‹#› 1 Moderní metody analýzy organických polutantů Jana Klánová klanova@recetox.muni.cz ‹#› 2 •Moderní metody analýzy polutantů •část II – organické polutanty •Sylabus 2004 •Moderní metody neřeší jen momentální koncentraci polutantů, ale i jejich původ a další osud, perzistenci, vlastnosti, efekty, transformace, degradace... •1.Úvod •Specifické problémy moderní environmentální analýzy (mezinárodní konvence: požadavky na analýzy nových typů polutantů, snižující se koncentrace, analýzy reziduí, velké množství kontrolních vzorků, automatizace, požadavky na komplexní analýzu rizik: propojení analytických informací s toxikologickými, vzorkování a analýza biodostupných frakcí, biotesty, průnik metod analytických, biochemických a molekulárně biologických, požadavky na studium osudu látek, biotické a abiotické transformace, spektrální a laserové metody. Koncentrace a vlastnosti kontaminantů, efekty matrice, stabilita vzorků, nehomogenita. Nároky na analýzu vzorků, čistota chemikálií, riziko sekundární kontaminace, zatížení chybami, náklady. •Obecné schéma analytického postupu. •2. Vzorkování •Přehled standartních technik odběru vzorků ovzduší a vod, odběr vzorků plynné fáze na sorbenty, studium fázové distribuce, vzorkovací média, aktivní a pasivní vzorkovače, výhody a nevýhody, rozsah použití – vzorkování pro účely studia osudu látek, dálkového transportu, vlivu starých zátěží, filtrujících efektů, transformací. Membránové techniky. Miniaturní vzorkovače vod. Průtokové analýzy.Vzorkování za účelem studia distribuce, biodostupnosti, bioakumulace ‹#› 3 •3. Techniky přípravy environmentálních vzorků •Extrakce (automatizovaná extrakce – Soxtec, mikrovlnná a ultrazvuková extrakce, superkritická fluidní extrakce, extrakce na tuhou fázi, mikroextrakce, analýza rovnovážné plynné fáze), čištění, frakcionace. Extrakce biodostupné frakce SFE (CO2, vodou za vysokého tlaku) • •4. Techniky analytického stanovení •Chromatografické techniky, jejich princip, instrumentace, využití, interpretace dat. •HPLC, GC, výběr kolon, fází, detektorů, GC-GC, LC-GC, kombinované metody (GC/MS, MS-MS, LC/MS, LC/NMR) • •5. Techniky fotochemické • •6. Techniky molekulárně biologické •ELISA, sekvenace a fragmentace • •7. Analytická data, jejich analýza a interpretace ‹#› 4 Návaznost na další přednášky Analytická chemie životního prostředí Chromatografické metody I a II (GC, HPLC, GPC, TLC, elektroforéza) Hmotnostní spektroskopie Elektronová spektroskopie Správná laboratorní praxe Chemie životního prostředí II a IV ‹#› 5 Doporučená literatura: Reeve R.: Introduction to environmental analysis Fifield F.W., Haines P.J.: Environmental analytical chemistry Skoog D.A., Leary J.J.: Principles of instrumental analysis Hewitt C.N.: Instrumental analysis of pollutants Keith L.H.: Environmental sampling and analysis ‹#› 6 Environmentální vědy zahrnují komplexní studium prostředí a celou řadu disciplín. Pro většinu z nich je však v jistém stádiu nevyhnutná chemická analýza. Může se jednat o studium - úrovně znečištění různých složek prostředí - kvality vody a potravy - regionální kontaminace - účinnosti remediací - dopadu mezinárodních direktiv na úroveň kontaminace - transportu látek v různých prostředích - biotických a abiotických transformací - bioakumulace - úbytku ozónu v závislosti na přítomnosti některých látek - vlivu chemických látek na živé organismy - toxických účinků chemických látek v závislosti na jejich struktuře ‹#› 7 Moderní environmentální analýza však přináší specifické problémy: - mezinárodní konvence: požadavky na analýzy nových typů polutantů - snižující se koncentrace: požadavky na detekční limity - staré zátěže: analýzy reziduí - mezinárodní studie: potřeba standardizace - velké množství kontrolních vzorků: automatizace - studium transportu látek: potřeba velkoplošného monitoringu, požadavek na vývoj nových metod vzorkování - studium osudu látek:potřeba znalosti rovnováhy, distribuce - chemické a fotochemické reakce: spektrální a laserové metody - komplexní analýza rizik: propojení analytických a toxikologických metod, biochemických a molekulárně biologických ‹#› 8 atmospheric transport (gas phase, particles, cloud water) transport by migratory animals oceanic transport (dissolved phase, particles) riverine transport (dissolved phase, particles) anthropogenic transport (products, waste) •Persistence increases the relative importance of transport relative to transformation in controlling a contaminant's fate ‹#› 9 Pro splnění tak rozličných zadání musí environmentální chemie nutně stavět na znalosti řady fyzikálně chemických vlastností, principů a metod: - charakter vazeb a jejich energie - strukturní informace - rozpustnost, tenze par - acidobazické rovnováhy - oxidoredukční rovnováhy - elektrochemické reakce - fázové rovnováhy - distribuční koeficienty - difúzní charakteristiky - strukturní informace - spektrální vlastnosti ‹#› 10 Specifické problémy environmentální analýzy - široký rozsah koncentrací i vlastností analytů - monitorování na hladinách blízkých mezi detekce (stopové a ultrastopové koncentrace analytů, riziko chyb) - riziko sekundární kontaminace - nehomogenita vzorků - nutnost aplikace složitých metod pro izolaci analytů z matrice - omezená stabilita analytů a matric - cena instrumentace, čistých chemikálií, standardů ‹#› 11 Pro kontrolu chemického znečištění životního prostředí je nezbytná kontinuální analýza - definice problému, co a proč chceme sledovat - monitorování s cílem určit rozsah problému - nalezení optimálního postupu - vyhodnocení stavu a prognóza vývoje - odhad expozice a posouzení rizik - návrh opatření - vytvoření legislativy pro účinnou kontrolu - monitorování pro zjištění účinnosti opatření ‹#› 12 mapwmf ‹#› 13 Integrated monitoring of POPs – sampling sites and sampling frequency – Observatory Košetice – from 1988 Ambient air 01 Weekly Wet deposition 01 Evently Surface waters 04, 02, 10, 12a, 12b, 14 Yearly Sediments 04, 02, 10, 12a, 12b, 14 Yearly Soils 01, 03, 05, 07, 08, 09, 11, 13, 15 Yearly Litter 09 Yearly Spruce and pine needles 05, 07, 08, 09, 13, 15, 16 Yearly Mosses 05, 07, 08, 09, 13, 15, 16 Yearly ‹#› 14 Trends of enivironmental levels of POPs in the CR – regional background monitoring – observatory Košetice – case of PCBs ‹#› 15 Image419 PCBs levels in ambient air in Europe [ng.m-3] m14-6 ‹#› 16 0 5 10 15 20 25 30 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Netherlands Kosetice, CR Rörvik, Swe Pallas, Fin Sum PAH ug/m3 Annual average atmospheric concentrations of PAHs (sum of 12) from four European sites 1996-2001 ‹#› 17 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 1996 1997 1998 1999 2000 2001 Netherlands Kosetice, CR Rörvik, Swe Pallas, Fin pg/m3 Sum PCB 28,52,101,118,153,138,180 Annual average atmospheric concentrations of PCB (sum of seven) from four European sites 1996-2001 ‹#› 18 Regional background observatory Košetice, 1996 – 2002, every weeks, 52 samples per year, annual medians of PAHs [ng.m-3] ‹#› 19 Levels of PCBs, HCHs, DTTs, ambient air (g+s) (CZ, Košetice, 1996-2002, annual medians) – time trends ‹#› 20 Obecné schéma analytického postupu - odběr vzorku - konzervace - transport - skladování - příprava vzorku - extrakce - přečištění, odstranění interferentů - frakcionace - zakoncentrování - derivatizace - analytické stanovení - interpretace dat ‹#› 21 Odběry ovzduší - volné ovzduší - permanentní plyny - těkavé látky - pevné částice - ovzduší v místnostech - pracovní ovzduší - emise - imise ‹#› 22 Techniky odběru ovzduší - odběr plynné fáze do vzorkovnice s pevným objemem - těkavé (kanystr, vak, plynotěsná stříkačka, vyprázdní se do promývačky) - absorpce plynu v roztoku (promývačka, filtr impregnovaný absorpční kapalinou, je třeba kalibrované zařízení na měření objemu) - záchyt plynů na sorbentech (detekční trubičky s aktivním uhlím, silikagelem, polymery, denudery - nezachycují aerosol) - vzorkování pevných částic (vysokoobjemové vzorkovače, odběrové filtry křemenné a polyuretanové, vzorkování respirabilní frakce < 5um- kaskádový a cyklónový impaktor,univerzální vzorkovač VAPS) - pasivní vzorkovače (náplň PUF, amberlit, semipermeabilní membrána, extrakční disk EMPORE ‹#› 23 ‹#› 24 ‹#› 25 ‹#› 26 ‹#› 27 ‹#› 28 ‹#› 29 ‹#› 30 ÄActive sampling – cost, training, power, supporting meteo data KJones_7 ‹#› 31 KJones_5 ÄSuch techniques provide a cheap and powerful tool for obtaining detailed spatially resolved and time trend data relatively cheaply and efficiently. Ä ÄA number of exciting developments have been made in this field in recent years; the utility of passive samplers has been demonstrated for local, national and regional scale monitoring. ‹#› 32 ÄThe general concepts behind passive air sampling have been discussed elsewhere (Ockenden et al., 2001). ÄA sorbent/solid phase sampler is used, to which gas phase POPs can partition (ad-/absorb). ÄThe mass of chemical on the sampler will increase with exposure time (kinetic uptake phase), and approach equilibrium. ÄThe time to equilibrium will vary, depending on the ‘capacity’ of the sampler. ÄThe rate of supply may be influenced by wind speed, deployment conditions and compound. ‹#› 33 The advantages/opportunities of passive air samplers are as follows: ÄLow cost ÄExcellent opportunities for high spatial and temporal sampling resolution data ÄNo power supply needed, easy deployment and little operator training required ‹#› 34 Their disadvantages/constraints are: ÄCurrent techniques are still ‘semi-quantitative’, requiring knowledge of the sampling rate (m3 air sampled/day) and the effects of temperature ÄOptimisation of sampling requires further study, of the effects of wind speed, temperature ÄSampling is efficient for the gas phase component, but generally poorer for the particulate phase ÄThe time to reach gas phase-sampler equilibrium varies widely between POPs ‹#› 35 The development of passive air samplers for POPs is an active area of research. Different designs are being tested/used. There is no consensus yet as to what is the ‘best design’; indeed, it is probable that different samplers will be useful for different purposes (i.e. different time scales; different compounds). ‹#› 36 The most promising techniques deployed so far are: Semi-permeable membrane devices (SPMDs) ÄResearch has been carried out to ‘calibrate’ them ÄSPMDs have been used to show spatial and temporal trends (Meijer et al., 2003) ÄSPMDs have ‘long’ equilibration times (months/years) ÄInterpretation of data is complicated by the presence of 2 phases (membrane and triolein) and the ‘weathering’ of the membrane which can occur over time ÄSPMDs are expensive to use and analyse, and the clean-up and analysis is complicated (Petty et al., 2000) ‹#› 37 Polymer-coated glass (POG) samplers ÄThis technique is very new, but shows considerable promise for short- and medium- time resolution deployments (weeks) (Harner et al., in press) XAD resin samplers ÄThis technique utilises a ‘high capacity’ resin to sample the gas Äphase, and has been deployed on a regional scale study in orth America (Wania et al., in press). ÄIt shows considerable promise as a sampler. ÄPotential problems may include ensuring low blanks and sample clean-up times ‹#› 38 resin-filled stainless steel fine mesh cylinder coarse mesh carabine & loop stainless steel lid bottom part of stainless steel shelter adjustable hose clamps 10.5 cm 15.5 cm XAD-Resin Based Passive Air Sampling System for POPs Wania et al. Environ. Sci. Technol. 2003 R - T & A Frank Wania ‹#› 39 R - T & A Hexachlorocyclohexanes Across North America 0 5 10 15 20 25 30 35 žrelatively uniform across Canada and US žhighest levels in Atlantic Canada žlow levels in central America a-HCH ng/sampler ng/sampler 0 20 40 60 80 g-HCH lindane žlarge differences across North America žhighest levels in Canada Prairies Frank Wania ‹#› 40 Ä~ 25 sites Ä Ä3 month integration (started July 2002) (summer, fall, winter, spring) Ä Äequivalent ~400m3 sample volume Ä Ätargets - PBDEs, PFOS precursors and OCs Ä Äindoor vs. outdoor air – Ottawa, Canada (80 homes, winter 2003) Lake St. Clair Mapping POPs in the Great Lakes Basin Meteorological Service of Canada (Tom Harner) Lancaster University (Kevin Jones) Health Canada (Jiping Zhu) PUF disk passive air samplers -Starting in the summer of 2002, PUF disk samplers were deployed at numerous background sites in the G. Lakes basin. This was a follow-up to a 3-year study in Toronto Canada that investigated urban-rural gradients for various POP classes. For logistical reasons many of the samplers were sited at IADN sampling stations ...IADN is the Integrated Atmospheric deposition Network – a joint Canada/US monitoring program for POPs. This study will give useful, seasonally integrated information on PBDE and other POP levels in the basin that can then be compared to intermittent active air sampling data. These samplers are also being used to assess indoor concentrations PBDEs and fluorinated chemicals – for which we suspect that the indoor environment is the primary emission source to outside air. ‹#› 41 R - T & A Passive sampling Polyurethane foam (PUF) discs ÄThe design and analysis is very straightforward; they are cheap, easy to construct, prepare and analyse (Shoeib and Harner, 2002) Ä ÄInitial studies have characterised their general performance and sampling rates Ä ÄPUF discs have been used for large-scale spatial mapping exercises in Canada and Europe Ä ÄTheir ideal deployment times are typically weeks/months ‹#› 42 ÄSummer sampling campaign ÄSimultaneous passive air sampling ~ 100 sites Provetaker1 PUF disk 14cm x 1.2cm Ethylene Vinyl Acetate coated glass POG (7cm diameter) Bo5copia POPs in air – spatial mapping PASAE Programme – Lancaster Study Across Europe Kevin C. Jones ‹#› 43 Spatial Distribution of å PAHs Largest bar = 10 400 ng/sample (Moscow) POPs in air – spatial mapping pasiv_sampler_whole Kevin C. Jones ‹#› 44 Spatial Distribution of å PCBs Largest bar = 280 ng/sample (Moscow) POPs in air – spatial mapping Kevin C. Jones ‹#› 45 Spatial Distribution of å PBDEs Largest bar = 43 ng/sample (Manchester) POPs in air – spatial mapping Kevin C. Jones ‹#› 46 Spatial Distribution of å PCNs Largest bar = 33 ng/sample (Poland) ‹#› 47 Spatial Distribution of HCB (ng/sample) ‹#› 48 0.2 - 200 >1 100 0.03 – 34 0.1 - 1.3 å PCNs 11 - 50 6 1.4 – 9 0.13 HCB 0.5 - 250 >700 0.06 – 43 0.06 - 1.5 PBDEs 500 - 61 200 >160 64 - 10 400 0.5 å PAHs 20 - 1 700 >100 2.5 - 280 0.03 - 0.64 å PCBs Air conc. [pg/m3] High : Low ratio Measured range (ng/sample) Detection limit (ng/sample) Compounds Summary of results ‹#› 49 R - T & A PASAE Programme – CR Study Zvonarka1.jpg Brno, region Zlín ‹#› 50 R - T & A R-T&A Network gal11 ‹#› 51 Atmosférická depozice - mokrá (přenášená na zem srážkami, převládá v čistých oblastech) - suchá (sedimentací velkých částic atmosférického prachu a vlivem znečišťujících plynů, převládá ve městech) Odběr atmosférické depozice - mokrá (odběr pouze srážek do automatických jímačů) - suchá (funkce koncentrace složky v ovzduší a rychlosti depozice, sběrné nádoby) - součet mokré a suché atmosférické depozice (sběrné nádoby, nálevky) ‹#› 52 Vzorkování vod - srážkové - sběrné nádoby, nálevky - pasivní jímače vody z ovzduší - povrchové -skleněné vzorkovnice - podpovrchové - skleněné vzorkovnice plněné čerpadlem Vzorky vod jsou nestabilní, vytěkávají, precipitují, fotochemicky se rozkládají, mikrobiálně degradují, snadno se kontaminují. Je třeba analyzovat co nejrychleji, konzervovat nebo sorbovat. ‹#› 53 Passive sampling what is it and why? •Time integrated accumulative “sorption” •Non-mechanical •Can overcome other problems with current techniques: filtration/volatilization/sorption losses •Overcomes detection limit problems •“Biomimetic" ‹#› 54 Assumptions and “Sampling Rates” Assumption1 c t csampler ‹#› 55 Arthur, Pawliszyn et al. Davidson & Zhang Alvarez. Huckins. No extracation or cleanup! Low capacity/duration SPME Metals. Well developed gel processing DGT Hydrophilic. Under development. POCIS Hydrophobic. Greatest application since 1990s. SPMD IMGP0613 (Small) Modern Aquatic Passive Samplers dirtyspmdmembranes (Small) 2weekdgt clean POCIS with tin putrid-pocis2 (Small) ‹#› 56 “Empore®?” modern empore Mills and Thurman PTFE & silica-bound analytical grade sorbents – can we bring the laboratory to the field? US DoE 3m empore sem2 ‹#› 57 First study: Norman Creek ‹#› 58 1mL analysed via LCMS/MS AcetoneExtract green extract 5 min 5mL Acetone 5 min 10mL C8H18+ C4H8O2 . pipette N2 blowdown 5-20 min Rotary Evap 5-15 min geoff2 Extraction and Analysis Ultrasonic bath ‹#› 59 Herbicide (low Kow)“Sampling Rates” Data point from C18 day 1 excluded; means from duplicate samples ‹#› 60 SPMD - Semipermeable membrane device - selektivní vzorkovač organických polutantů - dialyzní vak nebo membrána, lipidická náplň - založeno na průniku látek polopropustnou membránou - jde o integrativní pasivní vzorkovač - selektivní pro lipofilní sloučeniny - vzorkuje pouze biodostupnou frakci - odhad distribuce mezi vodou a vzorkovačem: Kow - pro vzorkování vody, vzduchu, půd, kalů - nevýhoda: vztah mezi celkovým a biodostupným množstvím polutantů spmd_photo •mimics uptake of dissolved contaminants by biota (estimation of bioaccumulation) (designed by Huckins et al.; U.S. Geological Survey) Semipermeable Membrane Device (SPMD) Thin film of triolein (“lipid phase”) encolsed in a lay-flat LDPE membrane. •applicable for sampling of more hydrophobic POPs in water and air 61 ‹#› 62 foto227 Albrecht_im_Spittelwasser Safira4 Water monitoring using SPMDs Elke_ in_Mulde 62 ‹#› 63 63 Membrane-enclosed SPME fibre for passive water sampling Membrane Coil spring (stainless steel) PDMS-coated SPME fibre Fluid filling ‹#› 64 Foto1 MESCO-Streifen+ Käfig 64 MESCO strips and bare silicone rods … …before and after field exposure ‹#› 65 65 Comparison of TWA water concentrations (SPMDs vs. bare SRs) ‹#› 66 •To which extent biofouling and precipitation reduce the membrane permeability of the MESCO strips? ß Evaluation of LDPE dialysates and of PRC elimination! •Are the uptake kinetics in bare silicone rods flow-rate dependent (in the tested range of water flow)? ß Additional analysis & statistical evaluation of data! 66 •Where is the lower lipophilicity limit for an effective enrichment of compounds in silicone tube/rod material? ß Non-target analysis of additional rod specimen! ‹#› 67 Problem j0186164 BS01890_ Can environmental aqueous concentrations of pollutants be calculated from the analyte levels accumulated in an integrative passive sampler? ‹#› 68 Aims •To develop national standard for passive sampling technology •To develop low cost design of sampler appropriate for wide range of analytes •To produce robust calibrations (with internal standardisation, and inter-laboratory QC) for a wide range of priority pollutants: –priority organic pollutants (polar and non-polar) –endocrine disruptors –surfactants –organo-metallic species –metals • ‹#› 69 Sampler construction 06200006 Samplers integrate pollutant concentration over time. ‹#› 70 Functional principles of a passive sampler Diffusional path δ Receiving phase Diffusion limiting membrane Aqueous diffusional layer Water phase (Donor phase) Cw Cs Cwi Cmo Cmi Csi ‹#› 71 Three phases of passive sampler uptake CW = constant ‹#› 72 Calibration of a passive sampler in a flow-through system Peristaltic pump 30 ml/min Peristaltic pump 100 ml/min Exposure tank Water waste water Stirrer Chemicals in MeOH Water reservoir Samplers Analytes In MeOH ‹#› 73 A standardised flow-through calibration system protoype 002 ‹#› 74 Uptake kinetics of selected pollutants Non-polar sampler, no stirring (·) Polar sampler, stirring at 40 rpm (·) Rs = substance specific sampling rate (L/d) ‹#› 75 Sampling rates of PAHs effect of hydrodynamics Temperature = 11°C ‹#› 76 • •Use of calibration data for estimating analyte water concentration in the field is not straightforward. • Use of calibration data é Calibration conditions should approximate field conditions unless é Performance Reference Compounds are used ‹#› 77 Performance reference compounds •PRCs are (analytically) non-interfering compounds added to the sampler prior to exposure. •The use of PRCs - an in situ calibration/recalibration approach, where the rate of PRC loss during an exposure is related to the target compound uptake. • • This is accomplished by measuring PRC loss rates during calibration studies and field exposures. • •Concept was developed by Huckins, Booij et al. for SPMDs • ‹#› 78 Extraction manifold used for loading the sampler with PRCs manipht ‹#› 79 Use of performance reference compounds PRC = D10-Biphenyl Temperature = 11°C CSAMPLER(0) ¹ 0 Cw = 0 ‹#› 80 Correlation between offload of PRCs and uptake of target analytes D10-Acenaphthene ‹#› 81 Distinguishing between the availability and the activity of organic chemicals ‹#› 82 Presence Availability Activity Total mass Fraction of total mass Measure that drives diffusion and partitioning How much is there? How much is available for ... ? How high is the diffusive pressure into other media? Exhaustive Extraction Depletive Extraction/ Sampling Equilibrium Sampling Devices ‹#› 83 The presence of contaminants do not determine risk •Presence: –What is the total concentration in the soil? –How much enters the ground water? –Is the total concentration below a level of x mg/kg? • •Concentrations of PAHs in asphalt are very high, but these PAHs are generally not available •Concentrations of phtalates in plastic can be in the % range, but they are normally not available ‹#› 84 General view on (bio)availability •only a fraction is available •the remaining fraction is strongly bound –binding reduces risk –strongly bound pollution is difficult to remove ‹#› 85 How to measure (bio)availability? many methods and concepts! •1) Determine contaminant uptake or effects •2) Mild solvent extractions and supercritical fluid extractions • •3) Depletive sampling: Sorbent particles are added for the continuous trapping of available molecules ‹#› 86 Mixing of sorbent particles into soil to trap available molecules e.g. Cornelissen et al. 2001 •Mix sorbent particles into soil •Available molecules are constantly trapped by the sorbent particles •Separate sorbent from soil and measure what is bound to sorbent • This method measures the quantity that can become available within a given period of time ‹#› 87 •Availability can describe the amount that can be taken up by digestion • •Availability can describe the amount that can be degraded by micro-organism • •Availability can describe the amount that can be washed out • •Availability can not describe diffusion and partitioning processes ‹#› 88 •Activity (a) drives diffusion and partitioning: HIGH Ô low • •Activity is proportional to Cfreely dissolved and to fugacity (f) • •Thermodynamic equilibrium: asediment = ainterstitial water = aworm • ‹#› 89 Equilibrium Sampling Devices (Mayer et al., 2003) •1. Bring (passive) sampler into equilibrium with surrounding medium (asampler=amedium) •2. Measure concentration in sampler •3. Apply conversion factor to determine activity, fugacity or dissolved concentration • • ‹#› 90 Measuring activity with Equilibrium sampling devices Thermometer ESD Equilibrium Sampling Stable temperature indication after known response time Stable concentrations in ESD after a known response time Negligible impact by sampler Heat capacity of thermometer is kept below that of the sample to avoid temperature change. Sorption capacity of ESD is kept below that of sample in order to avoid depletion. Response time Thermometer needs to respond faster than fluctuations to be measured. Response time of sampling device needs to be shorter than the fluctuations to be measured ‹#› 91 ESD in sediment, soil and sludge: matrix-SPME (Mayer et al. ES&T, 2000, V34: 5177-5183) ¬polymer coated fiber is equilibrated with sediment » 1µL PDMS in 10 ml sediment CPDMS is measured by gas chromatography Desorption at 275oC and trapping at 50oC ®Conversion: a=Cpolymer/Spolymer,L Cdissolved=Cpolymer/Kpolymer,water f = Cpolymer/Zpolymer ‹#› 92 Glas Pincet Equilibrium Sampling in sediment and soil (suspensions) ‹#› 93 Injection and Measurement on GC > maaling ‹#› 94 Activity in sediment (Kraaij et al, ES&T, 2003, V37: 268-274) > ‹#› 95 Effective concentration for biological uptake (Kraaij et al, ES&T, 2003, V37: 268-274) 0,01 0,1 1 10 100 1000 0,01 0,1 1 10 100 1000 C B,predicted (mg/kg lipid) C B,measured (mg/kg lipid) BkF BbF ‹#› 96 •Activity differences indicate the direction of diffusion between for instance sediment - water - air •Activity measurements can be used to determine exposure levels in heterogeneous multimedia systems such as soil or sediment •Activity can not describe amounts that are available for..... ‹#› 97 Examples ‹#› 98 Strong binding of PAHs to Soot •Danish Example: “Stuck soil” –Soil with high soot content –Initial degradation of PAHs –Degradation stopped before reaching Danish threshold levels –Likely reason: remaining PAH not available to degraders •Important questions: –Does the remaining PAH represent any risk? –Can it be made available for the degradation process? ‹#› 99 PAHs in “stuck” soil (Denmark) •Presence: high •Availability: low •Activity: low Characterisation: low risk and very limited possibilities for remediation ‹#› 100 PCBs in aged sediment from Netherlands •Characterisation: No acute risk, but slow release possible. Slow remediation possible. Presence: medium Availability: medium Activity: low ‹#› 101 Conclusions •Pollution can be characterised based on presence, availability and activity - all three parameters can be measured • • Presence: how much is there? Availability: amounts that might lead to risks and amounts that might be degraded Activity: partitioning and diffusive pressure ‹#› 102 Techniky přípravy environmentálního vzorku Cílem je přenos analytu do jiné chemické fáze vhodné k analýze, odstranění interferentů a zakoncentrování. Hlavní techniky: - extrakce rozpouštědlem ( Soxhlet, Soxtec, mikrovlnná a ultrazvuková extrakce, superkritická fluidní extrakce) - extrakce a mikroextrakce na pevnou fázi (SPE, SPME) - separace na semipermeabilní membráně - analýza rovnovážné plynné fáze (head space) - kolonová kapalinová chromatografie - gelová permeační chromatografie ‹#› 103 ‹#› 104 ‹#› 105 ‹#› 106 ‹#› 107 Outline •Why do we have to study particulate matter (PM)? • Toxicology versus chemical analysis. • •Hot pressurized water fractionation. • •Toxicity assays on PM fractions. • •Chemical characterization of PM fractions. • •Impacts on future work. ‹#› 108 What do we know about particulate matter (PM)? •Epidemiological and Inhalation Studies • •Adverse health effects of PM •Particle size and chemical composition have impact •Inorganics and nonpolar organics are linked to toxicity •How about polar organics?? • Only nitroaromatics have been studied. Polar PM Fractions are Toxic Toxicological Studies •Organic solvent fractionation coupled with in vitro toxicity assays ‹#› 109 What do we know about PM? •Chemical Characterization of PM • •Inorganics well characterized •Organics • –Mainly nonpolar species are identified. – Organic solvent extraction followed by GC/MS analysis. • ADVANTAGE determination of hundreds of organics • DISADVANTAGE represents only 20%-50% of organic PM • –Polar organics are present in significant concentrations, but require specific analytical methods. – They are ignored in toxicological studies. – Typical OC content 5% 5 µg/m3 (Aero 23,119) monocarboxylic acids 200 ng/m3 C16, C18 dicarboxylic acids 150ng/m3 (aero 167) dicarboxylic acids 90-1000 ng/m3 (aero 128 kawamura) ‹#› 110 Polar species Toxicology Chemical analysis Background ‹#› 111 Particulate matter Fractionation with hot pressurized water Polar Nonpolar In vitro toxicity - oxidative stress - genotoxicity - cytotoxicity fractions Analysis GC/MS ICP/MS LC/MS Approach ‹#› 112 25°C 300°C dielectric constant (e ) 80 20 polarity high low similar organic solvents none methanol, acetonitrile compounds extracted high polarity low polarity (e.g. strong organic acids) (e.g. PCBs, PAHs) Why Hot Pressurized Water? •The polarity can be controlled with change of temperature. •As the polarity of water is controlled, solubility is controlled. ‹#› 113 Model PM Samples •Wood Smoke Particulate Matter (polar) • lignin pyrolysis products • methoxy phenols • methoxy benzoic acids • benzaldehydes • •Diesel Exhaust Particulate Matter (nonpolar) »polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) »unresolved complex matrix (UCM) =branched alkanes • initially other tests such as Polytox (based on bacterial respiration) and mitochondrial respiration whare evaluated. Both test required larger quantities of samples, the polytox was not sensitive enough. ‹#› 114 Hot Pressurized Water Extracts of Diesel Exhaust PM ‹#› 115 In vitro toxicity assays • •Oxidative stress of PM Depletion of glutathione (GSH) • • • •Genotoxicity Bacterial test SOS Chromotest • • • •Cytotoxicity Cell viability test (MTT assay) • Cell lines related to respiration system - Macrophages RAW 264.7 Based on the b-galactosidase synthesis Mammalian COS cells ‹#› 116 Toxicity of Diesel Exhaust Particulate Matter 25 50 100 150 200 250 300 Extraction Temperature, °C Cell viability test 40 60 80 100 120 200 µg/mL 78 71 56 44 35 27 20 Dielectric constant, e 50 µg/mL 0 20 40 60 80 100 120 Depletion of glutathione (GSH) 25 50 100 150 200 250 300 50 µg/mL Genotoxicity 0 1 2 3 25 50 100 150 200 250 300 ‹#› 117 Diesel Exhaust PM Toxicity versus Analysis •Polar 50°C Fraction - cytotoxic and depletes GSH • • possibly dicarboxylic acids and aldehydes – – •Midpolar Fractions (100°- 200°C) - genotoxic • • nitropyrene ( representative of nitro polyaromatics) in 150°-200°C fractions • • dinitro- or nitro-, and oxyaromatics in 100°C fraction? – – •Nonpolar fractions - cytotoxic and deplete GSH • toxicity of 250°C > 300°C fractions • • possibly species other than PAHs (oxy- and nitro- polyaromatics) • ‹#› 118 Toxicity of Wood Smoke Particulate Matter 50 µg/mL 0 20 60 100 140 Depletion of glutathione (GSH) 100 µg/mL 40 60 80 100 25 50 100 150 200 250 300 Extraction Temperature, °C 78 71 56 44 35 27 20 Dielectric constant, e Cell viability test 25 50 100 150 200 250 300 ‹#› 119 Distribution of Organics in Wood Smoke Particulate Fractions Collected at Different Temperatures 0 500 1000 1500 2000 25 50 100 150 200 250 300 Acids & Acids ME Alcohols/Aldehydes Phenols 0 2000 4000 6000 8000 25 50 100 150 200 250 300 Guaiacol derivatives Syringol derivatives Other lignin pyrolysis products 0 200 400 600 25 50 100 150 200 250 300 Extraction Temperature, ºC OxyPAHs PAHs 0 200 400 600 25 50 100 150 200 250 300 Extraction Temperature, ºC Guaiacol dimers Syringol dimers Other lignin pyrolysis products ‹#› 120 What is the Source of Oxidative Stress in Midpolar Fractions (100°-150°C)? 3-ring PAHs? OxyPAHs? Syringol dimers? % MCB Control % MCB Control phenanthrene benzo[e]pyrene benzo[a]pyrene 1-methylpyrene pyrene 0 10 20 30 40 50 60 Concentration, µg/mL 0 100 200 300 400 PAHs Concentration, µg/mL 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 100 200 300 OxyPAHs Significant Glutathione Depletion Anthraquinone Xanthone Fluorenone Anthrone 1,8-dihydroxyanthraquinone 1-hydroxypyrene 9,10-phenanthrenequinone 1-nitropyrene ‹#› 121 Wood Smoke PM Toxicity versus Analysis •Both polar and nonpolar fractions - cytotoxic • - deplete glutathione » » » • – •Midpolar fractions (150°-250°C) - deplete GSH (more) • • oxyPAHs, PAHs, syringol dimers? • – – •No genotoxicity - before and after metabolic activation • ‹#› 122 ØHot pressurized water can selectively extract organics. Conclusions ØSignificant toxicity was found in the polar fractions which are omitted by typical characterization of particulate matter. ØHot pressurized water can replace polar and nonpolar organic solvents. ØWater is suitable for toxicological tests. ‹#› 123 Hot Pressurized Water Extraction Apparatus ‹#› 124 Polarity of Hot Pressurized Water Decreases with Temperature Supercritical water Liquid water methanol o -nitrotoluene ethanol 2-butanone benzaldehyde methylamine phenol PAHs PCBs benzene CCl 4 25ºC 374.9 ºC ‹#› 125 Majority of Extracted Mass from Wood Smoke Particulate Are Organics Extraction Temperature, °C 0 2 4 6 8 10 12 25 50 100 150 250 300 200 0 2 4 6 8 10 12 25 50 100 150 200 250 300 Extracted Mass Carbon Organic compounds (TOCx2.4) Organic compounds (TOCx1.4) Total organic carbon Inorganics are Present in Polar Fraction of Diesel Exhaust Particulate Glutathione – is antioxidant occurring at high concentrations in lung tissues. (0.1-10 mM in vivo) Its sulfhydryl group (cysteinyl) is responsible for its antioxidant properties (tripeptide consisting of glutamate, cystein and glycine ‹#› 126 Go” molecules. To use this method to predict exposure and uptApproach: Evaluate the abilities of water desorption and mild supercritical carbon dioxide extraction (SFE) to predict bioavailability of PAHs from abandoned manufactured gas plant soils, soots, and sediments. ‹#› 127 PAHs are regulated on based on their total concentrations, but earthworm toxicity and soil PAH concentrations are not necessarily related. Soil Sample CG-12 CG-3 Total PAH Concentration mg/Kg 3800 4100 Earthworm Mortality 100% alive 100% dead ‹#› 128 What is SFE (Supercritical Fluid Extraction)? •High pressure CO2 is pumped through a sample, and extracted organics are collected in a suitable solvent for GC analysis. •Typical SFE conditions: –100 to 400 bar (density of ca. 0.4 to 0.9 g/mL) –40 to 150 oC –1 mL/min with a 1 to 10-gram sample – Why use supercritical carbon dioxide? 1.CO2 is a lipophilic solvent much like biological lipids in polarity 2.PAH solubilities in CO2 are proportional to those in water, but ca. 104 higher. ‹#› 129 How do we evaluate “Environmentally-Relevant” extractions? >>Compare “selective” SFE extraction methods to: * Bacterial bioremediation at one field site * Earthworm uptake and/or toxicity (Cornell) * Long-term water desorption (U. of Texas, Austin) >> Seven oil gas and seven coal gas sites. ‹#› 130 Test Case #1: Bioremediation of PAHs on an MGP Soil Site: Soccer-sized field, ca. 50 cm deep Treatment: Bioremediation with tillage and nutrients for one year. PAHs: 2 to 6 ring (MW from 128 to 278), 7000 mg/kg Approach: Compare selective SFE behavior to remediation progress. SFE rates (single condition) mimic bioremediation (1 min SFE=10 days bioremediation) Bioremediation (1 year) SFE (40 min.) Samples provided by GTI and MidAmerican Energy 0 20 40 60 80 100 0 100 200 300 400 Bioremediation time (days) 0 20 40 60 80 100 0 10 20 30 40 SFE time (minutes) 1-methylnaphthalene phenanthrene fluoranthene benz[a]anthracene SFE rates (single condition) mimic bioremediation (1 min SFE=10 days bioremediation) Bioremediation (1 year) SFE (40 min) ‹#› 133 SFE conditions were developed on samples from the field bioremediation studies described earlier. These “magic” conditions were tested with 7 oil gas and 7 coal gas sites by comparing SFE (120 minutes) and water desorption (120 days) rates. ‹#› 134 ‹#› 135 Oil gas samples are pure soot, or soot diluted with soil. Total EPA PAHs: 150 to 40000 mg/kg Carbon contents from 3 to 87 wt.% HIGHLY aromatic (poly “chicken wire”)--very high C/H ratio and “fixed” carbon. Coal gas samples are coal tars mixed with soil. Total EPA PAHs: 300 to 15000 mg/kg Carbon contents from 3 to 29 wt.% Carbon type more similar to normal soils (lower C/H ratio, and “fixed” carbon. ‹#› 136 Supercritical CO2 Water Desorption Minutes of SFE Desorption Mimic Days of Water Desorption Water Desorption Time (Days) SFE Time (min) ‹#› 137 Earthworm Mortality Depends on Available PAHs (measured by SFE), Not on Total PAH Concentrations Soil Total PAH Available Available Total (ug/g soil) Fraction (SFE) PAH (ug/g C) % Mortality CG15 1020 0.25 1040 0 OG14 168 0.46 2720 0 CG11 15600 0.06 3280 0 CG12 3790 0.16 7880 0 OG17 17200 0.27 9720 0 OG5 1870 0.41 11100 0 OG10 42100 0.33 16300 0 CG3 4100 0.83 45700 100 OG18 17300 0.74 50100 100 ‹#› 138 Conclusions •SFE mimicked bioremediation for a one-year field treatment –1 min. SFE = ca. 10 days bioremediation •SFE “mobile PAHs” correlate with water desorption for 15 oil and coal gas sites (1 min. SFE = ca. 1 day water desorption) •Chemical measures of PAH availability improve predictions of bioavailability to worms •Mortality was related to “available” PAHs, not “total” PAHs • ‹#› 139 Nejčastější techniky stanovení organických látek v environmentálních vzorcích jsou chromatografické: - GC - HPLC - HRGC - GC-MS, LC-MS ‹#› 140 Chromatografie je fyzikální metoda separace, při které jsou separované sloučeniny distribuovány mezi dvěma fázemi, z nichž jedna je stacionární a druhá mobilní. Chromatografický proces probíhá díky opakované sorpci a desorpci sloučenin ve vzorku během kontaktu se stacionární fází. Separace sloučenin je způsobena rozdílností distribučních konstant jednotlivých sloučenin v daném separačním systému. Výsledkem tohoto procesu je rozdílná migrace chromatografovaných sloučenin. ‹#› 141 Klasifikace chromatografických technik podle: - skupenství mobilní fáze (GC, LC) - tvaru chromatografického lože (plošné, kolonové) - polarity chromatografického systému (normální, reverzní) - změny experimentálních podmínek (izokratické, gradient) - separačního děje (adsorpční, rozdělovací, iontoměničová, gelová, afinitní) - použití (analytická, preparativní) ‹#› 142 Plynová chromatografie - mobilní fází je plyn (inertní a dostatečně čistý, např. He) - stacionární fází je adsorbent s velkým povrchem nebo kapalina zakotvená na povrchu inertního nosiče - chromatografický děj probíhá na koloně (kolony náplňové a kapilární, různého průměru) - náplňové - modifikovaná stacionární fáze - kapilární kolony - úprava vnitřního povrchu křemenné kapiláry, deaktivace, chemická modifikace, smočení, imobilizace, síťování ‹#› 143 Instrumentace - zdroj nosného plynu (tlakové láhve, filtry) - pneumatický systém (regulátory tlaku a průtoku) - injektor (split, splitless, vyhřívání) - termostat kolony (gradientové programování teploty) - detektory - univerzální a selektivní - destruktivní a nedestruktivní - koncentrační a hmotové ‹#› 144 ‹#› 145 ‹#› 146 Typy GC detektorů - plamenový ionizační FID (hořící plamínek, elektrody) - selektivní na dusík a fosfor NPD (alkalický kov) - elektronového záchytu ECD (radioaktivní izotop, kolize) - tepelně vodivostní TCD, katarometr (žhavené vlákno) - plamenový fotometrický FPD - atomový emisní AED - fotoionizační PID - elektrický vodivostní ELCD ‹#› 147 ‹#› 148 ‹#› 149 Spojení GC s jinými technikami - GC-MS - GC-AES - GC-FTIR - vícerozměrná chromatografie (GC-GC) - vícemodální chromatografie (GC-LC) ‹#› 150 Dvourozměrná plynová chromatografie je jeden z nejúčinnějších nástrojů v analýze komplexních matric. Je založena na kontinuálním sběru efluentu z GC kolony a periodickém nástřiku do druhé kolony odlišných vlastností, čímž se zachová separace z první kolony a přidá nová. Jádrem systému je rozhraní, které obe kolony spojuje. Bez něj by nemusela zůstat zachována separace z první kolony: Modulátory - termální - kryogenní (chlazený CO2 nebo N2) - ventilový ‹#› 151 Využití: - lepší separace a citlivost - vzorky environmentálních matric - potraviny, léčiva, kosmetika - analýza ropy - odpady a odpadní vody ‹#› 152 Kapalinová chromatografie - mobilní fází je kapalina, často směs různých rozpouštědel - stacionární fází je sorbent (nejčastěji chemicky modifikovaný silikagel, alumina, polymer, uhlík) - chromatografický děj probíhá na koloně - normální a reverzní uspořádání - eluce izokratická nebo gradientová - změna teploty, tlaku, složení mobilní fáze ‹#› 153 Instrumentace - filtrace a odplynění mobilní fáze - čerpadla mobilní fáze (regulátory tlaku a průtoku) - automatické dávkovače a injektory - termostat kolony - detektory ‹#› 154 ‹#› 155 Typy detektorů - fotometrické (měří se absorbance,UV, DAD) - luminiscenční (emise světla při přechodu molekuly z excitovaného do základního stavu, fluorescence a fosforescence) - elektrochemické (konduktometrické, amperometrické, coulometrické) - refraktometrické - hmotnostně spektrometrické ‹#› 156 Aplikace kapalinové chromatografie - podle použití - analytická - preparativní - podle fáze - normální - reverzní - podle interakcí - adsorpční - iontově výměnná (ionexy) - exkluzní (GPC- separace molekul na základě jejich velikosti a tvaru) - spojení s dalšími technikami - LC-MS - LC- NMR ‹#› 157 ‹#› 158 ‹#› 159 ‹#› 160 ‹#› 161 Základy hmotnostní spektrometrie - MS a NMR jsou dvě rozhodující techniky ve strukturní analýze - MS má výhodu jednoduchého spojení se separačními technikami - MS je destruktivní technika, molekuly jsou ionizovány odtržením elektronu (nevratný proces), vzniklý molekulární ion má hmotnost m a náboj z (měříme poměr m/z), je nestabilní a dále fragmentuje - ve spektru sledujeme molekulární ion i fragmenty ‹#› 162 Princip metody - separace ionizovaných molekul analyzované látky a jejích fragmentů podle velikosti poměru m/z (podle hmotnosti) - identifikace na základě distribuce hmotností molekulového ionu a vzniklých fragmentů - techniky - scan - SIM ‹#› 163 Instrumentace hmotnostní spektrometrie - iontový zdroj - pro ionizaci nárazem elektronu (tvrdá) - záchytem elektronu (negativní ion) - chemická ionizace (ionizuje se ionizační médium, např. methan, měkká technika) - analyzátor - kvadrupólový - iontová past (trojrozměrný hyperbolický Q) - jednoduchá nebo vícenásobná fokusace - elektrické nebo magnetické pole - detektor - elektronový násobič - fotonásobič ‹#› 164 ‹#› 165 ‹#› 166 ‹#› 167 Spojení MS se separačními technikami - GC může být připojena přímo, kapilární kolona je vedena do iontového zdroje - u LC a CE je třeba odstranit nadbytek mobilní fáze, HPLC a MS musí být spojeno přes interface: - particle beam (PB,tryskový separátor těžších molekul) - thermospray (TSI,ionizace při vypařování ionů,měkká) - electrospray (ESI,) - APCI (ionty z mobilní fáze působí jako reakční plyn) ‹#› 168 HPLC-NMR, HPLC-MS, HPLC-NMR-MS - analýza environmentálních vzorků s neznámými polutanty, bez cílových sloučenin - analýza nebezpečných odpadů a odpadních vod - směsi látek s rozdílnou polaritou, koncentrací, těkavostí - produkty transformací chemických, fotochemických, mikrobiologických ‹#› 169 Spojení HPLC-NMR vyžaduje - průtokovou celu - odstranění nadbytku solventu Lze pracovat v průtokovém, právě tak jako ve stopped flow módu. Citlivost NMR je o několik řádů než u MS, ale NMR dává nenahraditelné informace o struktuře látek. Výhody - strukturní informace - vhodné pro široké spektrum analytů (labilní, netěkavé, polární) - nedestruktivní metoda ‹#› 170 HPLC-MS - tlak na vývoj nových systémů rozhraní, tvorby vakua, ionizace - umožňuje stanovení molekulární hmotnosti a prvkového složení, což není možné NMR. - jedná se o komplementární metody HPLC-NMR-MS efluent se rozdělí: 95% NMR, 5% MS ‹#› 171 Klasická chemie zahrnuje reakce látek v základním (nejnižším) energetickém stavu (S0). Fotochemie se zabývá reaktivitou stavů o vyšší energii – stavů excitovaných (např. S1). ‹#› 172 Jablonskiho diagram ‹#› 173 ‹#› 174 ‹#› 175 Cesty vedoucí ke ztrátě excitace ‹#› 176 ‹#› 177 ‹#› 178 „Time-resolved“ experimenty ‹#› 179 Nanosekundová laserová záblesková fotolýza: 1 - laser; 2 - optická clona; 3 - zdroj UV záření; 4 - kyveta se vzorkem; 5 - monochromátor, fotodetektor a osciloskop. ‹#› 180 Pikosekundová laserová záblesková fotolýza: 1 - laser; 2 - optická clona; 3 - optická cesta určující zpoždění pulzu; 4 - kyveta se vzorkem; 5 ‑ monochromátor, fotodetektor a osciloskop. ‹#› 181 ‹#› 182