce spektrální čáry Δλeff, poněvadž intenzita emise čáry roste lineárně s šířkou štěrbiny, kdežto intenzita emise pozadí vzrůstá s druhou mocninou šířky štěrbiny. Dleff = ( DlL2 + Dlins2)1/2 •Přes veškeré pozitivní vlastnosti, kterými se budicí zdroj ICP odlišuje od řady dalších, v něm existují nespektrální interference (interference osnovy vzorku) Nespektrální interference se často vyjadřuje jako poměr • • • •kde IL je čistá, tj. na pozadí korigovaná intenzita čáry analytu naměřená s čistým roztokem a ILM je čistá intenzita naměřená za přítomnosti interferentu o určité koncentraci. Běžné je také vyjádření rozdílu (zvýšení, snížení) v %: Nespektrální interference Nespektrální interference •Podle místa vzniku: –Zmlžovací systém, –Plazmová hlavice. •Podle interferentu: –Snadno ionizovatelné prvky –Kyseliny, rozpouštědla •Podle mechanismu: –Excitační –Ionizační –Zmlžovací a transportní (povrch. napětí, viskozita, hustota, elektrostatický náboj, změna rozdělení obsahu látek v závislosti na velikosti částic, frakcionace) Nespektrální interference obr16 Axiální rozdělení nespektrální interference – vliv průtoku nosného plynu Nespektrální interference obr18 Radiální rozdělení nespektrální interference Laterální rozdělení nespektrální interference (matrix efektu) X na čarách Y II 371,030 nm (1) a Y I 410,238 nm (2); Polohy maxim laterálních rozdělení emise čar Y II – a, Y I – b (rozdělení zde nejsou uvedena); P = 1,1 kW; Fc = 1,06; Fa = 0,43; Fp =18,3; 0,1 mol/l NaNO3 v 1,4 mol/l HNO3 Nespektrální interference Axiální rozdělení nespektrální interference (matrix efektu) X na čáře Nd II 430,358 nm v16 mg/l Nd v 1,4 mol/l HNO3 závislosti na koncentraci Na (100 – 10000 mg/l Na) pro různé výšky pozorování; křivka č. – h (mm): 1 – 8; 2 – 16; 3 – 20; 4 – 24; P = 1,1 kW; Fc = 1,06; Fa = 0,43; Fp =18,3; ; měřítko na obou osách je logaritmické obr19 Nespektrální interference •Závislost nespektrální interference (matrix efektu) X na koncentraci kyseliny chlorovodíkové pro Nd II 430,358 nm; 16 mg/l Nd; podmínky: křivka č. 1: h = 16 mm, Fc = 1,06 l/min, křivka č. 2: h = 20 mm, Fc = 1,45 l/min; P = 1,1 kW; Fa = 0,43 a Fp =18,3 l/min Ar RSD: dlouhodobá opakovatelnost, reálné vzorky silikátů zavislost chyby na koncentraci silikaty 1 zavislost chyby na koncentraci silikaty 2 RSD: dlouhodobá opakovatelnost, reálné vzorky silikátů, drift přístroje, diagnostika zavislost chyby na koncentraci silikaty 3 a drift drift diag Přesnost a správnost •Podmínky měření –Maximální citlivost (směrnice kalibrační přímky) –Maximální poměr signál/šum –Minimální matriční efekt •Vlivné parametry –Průtok nosného plynu –Příkon do plazmatu –Výška pozorování Přesnost a správnost •Hlavní složka vzorku (SiO2 , Fe) –Normalizace – korekce na sumu (100 %) –Celkový rozptyl součtu všech výsledků (σc)2 = součet rozptylů jednotlivých výsledků –rozdíl součtu výsledků od 100 % lze brát jako statisticky významný na dané hladině významnosti jen tehdy, leží-li vně intervalu Přesnost a správnost •Použití porovnávacího prvku: –zlepšení přesnosti měření (kompenzace šumu vyšších frekvencí) –zlepšení správnosti měření (kompenzace driftu (nízkofrekvenčního šumu) –zlepšení správnosti měření kompenzací vlivu matrice (nespektrální interference) Přesnost a správnost •Podmínky správné funkce porovnávacího prvku 1.signály analytu a porovnávacího prvku musí korelovat v závislosti na malé změně pracovních podmínek ICP zdroje (simulace driftu), přičemž korelační koeficient musí být blízký jedničce; 2.poměr relativních směrodatných odchylek b=σP,r/σA,r signálů IP a IA porovnávacího prvku a analytu musí být blízký jedničce; 3.pokud není hodnota pozadí zanedbatelná vzhledem k signálům IP a IA, je nutno provést před výpočtem poměru IA /IP korekci pozadí; 4.šum detekčního systému musí být zanedbatelnývůči šumu zdroje ICP. Zlepšení RP dosažené použitím porovnávacího prvku je definováno vztahem – Přesnost a správnost • • • kde σA,r a σ(A/P),r jsou relativní směrodatná odchylka signálu analytu IA a relativní směrodatná odchylka podílu I(A/P)= IA/IP. Je-li splněna podmínka 1) a současně b=σP,r/σA,r ≠ 1 , lze vypočítat RP podle vztahu Přesnost a správnost •Pro platnost podmínky 2) a r <1 je zlepšení přesnosti dáno vztahem Přesnost a správnost •Porovnávací prvek musí splňovat následující podmínky: •a) přirozený obsah porovnávacího prvku ve vzorcích musí být nižší než jeho mez detekce metody ICP-AES; •b) preparát porovnávacího prvku musí být dostatečně čistý, aby jeho přídavek nezvyšoval slepý pokus pro analyty; •c) spektrum porovnávacího prvku nesmí obsahovat příliš mnoho spektrálních čar, aby nedocházelo ke spektrálnímu rušení čar analytů; •d) porovnávací čára prvku musí být přiměřeně citlivá, aby koncentrace vnitřního standardu mohla být co nejnižší; •e) porovnávací prvek musí být v roztoku stálý, tj. nesmí těkat, tvořit nerozpustné hydrolytické produkty nebo tvořit sraženiny s ionty analytů či se složkami osnovy vzorku. Analytické spektrální čáry, korekce interferencí •Výběr analytických čar pro stanovení v konkrétní osnově vzorku se provádí i)s ohledem na obsah stanovované složky; ii)s uvážením možných spektrálních interferencí. • •Spektrální interference lze klasifikovat takto: •i) přímá koincidence spektrálních čar nerozlišitelná ve spektrálním přístroji; •ii) překryv čar závislý na propouštěném spektrálním intervalu spektrometru; •iii) překryv křídlem rozšířené čáry; •iv) interference vyvolaná strukturním pozadím; v)rozptýlené záření. •Většina prvků má alespoň jednu citlivou analytickou čáru, která není spektrálně rušena. Korekce spektrálních interferencí •Korekce spektrální interference je obvykle kombinací korekce pozadí a korekce překryvu čarou. Při korekci pomocí korekčních faktorů se od nekorigované koncentrace j-tého analytu cxj vypočtené z kalibrační přímky odečítá zdánlivá koncentrace analytu vyjádřená jako součin korekčního faktoru aij a koncentrace ci i-tého rušícího prvku, stanovené na jeho analytické čáře. Pro n interferentů se vypočte korigovaná koncentrace j-tého analytu cj podle vztahu Vývoj metody 1.Na základě známého složení typu vzorku se zvolí vhodné spektrální čáry. Kritériem jsou požadované meze detekce, citlivost čar a případné spektrální interference. 2.Pro očekávané koncentrace a koncentrační poměry jednotlivých složek se měřením jednoprvkových roztoků interferentů ověří předpokládané spektrální interference a zvolí se body pro korekci pozadí. Vývoj metody 3.Optimalizují se parametry ICP: příkon do plazmatu, průtok nosného plynu, rychlost čerpání roztoku do zmlžovače v případě radiálního ICP výška pozorování, v případě axiálního ICP centrování kanálu vůči optické ose. Optimalizace se provede s čistými roztoky s cílem dosáhnout obvykle maximálního poměru signál/pozadí a minimálního poměru signál/šum. Čistým roztokem se rozumí roztok obsahující analyt v prostředí pouze zředěné kyseliny (k zabránění hydrolýze) a odpovídající slepý roztok. Měření se provádí s vypnutou korekcí pozadí, aby se neztratily informace o změnách pozadí, měřeného on-peak při zmlžování slepého roztoku. Vývoj metody 4.Za optimalizovaných podmínek se ověří vliv kyselin a tavidel používaných k rozkladu vzorku na směrnice kalibračních závislostí. Změří se velikost matriční interference (obvykle deprese signálu ve srovnání s čistými roztoky) a závislost této nespektrální interference na koncentraci tavidel a kyselin v přiměřeném rozmezí. Vyhodnotí se kompenzace matričního efektu porovnávacími prvky. Vyvodí se závěry pro přípravu kalibračních roztoků z hlediska obsahu tavidel a kyselin, zejména rozmezí obsahů těchto reagencií, při nichž není pozorována změna analytických signálů. • Vývoj metody 5.Jestliže byly zjištěny podle bodu 2 spektrální interference, které nelze korigovat měřením a odečtem pozadí, změří se hodnoty korekčních faktorů v přítomnosti tavidel a kyselin používaných k rozkladu. Korekční faktory takto zjištěné mají obvykle mírně odlišné hodnoty ve srovnání s hodnotami naměřenými s čistými roztoky. Určí se meze detekce v přítomnosti matrice. Vývoj metody 6.Řízenou změnou parametrů ICP v definovaném malém rozmezí (průtoky, příkon, výška pozorování) se změří trendy signálů jednotlivých analytů v úplné matrici (včetně tavidla a kyselin) a zjistí se, zda jsou tyto trendy kompenzovány porovnávacími prvky. Tyto trendy lze pak předpokládat v případě driftu přístroje. 7.Vyhodnotí se kompenzace skutečného driftu porovnávacím prvkem v průběhu měření modelového nebo vybraného sériového vzorku v delším časovém úseku. Zvolí se optimální porovnávací prvek. Odhadne se nutný časový interval mezi provedením kalibrací (rekalibrací). Vývoj metody 8.Zjistí se opakovatelnost měření a shodnost s certifikovanými hodnotami referenčních materiálů případně modelových vzorků, pokud nejsou referenční materiály k dispozici. • Věrohodnost lineární regrese 4Lineární regresní model -metoda nejmenších čtverců, předpoklady: lregresní parametry mohou nabývat libovolných (smysluplných) hodnot lregresní model je lineární v parametrech lmatice nenáhodných (nastavovaných) hodnot nezávislých (vysvětlujících) proměnných neobsahuje 2 sloupcové kolineární vektory lnáhodné chyby mají nulovou střední hodnotu lnáhodné chyby mají konstantní a konečný rozptyl (homoskedasticita) lnáhodné chyby jsou vzájemně nekorelované (cov = 0) lchyby mají normální rozdělení Lineární regrese PCelkový součet čtverců = regresní součet čtverců + reziduální součet čtverců 4Konstrukce intervalů spolehlivosti a testování významnosti parametrů přímky (F-test: významnost koeficientu determinace, t-test: významnost regresních parametrů) 4Test multikolinearity mezi sloupci matice- vysoké hodnoty korelačních koeficientů mezi nezávisle proměnným 4Test složených hypotéz 4Test vhodnosti (správnosti) lineárního modelu, střední kvadratická chyba predikce, Akaikovo informační kritérium Regresní diagnostika lRegresní triplet: data, model, metoda odhadu. lRegresní diagnostika: identifikace 4kvality dat pro navržený model 4kvality modelu pro daná data 4splnění základních předpokladů MNČ (7) lRegresní diagnostika: 4identifikace vlivných bodů 4identifikace multikolinearity lRegresní diagnostika: 4ověření předpokladů užitých k odhadu parametrů 4statistická analýza parametrů (kritika modelu) 4identifikace vlivných bodů (kritika dat) Regresní diagnostika lExploratorní analýza dat umožňuje před vlastní regresní analýzou identifikovat: 4nevhodnost dat (malé rozmezí, přítomnost vybočujících bodů) 4nesprávnost navrženého modelu (skryté proměnné) 4multikolinearitu 4nenormalitu v případě, kdy jsou vysvětlující proměnné (nezávisle proměnné) náhodné veličiny. lPosouzení kvality dat: výskyt vlivných bodů - 3 skupiny 4hrubé chyby = vybočující pozorování 4body s vysokým vlivem (golden points) - rozšiřují predikční schopnosti modelu, speciálně vybrané, přesně změřené body 4zdánlivě vlivné body = důsledek nesprávně navrženého regresního modelu Regresní diagnostika lVlivné body: 4vybočující pozorování (outliers) - výrazná odchylka na ose y 4extrémy (high leverage points) - liší se v hodnotách na ose x od ostatních bodů •Nástroje: lstatistická analýza reziduí lanalýza prvků projekční matice lgrafy identifikace vlivných bodů lPosouzení kvality navrženého regresního modelu: •Nástroje: lparciální regresní grafy lparciální reziduální grafy l znaménkový test vhodnosti modelu Regresní diagnostika lPosouzení kvality navrženého regresního modelu: •Diagnostika: lheteroskedsticity (nekonstantnosti rozptylu) lautokorelace (časové řady, chyby jsou vzájemně korelované) lnenormalita chyb •Kalibrační přímka - přesnost kalibrace: lKritická úroveň yc - horní mez 100(1-alfa)% -ního intervalu spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu pro koncentraci rovnou nule = slepý pokus lLimita detekce yD - odpovídá hodnotě koncentrace, pro kterou je dolní mez 100(1-alfa)% -ního intervalu spolehlivosti predikce signálu z kalibračního modelu rovna yc lLimita stanovení ys - je nejmenší hodnota signálu, pro kterou je relativní směrodatná odchylka predikce z kalibračního modelu dostatečně malá a rovna číslu C, např. 0,1. Diagnostika spektrometru ICP-AES QUID