1 Složení buněčné stěny Primární stěna, sekundární stěna, střední lamela Primární stěna a střední lamela vzniká během buněčného dělení. Střední lamela tvoří interface mezi primárními stěnami buněk. Při diferenciaci vytvářejí buňka tzv. sekundární stěnu, vytvářející komplexní strukturu. Obr. 2.3, 2.4 - S1-S3 - sekundární stěny Buněčná stěna je tvořena komplexy polysacharidů, proteinů a aromatických látek, které vytvářejí strukturu podobnou železobetonu. Některé složky tvoří vlákna, jiné zase výplň mezi těmito vlákny. Chemické složení a uspořádání jednotlivých komponent se liší v závislosti na druhu rostliny a typu buňky. Cukerná složka je tvořena aldosami a ketosami: nejdůležitějšími cukernými složkami buněčné stěny je D-glukosa a její epimery D-mannosa a D-galaktosa, které se mohou vyskytovat ve své oxidované formě, kys. D-glukuronové, D-galakturonové a Dmannuronové. D-xylosa, pentosa v pyranozni formě, vzniká dekarboxylací kys. Dglukuronové. Další pentosou vyskytující se převážně v rostlinné říši je L-arabinosa. Buněčné stěny rostlin obsahují dále deoxysacharidy, které vznikají redukcí na uhlíku č.6, a to L-rhamnosu (6-deoxy-L-mannosa) a L-fukosu (6-deoxy-L-galaktosa). Obrázek struktur 2.9 Tyto sacharidy se vyskytují v buněčné stěně v polymerní formě. Základní stavební jednotkou polysacharidové složky je cellobiosa (β-D-glukosyl-(1-4)-D-glukosa), kde jsou dvě glukosové jednotky vázány β-glykosidovou vazbou přes uhlík č.4. Další alternativou je β-glykosidová vazba přes uhlík č.3. Tento disacharid se nazývá laminaribiosa (řasa Laminaria?). Monosacharidové jednotky mohou být vzájemně vázány prostřednictvím hydroxylových skupin v různých polohách, a to α- nebo βglukosidovou vazbou, takže vzniká složitá rozvětvená síť polysacharidů. Obr. 2.10 Základní složky vláknitých polysacharidů Celulosa je nejhojnějším vláknitým polysacharidem. Tvoří 15 - 30% hmotnosti primární buněčné stěny a ještě více je obsažena v sekundární buněčné stěně. Rigidnost struktury celulosového vlákna, na rozdíl od vlákna amylosy (kdy jsou glukosové jednotky vázané α-1,4-glykosidovými vazbami) je přítomnost vodíkové vazby mezi vodíkovým atomem na uhlíku č.3 a kyslíkem pyranosního kruhu ((Obr.2.11) Celulosa existuje ve formě mikrofibril (B-jednoduchá mikrobfibrila), kde jsou jednotlivé paralelní řetězce celulosy vázané vodíkovými vazbami. Mikrofibrily rostlin obsahují průměrně 36 celulosových vláken. Jednotlivé polysacharidové řetězce, dlouhé 2 - 3 µm, obsahují několik tisíc jednotek a jsou oproti sobě vzájemně posunuty, takže celková délka mikrofibily může dosahovat několik stovek mikrometrů. Dalším, vzácnějším polysacharidem je kalosa., kde jsou jednotlivé molekuly glukosy vázány β-1,3-glykosidovou vazbou. Sekundární struktura kalosy vytváří dvojitou nebo trojitou nebo šroubovici. Kalosa vzniká v buňce rostlin ve specifických stádiích vývoje a je syntetizována při napadení rostliny patogenem. 2 Dalším strukturálním sacharidem rostlin, který je vyskytuje pouze u řas jsou tzv. xylany a mannany? Matrixové polysacharidy. Tyto glykany vytvářejí příčné vazby a vyplňují strukturu stěny mezi celulosovými mikrofibilami, ke kterým se vážou vodíkovými vazbami. Jejich roli lze přirovnat k roli betonové složky v železobetonu. Jsou tvořeny rozvětvenými heteropolysacharidy. Díky své vyšší rozpustnosti v alkalickém prostředí byly dříve nazývány "hemicelulosa", protože byly mylně pokládány za prekurzory celulosy. Matrixové složky propojují vláknité polysacharidy a vytvářejí složitou síť. Hlavním typem těchto rozvětvených matrixových polysacharidů jsou xyloglukany (XG) a glukuronoarabinoxylany (GAX). Hlavní kostra těchto polysacharidů je tvořena Dglukosou vázanou β-1,4-glykosidovými vazbami. XG tvoří součást buněčných stěn všech dvouděložných rostlin a poloviny jednoděložných. Buněčná stěna ananasovitých rostlin a palem obsahuje zejména GAX. Lineární řetězce XG jsou v poloze č. 6 modifikovány α-D-xylosou. Některé z těchto xylos mohou být navíc substituovány α-L-arabinosou nebo β-D-galaktosou a α-L-fukosou. Substituce základního lineárního řetězce XG se u jednotlivých rostlin může lišit. Většina dvouděložných a polovina jednoděložných obsahuje fukosa-galaktosové substituenty, avšak např. lilkovité? rostliny mohou obsahovat navíc L-arabinosu. Obr. Typická struktura xyloglukanu 2.12 Struktura glukoarabinoxylanů je mnohem rozmanitější. Tento polysacharid je v aspoň v malém množství obsažen v buněčných stěnách všech krytosemených rostlin. Poloha substituce a její složení kolísá. Jedná se zejména o L-arabinosu a kys. Dglukuronovou. U commelinoidních? rostlin, kde je GAX hlavním matrixovým polymerem, je substituentem L-arabinosa vázaná α-1,3 vazbou. U dvouděložných rostlin je L-arabinosa vázaná α-1,2 vazbou. Obr. Typická struktura glukoarabinoxylanu 2.12 CD Třetím nejhojnějším polysacharidem propojující fibrilární polysacharidy jsou 1,4-1,3glukany. Tento polysacharid najdeme u obilnin a trav. Jejich kostra je tvořena z cellotriosy a cellotetraosy, které jsou vzájemně propojeny β-1,3-glykosidovou vazbou. Dlouhé řetězce tohoto polysacharidu jsou vzájemně propojeny oligosacharidem složeným z β-1,4 glukosy. Obr. 2.14 Všechny krytosemenné rostliny obsahují v malém množství další polysacharidy propojující mikrofibirily. Jsou to lineární polysacharidy, obsahující na rozdíl od celulosy β-1,4-D-mannosu (mannany), která může být substituována v poloze 6 α-Dgalaktosou (galaktomannany), anebo β-1,4-glukosu s D-mannosou (glukomannany). Obr. 2.15 Pektiny Pektiny jsou směs rozvětvených heteropolysacharidů obsahujících zejména kys. Dgalakturonovou, která bývá velmi často esterifikována methanolem. Z buněčných stěn se snadno extrahují Ca2+ chelátory, jako je oxalát amonný, EDTA nebo EGTA. Díky 3 přítomnosti náboje hrají v buněčné stěně roli nejen strukturní, ale ovlivňují porozitu stěny, díky zápornému náboji ovlivňují iontovou rovnováhu, regulují adhezi buněk ke střední lamele. Podílejí se na rozpoznaní přítomnosti patogenů či symbiotických organismů. Existují dva základní typy pektinů. první z nich je homopolysacharid homogalakturonan, druhý typ je heteropolysacharid: rhamnogalakturonan. Obr. Struktura homogalakturoinanu a rhamnoigalakturonanu. Základní kostra homogalakturonanu je polymer složený z α-1,4-D-galakturonové kyseliny (až 200 jednotek). Tato může být substituována xylosou.Základní kostra rhamnogalakturonanu I je složena z opakujících se disacharidových jednotek α-1,2-Lrhamnosa-α-1,4 D-kys. galakturonová. Existují dva základní typy modifikovaného homogalakturonanu. První z nich je základní kostra lehce modifikovaná xylosou v poloze 3 (xylogalakturonan). Druhý typ homogalakturonanu je vysoce rozvětvený polysacharid, kdy je základní kostra substituovaná širokým spektrem méně běžných modifikovaných monosacharidů, jako je apiosa, kys. acerová, 2-O-methylfukosa a dalších. Název tohoto homogalakturonanu je rhamnogalakturonan II, což je poněkud matoucí s ohledem na název rhamnogalakturonanu I. Navzdory nízkému obsahu u kvetoucích rostlin napovídá tato vysoce konzervovaná struktura o velmi důležité, doposud neobjasněné funkci těchto pektinů v buněčné stěně. Struktura heteropolysacharidu rhamnogalakturonanu I je rovněž složitá. Základní heteropolysacharidová kostra může být substituována většinou neutrálními sacharidy, jako jsou arabinany, galaktany a arabinogalaktany, které jsou připojeny ke rhamnose v poloze 4. Zhruba polovina rhamnosových zbytků je takto modifikována bočními řetězci, tento poměr však značně kolísá v závislosti na typu buňky a jejích fyziologickém stavu. Pektiny hrají významnou roli v potravinářském průmyslu. Při extrakci z rostlinných plodů vytvářejí díky svému zápornému náboji ve vodě koloidní roztoky. Jejich přeměna na formu gelu se docílí okyselením (odstranění záporného náboje) a sníženou hydratací odstraněním solvatačního obalu přídavkem cukru. Z toho důvodu se při vaření džemů přidává kys. citronová a cukr (konzervační účinky cukru navíc). Bohatá methylace kys. galakturonové je příčinou přítomnosti vyššího obsahu methanolu při výrobě ovocných vín. Polyuronáty vyráběné z řas jsou široce používány v potravinářském průmyslu jako stabilní gely (algináty a….) při výrobě jogurů a krémů. Algináty jsou polymery složené z kys. D-mannuronové (β-1,4) + L-guluronové α- 1,4. … Strukturní proteiny buněčné stěny I když je buněčná stěna tvořena převážně polysacharidy, obsahuje malé množství strukturálních proteinů. Jsou to glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin (HRGP hydroxyprolin-rich-glykoproteins), proteiny bohaté na prolin - (PRP: prolin-richproteins) a proteiny bohaté na glycin (GRP: glycin-rich-proteins). Vysoký obsah těchto méně obvyklých aminokyselin napovídá o jejich zvláštní sekundární a terciární struktuře. Jejich obsah v buňce závisí na druhu rostliny a typu buňky. Protože se vyskytují mimo buňky, jsou syntetizovány na ribosomech na hrubém 4 endoplasmatickém retikulu s příslušnou signální sekvencí, která je předurčuje pro sekreci mimo buňku. Nejlépe prostudovaným HRGP je extensin, složený z opakujících se sekvencí Ser(Hyp)4 a Tyr-Lys-Tyr. Díky opakující se hydroxyprolinové sekvenci má tento protein tyčinkovitou molekulu typu "polyprolin II". Extensin může být v různé míře glykosylován. Na obrázku je uvedena struktura extensinu z rajčete. Druhý typ proteinu, PRP, má pravděpodobně obdobnou sekundární strukturu jako HRGP. Na obrázku je uvedena struktura PRP ze sóji. Na druhé straně GRP obsahuje až 70% glycinu a má pravděpodobně strukturu βskládaného listu. Obr. 2.18 Tyto proteiny buněčné stěny jsou kovalentně vázány do buněčné stěny a je tudíž obtížné je odtud extrahovat. Posledním typem proteinu buněčné stěny je proteoglykan - arabinogalaktanový protein (AGP), obsahující až 90% sacharidů. Vyskytuje se nejen v buněčné stěně, ale také v plasmatické membráně a Golgiho aparátu, což je pravděpodobně místo glykosidace, která zahrnuje připojení bohatě rozvětvené sítě galaktanů a připojení arabinosy. AGP je často vázán ve stěně přes tzv. GPI kotvu (glykosylfosfatidylinositolovou kotvu) k ceramidové zbytku , ze které se může uvolnit prostřednictvím fosfolipasy? a sloužit jako signální molekula (viz…) Obrázek: struktura HRGP, PRP, GRP, AGP 2.18, 2.20 Aromatické látky neligninového typu Primární stěna commelinoidních řádů a dalších rostlin řádu? Chenopodiacea (špenát, cukrová řepa) obsahuje velké množství derivátů kys. hydroxyskořicové, kys. ferulové a p-kumarové. Tyto látky jsou kovalentně vázány esterovou vazbou do polohy O-5 několika jednotek arabinosy v matrixovém glukuronoarabinoxylanu. Struktura primární buněčné stěny Buněčná stěna je tvořena ze dvou až tří strukturně nezávislých komponent, které svou vzájemnou interakcí vytvářejí složitou síť. Základní struktura je tvořena mikrofibrilami celulosy, vzájemně propojenými rozvětvenými glykany. Tato síť je zanořena do druhé sítě matrixových pektinových polysacharidů.. Třetí nezávislá síť je tvořena strukturálními proteiny nebo fenylpropanoidy ligninového typu. Stěny buněk krytosemenných rostlin mají dva základní typy architektury. Stěna typu I Většina dvouděložných a nekomeloidní jednoděložné rostliny obsahují ve své stěně zhruba stejné množství celulosy a xyloglukanu (stěny typu I). Xyloglukany obklopují celulosové mikrofibrily a vzájemně je mezi sebou vážou. Tato síť je zanořena do matrix tvořené pektiny, zejména homogalakturonany (HGA). Tento pektin je přítomný ve vysoce methylované podobě a štěpení esterové vazby je katalyzované pektin methylesterasou. Vznikající záporné náboje pak vážou vápenaté ionty. Každý vápenatý iont váže dva protilehlé řetězce pektinu za vniku příčných vazeb. Tato 5 porézní struktura je doplněná řetězci rhamnogalakturonanu I. Některé z molekul rhamnogalakturoananu a homogalakturonanu jsou vázány esterovými vazbami k dalším polymerům buněčné stěny. Tyto vazba lze přerušit pouze enzymově. Některé typy buněčných stěn typu I obsahují větší množství proteinů, zejména bazických, které interagují s kyselými skupinami pektinové sítě. Stěny typu II, které nacházíme u jednoděložných rostlin comelinoidních, obsahují celulosové mikrofibrily , avšak hlavním hemicelulosových polysacharidem je převážně glukuronoarabinoxylan. Tento typ stěny obsahuje pouze malé množství pektinu. Záporné náboje ovlivňující porositu stěny jsou zajišťovány molekulami kys. D-glukuronové glukuronoarabinoxylanu. Ve srovnání s dvouděložnými rostlinami a zbytkem jednoděložných obsahuje tato stěna málo strukturních proteinů, avšak na druhé straně je schopna akumulovat větší množství fenylpropanoidních látek, zejména ve fázi končení růstu. Obrázek: Stěna typu I a II obr. 2.23 Syntéza buněčné stěny a polysacharidů Celulosová složka buněčné stěny je syntetizovaná na plasmatické membráně. Enzym katalysující tuto reakci je celulosa synthasa, substrátem reakce jde UDP-glukosa, kdy se celulosové zbytky postupně připojují na neredukující konec templátu. Necelulosové polysacharidy jsou syntetizovány v Golgiho aparátu a hrubém endoplasmatickém retiskulu. Golgiho aparát je místem pro syntézu, zpracování a cílené směrování glykoproteinů. Zde také probíhá cílená konverze UDP-glukosy na ostatní sacharidy. Enzymy, které tyto reakce katalyzují (epimerasy, dehydratasy) jsou zřejmě membránově vázané v komplexu ER-Golgiho aparátu. UDP-D-xylosa a UDPL-arabinosa vznikají z UDP-D-glukuronátu. D-galaktosa vzniká z D-glukossy epimerací. Syntézu necelulosových polysacharidů byla demonstrována in vitro za použití směsi vesiklů plasmatické membrány, Golgiho aparátu a endoplasmatického retikula. Za použití substrátu UDP-glukosa vzniká jako hlavní produkt β-1,3-glukan, což je kalosa. Předpokládá se, že kalosa je hlavní produkt polymerizace při poškození celulosa synthasy. Reakce je aktivována vápenatými ionty. Opakující se sekvence základního řetězce necelulosových polysacharidů jsou vytvářeny koordinovanými transglykosidačními reakcemi. Celulosa a kalosa jsou syntetizovány na vnější straně plasmatické membrány. Tato reakce je katalyzována multimerními enzymy, které nacházíme přímo na rostoucím konci celulosových mikrofibril. Tyto mikrofibrily se tedy seskupují na vnějším povrchu buňky přímo. Ačkoli je této reakce známa již dlouho, pokusy o izolaci enzymu selhávají, protože aktivita enzymu při purifikaci velmi rychle mizí. Substrát reakce, UDP-glukosa, vzniká ze sacharosy a UDP enzymem sacharosa synthasou (obrácená reakce, než je syntéza sacharosy). Růst buňky je spojen s extenzivními změny hmotnosti a složení buněčné stěny. Během expanze nebo prodlužování buňky se musí architektura stěny měnit a inkorporovat nový materiál. Silou, která zajišťuje expanzi buňky je turgor řízený osmotickým potenciálem. Toto uvolňování buněčné stěny je řízeným procesem, kdy dochází k oddělování mikrofibril, a ukládání nově syntetizovaného polymeru. Mechanismus, kterým se tyto procesy zajišťují a koordinují jsou doposud spíše předmětem hypotéz. Vlivem osmotického potenciálu cytosolu a turgoru dochází k 6 postupnému oddělování mikrofibril a prodlužování délky glykanů vytvářejících příčné vazby. Obr. 2.36 Mechanismus účinku auxinu (způsobujícího prodlužování buněk) na strukturu buněčné stěny je dlouhou dobu předmětem dohadů a hypotéz. Je prokázáno, že vazba auxinu na plasmatickou membránu způsobuje stimulaci aktivity H-ATPasy a tudíž i okyselování vnějšího povrchu, tj.buněčné stěny. Přepokládá se, že snížení pH má za následek aktivaci hydroláz obsažených ve stěně a tudíž uvolňování příčných vazeb mezi celulosovými mikrofilbrilami. Proti této hypotéze působí fakt, že nebyly nalezeny hydrolázy, které by katalyzovaly hydrolytické reakce převážně při pH 5. V současnosti existují dva kandidáti z řady enzymů, které by mohly být zodpovědné za uvolňování struktury buněčné stěny. Prvním z nich je enzym provádějící transglykosylaci xyloglukanu (XyG), kdy se glukosidová vazba štěpí a připojuje se k jinému neredukujícímu konci xyloglukanového řetězce. Jedná se o enzym s poměrně složitým názvem xyloglukanendotransglykosidasa (XET). Druhý enzym, který se nazývá expansin (neplést s bílkovinou extensinem) katalyzuje prodlužování buněčné stěny, a to bez detegovatelných hydrolytických a transglykosidačních aktivit. Je to jediný enzym, u kterého byla prokázána aktivita in vitro. Katalyzuje pravděpodobně přerušení vodíkových vazeb mezi celulosou a glykany příčných vazeb. Expansiny se vyskytují ve všech rostlinných pletivech. Syntéza sekundární buněčné stěny Primární stěna je struktura, která se podílí na ireverzibilní expanzi buňky. Diferenciace buňky je spojena s tvorbou sekundární stěny. Jakmile se růst buňky zastaví, její stěna se ustaví do konečné podoby vytvářením příčných vazeb. Sekundární stěna je složena převážně z celulosy, může však obsahovat další necelulosové polysacharidy, bílkoviny a aromatické látky (lignin). Její složení závisí na druhu rostliny, typu buňky a její vývojové etapě. Epidermální buňky obsahují značné množství suberinu a kutinu, které mají za úkol bránit ztrátám vodu a představují bariéru proti průniku patogenů. Kutin je trojrozměrný polymer polyhydroxylovaných a epoxidovaných mastných kyselin C16, C18, vázaných vzájemně esterovými vazbami. Vzniká tak relativně rigidní hydrofobní síť. Některé patogeny vylučují kutinasy, které dokážou tento polymer hydrolyzovat. Tato struktura je pak pokryta kutikulárním vosky, které brání odpařování vody. Epidermální buňky kořene obsahují obdobný polymer zvaný suberin Suberin obsahuje mastné kyseliny s řetězcem delším než je C18, mastné alkoholy, dikarboxylové kyseliny a fenolické látky (např. kys. kumarovou). Tato vrstva, na rozdíl od kutinu, má spíše hydrofobní charakter. Struktura a funkce ligninu Lignin je po celulose nejhojnější přírodní látkou. Trojrozměrný polymer lignin se vyskytuje takřka výlučně v sekundární buněčné stěně. Je to komplex aromatických látek zvaných fenylpropanoidy. Jedná se zejména o alkoholy odvozené od kys. phydroxyskořicové (p-kumaryl, koniferyl- a sinapyl-alkohol). Tyto aromatické alkoholy vznikají, obdobně jako další fenolické látky, z aminokyseliny L-fenylalaninu deaminací katalyzovanou enzymem fenylalaninamoniaklysasou (PAL) za vzniku kys. skořicové a p-kumarové. Hydroxylace jsou prováděny převážně prostřednictvím cytochromu P450 a NADPH. Vznik methoxyskupiny je katalyován enzymem O- 7 methyltransferasou, který využívá S-adenosylmethionin jako kofaktor. Redukce příslušné kyseliny přes aldehyd na alkohol probíhá přes acyl-KoA, zdrojem redukčních ekvivalentů je NADPH. Obr. Syntéza monolignolů z L-fenylalaninu 24.49a, 24.49b 24.52 Krytosemenné rostliny obsahují lignin kde se vyskytuje převážně koniferylalkohol a sinapyl alkohol, zatímco nahosemenné rostliny převážně koniferylalkohol a malé množství kumarylalkoholu. Tvorba a mechanismus syntézy ligninu je dodnes předmětem spekulací. Jisté je, že se jedná a více méně spontánní proces probíhající radikálovou polymerací. Iniciační radikál vzniká pravděpodobně enzymovou reakcí. Nejpravděpodobnějšími enzymy jsou peroxidasa (H2O2) nebo lakasa (enzym oxidující fenolické látky, substrátem je kyslík). Vzniklý radikál pak rozběhne polymerační reakci , za vzniku C-C vazeb mezi alifatickými anebo aromatickými uhlíky nebo vazeb C-O. Tento proces probíhá na rozdíl od iniciace neenzymově. Obrázek: Schéma polymerace ligninu 24.58 Obr. Struktura ligninu - folie Tento proces lignofikace lze demonstrovat in vitro. Vznikají tak polymery složením obdobné přírodnímu ligninu. Přírodní polymer ligninu se však od tohoto ligninu liší zastoupením jednotlivých typů vazeb a velikostí makromolekuly. To znamená, že v buňce existuje určitý regulační mechanismus, který předurčuje, které vazby mezi jednotkami jsou preferovány. Je možné že tato polymerace probíhá na proteinové matrici. Před procesem lignofikace probíhají v buňce nevratné změny, které vedou k buněčné smrti a tvorbě vodivých pletiv a podpůrných struktur. Na počátku biosyntézy jsou aromatické alkoholy transportovány z cytosolu do buněčné stěny. Biosyntéza ligninu začíná ve specifických místech, jako je střední lamela nebo roh buňky. Radioaktivní značení prokázalo, že jednotlivé monomery jsou ukládány řízeně v určitém poměru. Syntéza ligninu je spojena se sekrecí specifických proteinů (zejména prolich-rich proteiny) z Golgiho aparátu a jejich ukládáním v buněčné stěně. Je tedy možné, že ligninový polymer vzniká na základě bílkovinného templátu. Struktura a funkce plasmatické membrány Plasmatická membrána tvoří aktivní funkční bariéru mezi buňkou a vnějším prostředím. Kontroluje transport látek ven a dovnitř buňky a prostřednictvím specifických receptorů přenáší signály z vnějšího prostředí, účastní se syntézy komponent buněčné stěny. Na rozdíl od živočišné buňky není každá z rostlinných buněk oddělena od okolí separátní plasmatickou membránou. Buňky mezi sebou komunikují prostřednictvím tzv. plasmodesmat, což jsou otvory v buněčné stěně (komunikace u živočišných buněk mezi sebou je zajištěna prostřednictvím proteinových kanálů zvaných "gap junction"). Fig. 1.12 8 Dalším podstatným rozdílem oproti živočišné buňce je přítomnost turgoru díky rozdílnému osmotickému potenciálu vnějšího prostředí a buňky. Živočišné buňky existují za isoosmotických podmínek vzhledem ke svému okolí. Složení plasmatické membrány rostlinných buněk je velmi podobné jako u buněk živočišných, ovšem s několika rozdíly. Zatímco u živočišných buněk je hlavním sterolem cholesterol, u rostlinných buněk je to skupina sterolů s poněkud odlišným bočním řetězcem: stigmasterol, sitosterol a kampesterol (viz vzorce). Fig. 1.4 Membrána rostlin obsahuje poněkud vyšší procento glykosylovaných a esterifikovaných sterolů. Zcela chybí sfingomyeliny, důležitá složka živočišných plasmatických membrán. Fosfolipidy rostlinných buněk obsahují kys. palmitovou, linolovou a linolenovou, zatímco u živočišných buněk kys. palmitovou, olejovou, stearovou a arachidonovou. Plasmatická membrána obsahuje řadu proteinů. Jsou to jednak proteiny funkční (jako jsou enzymy celuloso synthasa a kalosa synthasa, membránové receptory, Další skupinou membránových bílkovin je AGP, vysoce glykosylovaná bílkovina typu proteoglykanu. Typické AGP jsou ukotveny do membrány pomocí tzv. GPI kotvy. Obr. 1.10 Plasmatická membrána je hlavním místem kontrolujícím aktivní transport do rostlinné buňky. Hlavním motorem tohoto procesu je plasmatická H-ATPasa, která okyseluje vnější prostředí a vytváří transmembránový potenciál pozitivní vně. Elektrochemický potenciál (to je jeho elektrická a koncentrační složka) jsou pak využívány k sekundárnímu transportu dalších látek. Obr. 3.1. Membránový transport Membránový transport u rostlin zahrnuje následující procesy - Přítomnost pevné stěny umožňuje u rostlin generovat značný turgor. Tento turgor, zajišťovaný vysokým osmotickým potenciál je zajištěn akumulací solí, zejména KCl. - čerpání živin, jako je amoniak, nitráty, fosfáty a sírany, včetně stopových prvků - distribuce metabolitů: sacharosa a aminokyseliny vytvářené v autotrofních částech rostliny jsou distribuovány floemem - kompartmentalizace metabolitů zvyšuje metabolickou efektivnost. Například v mitochondriích na rozdíl od cytosolu je vysoká hladina ATP oproti ADP a NADH oproti NAD. Existuje specifický transportní systém provádějící export ATP a NAD z mitochondrií. - přeměny energie probíhají v membráně mitochondrií a chloroplastů - přenos signálu: od membrány do cytosolu a jádra buňky zprostředkovaný látkami typu druhého posla Transportní systémy, které přenášejí ionty nebo nenabité látky z jedné strany membrány na druhou na účet energie (hydrolýzy ATP) za vniku elektrochemického potenciálu se nazývají pumpy. Transportní systémy, které propojují transport jedné látky po koncentračním spádu s transportem jiné látky proti koncentračnímu gradientu 9 se nazývají přenašeče (symport nebo antiport). Dalším typem membránového transportu jsou kanály, které svým otevřením zajišťují transport iontů po směru koncentračního gradientu. H+-ATPasa plasmatické membrány Plasmatická H+-ATPasa se podstatně liší od multimerní ATP syntasy typu F mitochondrií a chloroplastů, a to jak po stránce evoluční, tak strukturní. Do skupiny těchto ATPas, typu P, patří další enzymy, jako je Na+/K+ ATPasa, Ca2+-ATPasa, H+/K+ ATPasa, atd. V případě plasmatické H+-ATPasy se jedná o monomer o mol. hmotnosti zhruba 100 kDa. Energie hydrolýzy ATP je využívána k transportu H+ z jedné strany membrány na druhou. Obr. 3.6, Její role je následující: 1) Tento enzym generuje protonmotivní sílu využívanou dalšími mechanismy sekundárního transportu 2) Reguluje acidobazickou rovnováhu cytosolu, která se pohybuje v oblasti pH 7.3 - 7.5. pH optimum ATPasy se nachází v oblasti pH 6.6. Pokud poklesne pH cytosolu vlivem dalších metabolických procesů na 6.6, zvýšená aktivita enzymu zajistí efektivní čerpání H+ do extracelulárního prostoru 3) Aktivita H+-ATPasy je regulována auxinem a elicitory vyvolávajícími obrannou reakci rostlin. Vazba auxinu na příslušný receptor má za následek aktivaci enzymu a acidifikaci apoplastu. Reakční mechanismus: H+-ATPasa pumpuje jeden iont H+ při hydrolýze 1 molekuly ATP. Během této hydrolýzy je γ-fosfát pocházející z ATP kovalentně vázán na aspartátový zbytek enzymu vytvářejíce takto acyl-fosfát, makroergický intermediát. Hydrolýza této vazby poskytuje energii pro transport protonu z jedné strany membrána na druhou Obr. 3.5 Toto je zásadní rozdíl oproti F-ATPase mitochondriálního a plastidového typu, kdy při syntéze ATP makroergický intermediát nevniká.Všechny ATPasy typu P jsou inhibovány vanadátem (H2VO4 ), který blokuje vazbu fosfátu na enzym. H+-ATPasa je u Arabidopsis kodována multigenní rodinou, kde bylo identifikováno nejméně 10 genů (AHA1 - 10), z nichž každý kóduje jeden isoenzym ATPasy. Bylo prokázáno, že exprese jednotlivých isoforem je pletivově specifická. Tyto isoenzymy mohou mít rozdílné biochemické vlastnosti, jako je rozdílná velikost Michaelisovy konstanty, rozdílná citlivost k vanadátu, apod. Na obrázku je ukázána struktura H+-ATPasy. Enzym obsahuje 10 transmembránových domén. Široká hydrofilní oblast mezi doménou 4 a 5 obsahuje vazebné místo pro ATP a aspartátový zbytek (D), který je fosforylován. Tato oblast je vysoce konzervována u mnoha protonových pump. Vazebné místo pro H+ leží pravděpodobně mezi doménou 6 až 10. Karboxylový konec proteinu obsahuje autoinhibiční doménu, která se zásadním způsobem podílí na regulaci enzymu. Její odstranění, např. tryptickým štěpením nebo genetickou modifikací, značně zvyšuje aktivitu enzymu. Aktivita enzymu se dále zvyšuje přídavkem fusicoccinu, toxinu produkovaného houbou Fusicoccum amygdali. (Obr. 3.8) Tento toxin se váže na 10 specifický receptor mimo ATPasu, což je signální protein 14-3-3 typu.. Tyto proteiny jsou typické tím, že se jako dimery vážou na cílový protein o definované konsensus sekvenci, která zahrnuje fosforylaci serinového zbytku (liší se od fosforylace aspartátu v místě D!). Schéma regulace H+-APTasy pomocí proteinů 14-3-3 a regulací C konce je ukázáno na obrázku. Obr. 3.9. Enzym je aktivován vazbou proteinů 14-3-3 typu, která je usnadňována jednak fosforylací serinu anebo fusiccocinem, který se váže jak na protein, tak na enzym. H+-pumpy vakuoly Membrána vakuoly, tzv.tonoplastu obsahuje další ATPasu, která katalyzuje identickou reakci jako H+-ATPasa plasmatická. Energie hydrolýzy ATP je využívána k transportu protonů do vakuoly. Tím se udržuje velmi nízké pH vakuoly, 5.5, oproti cytosolu. Tato H+ATPasa je V-typu, je podobnější F-ATPase mitochondriální, avšak pracuje zásadně ve směru hydrolýzy ATP. Podobný typ ATPasy najdeme pravděpodobně v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Stechiometrie přenosu je 2 protony na 1 molekulu ATP. Po stránce struktury má tato ATPasa multimerní V1 jednotku obsahující vazebné místo pro ATP a membránový sektor Vo zajišťující transport H+ přes membránu.Existuje určitá homologie mezi podjednotkami F1 a V1 a dále Vo a Fo, při srovnání F-ATPasy a V-.ATPasy. Zdá se však, že H+-ATPasy V typu mají mnohem komplexnější strukturu než F-ATPasy. Obr. 3.11 - V-ATPasa kvasinek V-ATPasy jsou velmi silně a specificky inhibovány antibiotikem bafilomycinem 3.12), které je produkováno Streptomyces a interaguje se sektorem Vo. Membrána vakuoly obsahuje další unikátní H+-pumpu, a to H+-difosfatasu (H+PPasu). Tento systém provádí transport protonů na účet hydrolýzy anorganického difosfátu, který se nachází v cytosolu v mikromolárních množstvích. Jedná se o jednoduchou bílkovinu o mol. hmotnosti 80 kDa. Tato molekula obsahuje 16 transmembránových domén. Funkční jednotka H+-PPasy je zřejmě homodimer 160 kDa. Enzym je silně inhibován Ca2+. Důvod přítomnosti dvou H+ pump v membráně vakuoly není znám. Zdá se pravděpodobné, že H+-PPasa se uplatňuje zejména v nezralých pletivech, zatímco H+-ATPasa ve zralých částech rostliny. Transport vápníku Transport vápníku proti směru koncentračního gradientu je zajišťován Ca2+ -ATPasou, což je ATPasa P typu. Obdobný enzym najdeme kromě plasmatické membrány také v endoplasmatickém retikulu, vakuolární membráně a vnější membráně chloroplastů. Enzym čerpá vápenaté ionty ven z cytosolu, takže jejich koncentrace je udržována na hladině zhruba 0.2 µM. Tato nízká koncentrace je velmi důležitá, protože vápník hraje v buňce roli druhého posla. Ačkoli všechny tyto ATPasy katalyzují identickou reakci, jejich struktura je variabilní. Nejlépe jsou tyto enzymy charakterizovánu u živočichů. Enzym z plasmatické membrány (PM) živočichů má mol.hmotnost 130 kDa a obsahuje regulační doménu na C-konci vázající kalmodulin. Enzym z endoplasmatického retikula (ER) neobsahuje kalmodulinovou doménu a jeho 11 hmotnost je 110 kDa. U rostlin je situace méně přehledná. Enzym ER byl lokalizován v endoplasmatickém retikulu rostlin. Enzym PM typu byl lokalizován v membráně chloroplastů a ve vakuole. Existence PM-typu v plasmatické membráně nebyla zatím prokázána. Vakuolární enzym je regulován kalmodulinem, který se váže na rozdíl od živočišného enzymu na N-konec. Transport vápníku je silně energeticky náročný, protože rozdíl koncentrací vápníku na jedné a druhé straně membrány dosahuje několik řádů a navíc se odehrává proti kladnému potenciálu (elektrochemický potenciál vápníku až -60 kJ/mol). Z toho důvodu může být energie hydrolýzy ATP nedostatečná (-50 kJ/mol). V tomto případě se uplatňuje specifický přenašeč, který provádí výměnu Ca2+ /H+ . Další důležité systémy, které se podílejí na transportu vápníku jsou vápenaté kanály. Hladina vápníku v cytosolu je udržována na velmi nízké hodnotě (0.1 µM). Tato koncentrace je udržována pumpami a přenašeči. Tyto kanály jsou lokalizována takřjka na všech membránách organel, jako je plasmatická membrána, vakuola, endoplasmatické retikulum, jádro, chloroplasty, atd. Hladina vápníku v cytosolu představuje významný regulační prvek a vápník zde hraje roli druhého posla, který se nachází na počátku kaskád přenosu signálů v buňce, kde jsou zahrnuty nejen vápenaté kanály, ale také bílkovina kalmodulin, proteinkinasy, fosfolipasy, atd. Vápenaté kanály, tak jako ostatní kanály jsou řízeny buď napětím nebo ligandy. Jejich selektivita je většinou dosti široká, propouštějí další ionty, jako je draslík, sodík, H+, atd. Selektivita vůči K+ se pohybuje v rozsahu 2:1 až 20:1. Kanály ovládané polarizací membrány se mohou otevírat při depolarizaci a nebo naopak při hyperpolarizaci membrány. Membrány organel (zejména vakuoly a ER) mají minimálně 4 základní typy vápenatých kanálů. Dva z těchto kanálů se nacházejí na membráně vakuoly a jsou aktivovány ligandy: inositol-1,4,5-trisfosfátem (IP3) a c-ADP-ribosou (cADPR). Tyto dva kanály se velmi podobají svým protějškům, které nacházíme v membránách ER živočišných buněk. (cADPR kanál je ovládán, tzv. ryanodinovým receptorem). Selektivita těchto ligandových kanálů oproti draslíku je dosti vysoká. Kanály ER živočišných buněk jsou však na rozdíl od kanálů vakuol řízeny dalším ligandem, což je cytosolový vápník samotný. Vzrůst koncentrace vápníku v cytosolu vyvolá otevření vápenatých kanálu ER, výtok vápníku z této organely a zesílení signálu (tzv. calcium induced calcium release: CICR). U rostlin je tento efekt vyvolán spíše otevřením depolarizací aktivovaného Ca2+, který je však navíc silně aktivována komplexem Ca2+-kalmodulin.. Obrázek: 3.44 + CICR u rostlin Transport draselných iontů Ačkoli transport draslíku, jakožto jednoho z nejdůležitějších iontů, je studován po mnoho desetiletí, znalosti o tomto systému byly dlouho neúplné. Cytosolová koncentrace draslíku dosahuje 80 až 200 mM, transport draselných iontů se tudíž odehrává proti silného koncentračnímu spádu. Nejlépe prostudován je transport draselných iontů do buněk kořene. Fyziologické studie svědčí o dvou systémech transportu draselných iontů: nízkoafinitním a vysokoafinitním. Čerpání dralíku kořenovými buňkami bylo dlouho spojováno s výtokem protonů, to znamená, že se předpokládala existence antiportu K+/H+. Studia vysokoafinitního transportu v Arabidopsis však prokázala, že draslík je čerpán v symportu H+-K+, a to při stechiometrii 1:1. Tato funkce předpokládá roli H+-ATPasy, která vytváří nutný elektrochemický potenciál protonů. Draselný přenašeč tudíž využívá gradient protonů 12 vytvářený ATPasou a jeho činností se přenáší 2 náboje na jeden iont draslíku. Nízkoafinitní tranportní systémy draslíku obsahují komponenty draselných kanálů. Tyto kanály jsou dvojího typu. První typ, zvaný "inward-rectifying" se otvírají při hyperpolarizaci membrány a jejich otevření způsobí průnik draselných iontů dovnitř, tudíž čerpání draslíku do buňky. Druhý typ kanálu, "outward-rectifying" se otvírají při depolarizaci membrány: jejich otevřením se transportují draselné buňky ven z membrány. Jejich role je tedy spíše opačná. Draselné ionty jsou využívány ke zvýšení (obnovení) membránového potenciálu, snižování osmotického potenciálu buňky výtokem draslíku, apod. Oba tyto typy kanálů jsou inhibovány tetraethylamoniem. Tyto kanály však mohou být regulovány nejen velikostí potenciálu, ale také ligandy. Například outward-rectifying kanály buněk průduchů jsou aktivovány malým vzrůstem pH vyvolaným kys. abscisovou. Inward-rectifying kanály jsou modulovány G-proteiny a jsou inhibovány cytosolovým vápníkem a regulovány defosforylací vyvolanou proteinfosfatasou. Struktura K+ "inward-rectifying" kanálů je dobře známa. Patří do super-rodiny tzv. shaker kanálů, kam patří K+, Ca2+ a Na+ kanály ovládané potenciálem. Na obrázku je znázorněna struktura K+-kanálu AKT1. Obsahuje 6 transmembránových domén. Čtvrtý helix, zvaný S4, obsahuje velké množství kladných nábojů (Lys , Arg). Tato oblast vytváří tzv. voltážový senzor, který se účastní otvírání kanálu vlivem napětí tak, že se vysune z membrány, což způsobí otevření brány v P-oblasti.. Tento kanál funguje jako tetramer, oblast póru je lokalizována mezi pátý a šestý helix každé z podjednotek. Obrázek 3.34, 3.36 Na druhé straně, outward-rectifying K+-kanál (KCO1) patří do skupiny dvoupórových kanálů, protože každá jednotka obsahuje dvě P-oblasti (Obr. ). Tento enzym obsahuje pouze 4 transmembránové domény a C-konec obsahuje dvě Ca2+ vazebné domény (EF). Tento kanál je tedy citlivý ke koncentraci cytosolového vápníku. Otevíráním kanálu, ke kterému dochází snížením potenciálu a zvýšením koncentrace cytosolového vápníku tedy vyvolá výtok draselných iontů ven z buňky. Vnější faktory, jako je červené světlo, vazba Nod-faktorů nebo elicitorů obranných reakcí má za následek zvýšení koncentrace vápníku v cytosolu a depolarizaci membrány. Role těchto kanálů tedy spočívá upravení potenciálu na původní hodnotu. Další typ kanálu zajišťující transport draslíku se nachází na membráně vakuoly a je regulován napětím. Vykazuje velmi malou selektivitu vůči monovalentním kationtům (K+, Na1, H+, Li+,, atd) (FV - fast vacuolar channels) a je inhibován zvýšením cytosolové koncentrace Ca2+. : na druhé straně jiný draselný kanál vakuoly je vysoce selektivní vůči K+ je aktivován nízkou koncentrací cytosolového vápníku v rozsahu nmol/l až 1 µM a je inhibován alkalizací cytosolu. Obr. Outward kanál 3.38 Transport aniontů Transport fosfátu. Díky své nízké rozpustnosti v půdě je fosfát hůře dostupný, než ostatní minerální látky. Jeho koncentrace v půdě je často nižší než 1 µM. Do kořenových buněk se transportuje ve formě H2PO4 a to proti směru elektrického potenciálu, který je negativní oproti extracelulárnímu prostoru. Koncentrace fosfátu v cytosolu je řádově milimolární.Tento transport jde na účet hydrolýzy ATP anebo na účet elektrochemického potenciálu generovaného H+-ATPasou. Předpokládá se, že se 13 fosfát transportuje kotransportem s protony H+- H2PO4-. Důkazy pro tuto hypotézu jsou však zatím nedostatečné. Geny kódující přenašeče fosfátu byly nedávné klonovány u Arabidospis a dalších rostlin. Všechny přenašeče Pi mají podobnou strukturu. Podobají se přenašečům, které byly zjištěny u kvasinek. Předpokládaná struktura přenašeče fosfátu rostlin obsahuje 6 transmembránových domén z N-konce a 6 domén z C-konce, které jsou odděleny rozsáhlým hydrofilním úsekem. Další vysoce konzervovaný úsek tohoto proteinu obsahuje sekvence identické pro fosforylační místo proteinkinasy C a kaseinkinasy II a dále N-glykosylační místo. Transport amoniaku a nitrátu Rostlinné buňky mají vysoce efektivní systém transportu NH4+. Fyziologické studie naznačují přítomnost mnohočetných transportních systémů s afinitou Km v rozsahu 10 až 70 µM NH4+. Geny přenašečů NH4+ u rajčete nebo Arabidopsis jsou vysoce homologní s geny přenašečů kvasinek. Nitráty jsou efektivně čerpány epidermálními a kortikálními buňkami? kořene. Hlavními skladovacími organelami jsou vakuoly, kde koncentrace dosahuje až 20 mM. Obdobně jako u jiných iontů, byly objeveny dva transportní systémy: nízkoafinitní a vysokoafinitní. Vysokoafinitní systém je typickým Km v oblasti 10 - 100 µM a může mít dvě komponenty: konstitutivní existuje v buňce i za nepřítomnosti nitrátu v půdě a inducibilní komponenta se exprimuje po přidání nitrátu. Nízkoafinitní transportní systém je pozorován při koncentracích vyšších než 0.5 mM a nemá saturační kinetiku. Rostlinné buňky čerpají nitrát proti elektrochemickému potenciálu. Transport nitrátu je řízen protonovým gradientem přes plasmatickou membránu. Původně se předpokládalo, že se jedná o kotransport H+-NO3-, tedy o nábojově neutrální transport. Experimentálně se však prokázalo, že přidání nitrátu způsobí depolarizaci membrány. Předpokládá se tedy, že se transportují 2H+ spolu s jedním molem NO3-, tudíž výsledkem je přenos 1 kladného náboje dovnitř buňky. Molekulárně biologické studie prokázaly existenci dvou rodin s odlišnými kinetickými a regulačními vlastnostmi. NRT2 rodina kóduje přenašeče inducibilního vysokoafinitního transportu. Exprese je inhibována dalšími formami dusíku jako je amoniak nebo glutamin. NRT1 rodina zahrnuje přenašeče s nízkou a vysokou afinitou. NRT1 protein u Arabidopsis je exprimován u buněk vnější vrstvy kořene. Je to hydrofobní protein obsahují 12 transmembránových domén. Tento protein má zřejmě dvojí afinitu pro nitrát, a to Km zhruba 25 µM a nízkoafinitní Km 8 mM. Další obdobný gen typu NRT1 u Arabidopsis je zřejmě komponentou nízkoafinitní a konstitutivní. Druhým typem transportních mechanismů aniontů jsou iontové kanály. Jsou přítomny ve všech buňkách. jejich hlavní rolí je udržování koncetrace solí uvnitř buňky a regulace turgoru. Z těchto kanály jsou nejdůležitější Cl- kanály. V buňkách průduchů (guard??) byly identifikovány 2 druhy těchto chloridových kanálů: tzv. rychlé a pomalé (R-typ a S-typ): Oba typy jsou regulovány jednak membránovým potenciálem a dále koncentrací vápenatých iontů. Protože intracelulární koncentrace chloridů je vyšší, otevření těchto kanálů vede ke ztrátám chloridů a depolarizaci membránového potenciálu. Tato depolarizace pak vede zřejmě k aktivaci "outward rectifying" draselných kanálů (viz výše). Důsledkem je ztráta KCl a pokles osmotického potenciálu buňky. Druhou funkcí těchto aniontových kanálů je depolarizace membrány, jakožto fenoménu, který pak vede a aktivaci dalších komponent signalizační kaskády. 14 Transport vody Permeabilita vody přes membránu je značná. Má dvě složky. první z nich je volný průchod molekul vody přes fosfolipidy. Druhý mechanismus předpokládá speciální kanály - obsahující bílkoviny akvaporiny Obr. 3.50, Obsahují 6 helixů a konzerovanou Asn-Pro-Ala doménu U rostlin existují na PM a vakuole Jsou regulovány fosforylací a Ca2+. METABOLISMUS SACHARIDU Zásobním sacharidem rostlin je zejména škrob, transportním sacharidem se sacharosa. Syntéza a degradace škrobu Škrob je složen ze dvou základních složek: amylosy a amylopektinu. , přičemž u většiny rostlin obsahuje 30% amylosy. Poměr obsahu obou složek je významným faktorem v potravinářském průmyslu. Amylopektinové molekuly tvoří většinou amorfní strukturu, spíše než krystalickou, díky bohatému větvení a vodíkovým vazbám.Textura potravin (pečivo), je totiž nepříznivě ovlivňována vyšším obsahem amylosy, která v chladném stavu krystalizuje, ztrácí vodu a produkt ztrácí gelovitou vláčnou strukturu. Obilniny s vysokým obsahem amylopektinu ("vosková" kukuřice) zajišťují stabilitu výrobků po dostatečně dlouhý čas. Mechanismus, který reguluje degradaci obou polysacharidů, není na rozdíl obdobné dráhy degradace glykogenu u živočichů objasněn. Odbourávání škrobu probíhá buď v plastidech, nebo semenech a hlízách. Na degradaci se podílejí dvě hlavní cesty: amylasy a fosforylasy. Degradací cestou fosforylasy vzniká glukosa-1-fosfát, který se metabolizuje v procesu anaerobní glykolysy nebo pentosafosfátovém cyklu. Aby mohlo dojít k úplné degradaci amylosy a amylopektinu, potřebuje buňka navíc dva enzymy. Větvící enzym (provádějí štěpení vazeb 1,6) a dále glukosyltransferasu. Reakce, které tyto enzymy katalyzují: Fosforylasa: α-glukan(n) + Pi → α-glukan (n-1) + glukosa-1-P Eznym štěpící větvení (zvaný také R-enzym): rozvětvený (1→6)(1→4)glukan → lineární (1→4)glukan Glukosyltranferasa (zvaný D-enzym): α-glukan(m) + α-glukan(n) ⇔ α-glukan (m+n-1) + glukosa Obrázek Fosforylasa štěpí α-glukany od neredukujícího konce, avšak může hydrolyzovat pouze ty glukany, které mají minimálně 4 glukosové jednotky od místa 15 větvení.Kontinuální odbourávání amylosy a amylopektinu je tedy možné pouze díky R-enzymu, který odstraní větvení a díky transferase, která z krátkých štěpů vytvoří dlouhý glukanový řetězec. Fosforylasa je přítomna zejména v plastidech, v zelených částech rostliny, ale také v hlízách kořenů. Fosforylasa (na rozdíl od glykogenfosforylasy živočichů, která je regulována proteinkinasu, cAMP a hormony) není zřejmě regulována obdobným mechanismem. Nejvíce prostudována je hydrolýza škrobu v klíčících semenech. Zde je škrob štěpen skupinou amyláz, endoamylas a exoamylas (dříve zvaných α-amylasy a β-amylasy). Produktem reakce endoamylas jsou nízkomolekulární glukany, produktem exoamylas je disacharid maltosa (tato je štěpena α-glukosidasou na glukosu). Štěpení vazeb α-1→6 vyžaduje další enzym. Klíčící semeno neobsahuje endoamylasy, jejichž syntéza de novo v aleuronové vrstvě je regulována gibereliny. Exoamylasa (β-amylasa) je přítomna v semenu ve formě proenzymu, který je aktivován během klíčení proteolysou, kdy se z C-konce odštěpí krátký peptid. Produktem štěpení škrobu těmito enzymy je tedy glukosa, která se přeměnuje hexokinasou na glukosa-6-fosfát a poté na sacharosu, aby mohla být transportována do vyvíjejícího se embrya. Startovní látkou syntézy škrobu je aktivovaná glukosa. V rostlinách existují dvě formy: ADP-glukosa a UDP-glukosa. UDP glukosa může vznikat z glukosy v reakci katalyzované UDP-glukosapyrofosforylasou: glukosa-1-P + UTP ⇔ UDP-glukosa + PPi Tento enzym existuje pouze v cytosolu. Reakce je rovnovážná. Vznikající UDPglukosa však neslouží k syntéze škrobu, nýbrž sacharosy a glykosidů. Cytosol neobsahuje pyrofosfatasu, takže hladina disfosfátu v cytosolu je poměrně vysoká, 0.3 mM. Druhý analogický enzym najdeme pouze v plastidech a katalyzuje reakci: glukosa-1-P + ATP ⇔ ADP-glukosa + PPi Plastidy, na rozdíl o cytosolu, obsahují pyrofosfatasu, takže disfosfát ne okamžitě štěpen na anorganický fosfát. Protože difosfát je obsahuje makroergickou vazbu, reakce se tím posouvá silně ve prospěch tvorby ADP-glukosy. ADP-glukosa je využita pro syntézu škrobu. ADP-glukosapyrofosforylasa je hlavním regulačním enzymem syntézy škrobu. Tento enzym je heterotetramer složený ze dvou malých a dvou velkých jednotek. Je allostericky aktivován 3-fosfoglycerátem vznikajícím při fotosyntéze a inhibován fosfátem. Mezi plastidy a cytosolem existuje antiport, kdy se triosafosfáty nebo glukosa-6-fosfát transportují výměnou za fosfát, takže vysoká hladina fosfátu znamená nízkou koncentraci sacharidů v plastidu. Obr, 13.16 - upravený?? Syntézu škrobu zajišťuje enzym škrob-synthasa, který přikládá glukosové jednotky k neredukujícímu konci amylosové matrice. Vytváření vazeb α-1→6 katalyzuje tzv. větvící enzym. Tato synthasa existuje ve formě několika izoenzymů. některé jsou vázány na membránu plastidů a katalyzují vznik lineární amylosy. Jiná forma, rozpustná, nacházející se ve stroma chloroplastů, syntetizuje kratší lineární řetězce, které jsou přeměňovány větvícím enzymem. Větvící enzym je v podstatě transglukosidasa, která štěpí α-1→4 vazby a redukující konce pak přenáší na C-6, zhruba o 20 glukosových 16 zbytků směrem dolů od bodu štěpení vazby. Existují 2 hlavní formy tohoto větvícího enzymu. Ta první má vysokou afinitu k nerozvětvenému řetězci amylosy, druhá preferuje rozvětvený amylopektin, takže jeho činností vznikají vysoce rozvětvené formy amylopektinu. (Obr. 13.19??). Některé rosltiny obsahují ve svých zásobních orgánech namísto škrobu polyfruktosany, což jsou polymery fruktosy. x upravit bývalou přednášku x x Metabolismu sacharosy Sacharosa je hlavním produktem fotosyntézy v zelených listech. Slouží jako transportní sacharid a u některým rostlin (cukrová řepa, cukrová třtina) je zásobním sacharidem. Sacharosa je syntetizována v cytosolu. Existují dvě možné dráhy syntézy sacharosy: cestou sacharosafosfát synthasy a sacharosasynthasy. V prvním případě vzniká glykosidová vazba sacharosy ve dvou následných reakcích. Sacharosa-fosfátsynthasa: UDP-glukosa + fruktosa-P ⇔ sacharosa-6-P + UDP Sacharosa-P-fosfatasa: Sacharosa-6-P + H2O ⇔ sacharosa + Pi Tvorba UDP-glukosy glukosa-1-P a UDP, obdobně jako reakce katalyzovaná sacharosa-6-synthasou jsou reakce s mírně negativní ∆Go (-2.9 a -5.5 kJ/mol), zatímco hydrolysa sacharosa-6-P má ∆Go = -25 kJ/mol. Tím se stává syntéza sacharosy prakticky ireverzibilní reakcí. Druhý enzym sacharosasynthasa katalyzuje vratnou reakci: sacharosa + UDP ⇔ UDP-glukosa + fruktosa Přepokládalo se, že tento enzym se podílí jak na syntéze, tak na degradaci sacharosy. Stanovení koncentrace obou hlavních enzymů metabolismu sacharosy ukázalo, že části rostliny využívající a degradující sacharosu (např. semena nebo hlízy) obsahují vysokou koncentraci sacharosasynthasy, zatímco pletiva obsahující vysoké hladiny sacharosafosafátsynthasy se podílejí na syntéze sacharosy. Sacharosafosfátsynthasa (SPS) je regulačním enzymem, který je regulován jak allostericky, tak kovalentní modifikací příslušnou kinasou (SPS kinasa), a to velmi zajímavým způsobem. SPS kinasovou reakcí, kdy se SPS fosforyluje, vzniká méně aktivní forma. Tato se může defosforylovat na formu aktivní příslušnou SPSfosforylasou. Inhibitorem SPSkinasy je glukosa-6-fosfát, inhibitorem fosfatasy je fosfát. Vysoká hladina glukosa-6-P a nízká koncentrace fosfátu tudíž upřednostňuje vznik defosforylované, aktivní formy SPS. Allosterickým aktivátorem samotné aktivní SPS je glukosa-6-fosfát a inhibitorem anorganický fosfát. Poměr glukosa-6-fosfát/Pi tedy velkmi citlivě reguluje syntézu sacharosy. Obrázek 13.13 a 13.12 17 Kromě těchto enzymů obsahují rostliny enzym invertasu (který známe z kvasinek), jenž katalyzuje hydrolýzu sacharosy na dva monosacharidy. Tato reakce je ireverzibilní a její význam je zatím předmětem spekulací. Sacharosa může být zdrojem glukosa-1-P cestou sacharosasyntasy, nebo může být využívána přímo k syntéze glykosidové vazby. Některé rostliny obsahují zvláštní oligosacharidy namísto sacharosy, jako zasobí látky. rafinosa, verbaskosa, stachiosa sacharopsa: glc(α1 β2)fru rafinosa : gal (α1 6) glc (α1 β2) fru stachiosa : gal (α1 6) gal (α1 6) glc (α1 β2) fru Syntéza těchto látek probíhá přes mysoinositol a galaktinol UDPgal + myoinositol ⇔ galaktinol + UDP galaktinol + sacharosa ⇔ rafinosa + myoinositol x x x x Anaerobní glykolýza a pentosafosfátový cyklus Glykolýza je metabolickou drahou přeměňující glukosu na pyruvát za současné produkce NADH a ATP. Enzymy tohoto procesu se u živočišných buněk nacházejí v cytosolu a většina těchto reakcí je vratná. Při pentosafosfátovém cyklu se glukosa-6fosfát přeměňuje na pentosa-fosfáty a NADPH. Další kroky pak zahrnují regeneraci hexos. Oba procesy jsou vzájemně propojeny společnými metabolity. Na rozdíl od živočišných buněk však musíme u rostlin navíc vzít do úvahy plastidy, kde se tyto metabolity a enzymy rovněž nacházejí. Oba procesy obsahují většinou rovnovážné reakce. Klíčovým enzymem pentosafosfátové dráhy je glukosa-6-fosfát dehydrogenasa,využívající NADPH jako kofaktor. Enzym se nachází jak v cytosolu, tak v plastidech. Oba enzymy mají zhruba 75% homologii sekvence. Cytosolový enzym není allostericky regulován, je však silně inhibován NADPH. Plastidový enzym podléhá komplexní regulaci. Enzym je kovalentně modifikován tvorbou disulfidových můstků katalyzovaným thioredoxinovým systémem. Během fotosyntézy je NADPH redukováno světlem. Za těchto podmínek je produkce NADPH v pentosafosfátovém cyklu zbytečná a enzym je tudíž deaktivován fotoredukovaným thioredoxinem. Obr Anaerobní glykolýza živočišných buněk obsahuje dva klíčové regulované procesy. První z nich je přeměna fruktosa-6-fosfátu na fruktosa-1,6-bisfosfát katalyzovaná ATP dependentní fosfofruktokinasou -PFK (zatímco obrácený proces defosforylace je 18 katalyzovaný fruktosa-1,6-bisfosfatasou). Druhým klíčovým procesem je pyruvátkinasová reakce. PFK je aktivována fruktosa-2,6-bisfosfosfátem a hormony. Produkt reakce, fruktosa-1,6-bisfosfát je aktivátorem pyruvátkinasy, druhého regulačního enzymu. U rostlin se PFK i fruktosa-1,6-bisfofatasa nacházejí jak v cytosolu, tak v plastidech. Cytosol rostlin však obsahuje navíc třetí enzym, difosfát dependnentní fosfofruktokinasu. Tato reakce je na rozdíl od předchozích rovnovážná. Enzym je zřejmě heterotetramer. Fyziologický význam tohoto enzymu nebyl doposud objasněn. Obr. Vztah mezi fruktosa-6-fosfátem a fruktosa-1,6-bisfosfátem u rostlin (13.32) PFK je u rostlin regulována jinak, než u živočichů. Rostlinná buňka obsahuje cytosolový a plastidový enzym. Oba jsou silně allostericky inhibovány fosfoenolpyruvátem (zpětná inhibice), na rozdíl od buňky živočišné. Silným aktivátorem enzymu je naopak anorganický fosfát. Tento důvod lze pochopit. Pokud je zdrojem triosafosfátů fotosyntéza, není zapotřebí tyto látky vyrábět cestou anaerobní glykolýzy. Jak je ukázáno dále (,,), triosafosfáty jsou transportovány přes plasmatickou membránu nebo přes membránu plastidu výměnou za fosfáty. Vysoká hladina fosfátu tedy znamená zvýšený transport triosafosfátu a tudíž potřebu doplnit triosafosfátový pool. PFK rostlin je tudíž regulována poměrem fosfoenolpyruvát/fosfát. Enzym glukoneogenese, fruktosa-1,6-bisfosfatasa je o rostlin přítomna jak v cytosolu, tak v plastidech. Cytosolový enzym s epodílí na vzájemné přeměně sacharosy a škrobu v listech a je silně allostericky inhibován fruktosa-1,6bisfosfátem, na rozdíl od enzymu plastidového. Pyruivátkinasová reakce slouží u živočichů k produkci ATP z fosfoenolpyruvátu. reakce je prakticky nevratná. Rostlinný enzym najdeme opět jak v cytosolu, tak v plastidech. Zatímco živočišná pyruvátkinasa podléhá komplexní regulaci (kovalentní modifikace fosforylací), u rostlinného enzymu z cytosolu a plastidů takovou regulaci nenajdeme. Posledním důležitým enzymem anaerobní glykolýzy je glyceraldehyd-3fosfátdehydrogenasa (GPDH), která využívá energie oxidace glycerladehyd-3-fosfátu na kyselinu za vzniku ATP. Reakce je prakticky rovnovážná a je ovlivňována poměrem NAD/NADH. Rostliny obsahují 3 enzymy s touto aktivitou. Kromě cytosolového, NAD dependentního enzymu najdeme dále plastidový enzym, který je NADP dependentní, a který je součástí Calvinova cyklu. Cytosol však obsahuje navíc ještě třetí enzym, nefosforylující NADP dependentní, který generuje rovnou kys. 3fosfoglycerovou bez intermediátu kys. 1,3-bisfosfiglycerové. Enzym zřejmě zajišťuje tvorbu triosafosfátů i v případě velmi nízké koncentrace ADP. Box 13.4. Terminálním produktem anaerobní glykolýzy je pyruvát, který se za anaerobních podmínek o živočichů přeměňuje na laktát. U rostlin se na terminálním procesu podílí současně enzym laktátdehydrogenasa i pyruvátdekarboxylasa, kdy po redukci vzniká ethanol. Tvorba laktátu má však za následek pokles pH. LDH má pH optimum v neutrální oblasti, její aktivita tudíž tvorbou laktátu klesá. Naopak, pH optimum pyruvátdekarboxylasy však leží v kyselé oblasti, takže akumulace laktátu vede k produkci acetaldehydu a ethanolu. Ethanol samotný pH cytosolu neovlivňuje. Tolerance k hypoxii je u různých druhů rostlin rozdílná. 19 Krebsův cyklus Krebsův cyklus je u rostlin, stejně jako u živočichů lokalizován v matrix mitochondrií. Počet mitochondrií v buňce je dosti liší, obecně však lze tvrdit, že počet mitochondrií v rostlinných buňkách je nižší než v živočišných. Průběh cyklu a struktura enzymů je velmi podobná s průběhem cyklu u živočišných buněk. Rolí Krebsova cyklu je degradace acetylKoA na CO2 a redoxní ekvivalenty (NADH, FADH2) anebo produkce dikarboxylových kyselin. Tyto látky hrají u rostlin velmi podstatnou úlohu, jak napovídá jejich koncentrace uvnitř buněk. Pravděpodobný význam tohoto zvýšeného obsahuje je regulace osmotického tlaku. Tato skutečnost napovídá, že role Krebsova cyklu u rostlin jakožto cyklu syntezujícího dikarboxyláty je u rostlin významější než u živočichů. Obsah některých dikarboxylátů v rostlinách je uveden v následující tabulce. Obsah (µmol/g čerstvé hmotnosti) Kyselina Arum Kukuřice (kořen) Kukuřice (koleopt) Pšenice (list) Bryophyl (list) Játra krysí Citrát 16.6 1.5 0.8 0.60 8.0 0.22 Isocitrát 0.11 - - - 60.0 0.01 Jantaran - 0.2 0.2 0.2 - 0.75 Fumaran 0.90 - - - - 0.08 Malát 21.6 7.5 2.7 1.7 19.0 0.39 Cyklus kyseliny citronové lokalizovaný v mitochondriích má u rostlin některé zvláštní rysy. Tak například při syntéze jantaranu vzniká přímo ATP a nikoliv GTP jako u mitochondrií živočišných. Nejdůležitějším rys však souvisí s velkým významem kyseliny jablečné u rostlin. Oxidace malátu je jak známo energeticky velmi nepříznivá (∆Go = ) a musí být stimulována odstraňováním vznikajícího oxalacetátu. Toho je docíleno bud transaminací za vzniku kys. L-asparagové anebo kondenzací s acetyl-Koa za vzniku kys. citronové. Rostlinné mitochondrie jsou charakteristické vysokou aktivitou tzv. jablečného enzymu dekarboxylujícího malát na pyruvát: HOOC-CH(OH)-CH2-COOH + NAD+ → CH3COCOOH + CO2 + NADH + H+ Tento enzym umožňuje rostlinám alternativní dráhu metabolizace PEP vznikajícího v procesu anaerobní glykolýzy. L-malát je syntezován v cytosolu karboxylací PEP a je posléze transportován do mitochondrií, kde vstupuje do Krebsova cyklu. Zde je pak odbouráván jablečným enzymem na pyruvát. Role malátu je obzvláště významná u takzvaných C4 rostlin. Tato alternativa umožňuje rostlinám úplnou oxidaci organických kyselin i za nepřítomnosti pyruvátu produkovaného v cytosolu, např. při zpracování malátu uskladněného ve vakuole. 20 malát pyruvát CO2 acetylKoA citrát oxalacetát Respirační řetězec Struktura a funkce respiračního řetězce rostlinných mitochondrií je v zásadě shodná se strukturou a funkcí mitochondrií živočišného původu. Počet mitochondrií v rostlinné buňce velmi kolísá a souvisí s metabolickou aktivitou. Odlišnosti přenašečů respiračního řetězce mitochondrií rostlinných od živočišných jsou následující: a) i když respirační řetězec obsahuje stejné typy cytochromů, jejich absorpční maxima jsou poněkud odlišná od absorpčních maxim cytochromů živočišných. Důvodem je jiná bílkovinná část hemoproteinu. b) přítomnost ubichinonu Q9,10 c) přítomnost flavoproteinů zodpovědných za rotenon necitlivou oxidaci NADH d) přítomnost alternativní, kyanid necitlivé, respirace Kromě komplexů respiračního řetězce najdeme u rostlinných mitochondrií NADH dehydrogenasu, periferní bílkovinu, orientovanou do matrix. Tato dehydrogenasa je necitlivá k rotenonu, napojuje se na ubichinononý pool a tvoří tak obchvat komplexu I. Její činností však nevzniká ATP, protože nekatalyzuje vznik elektrochemického potenciálu protonů. Další obdobná dehydrogenasa oxiduje NADPH. Její role je doposud nejasná. Posledním vyjímečnou dehydrogenasou je NADH dehydrogenasa a NADPH dehydrogenasa lokalizované na vnější straně vnitřní mitochondriální membrány. Oba enzymy se napojují na ubichinon a enzymy nekatalyzují translokaci protonů přes membránu. Regulace obou enzymů nebyla prozatím objasněna, jejich přítomnost však umožňuje oxidovat cytosolový NADH a NADPH bez přenosu obou koenzymů do matrix mitochondrií. Podílejí se zřejmě na regulaci redoxního stavu cytosolových enzymů. Obrázek respiračního řetězce TCA NADHNAD pyruvátdehydrogenasa NADH NAD NADH NAD MITOCHONDRIE Glukosa PEP pyruvát ADP ATP oxalacetát CYTOSOL malát NADH NAD Pi CO2 PEP-karboxylasa pyruvátkinasa 21 Alternativní kyanid necitlivá oxidasa je nejlépe prostudovaným zvláštním enzymem rostlinného respiračního řetězce. Tento enzym provádí oxidaci ubichinonu cestou paralelní ke komplexu IV, akceptorem elektronů je kyslík, při oxidaci se opět nepřenášejí protony přes membránu, takže nevzniká ATP. Enzym je kódován jaderným genomem a lze jej nalézt nejen u rostlin, ale také u řas a hub. Je necitlivý ke všem běžným inhibitorům oblasti komplexu IV. Tato respirace tvoří nezanedbatelný podíl celkové respirační aktivity Tabulka Srovnání kyanid insenzitivní respirace rostlinné tkáně v přítomnosti 0.2 mM KCN a rozpojovače. Resistence respirace na CN (%) Druh Gossypium kořen Phaseolus kořen Spinacea listy Zea kořen Pisum listy 36 61 40 47 39 Alternativní oxidasa je inhibována kys. salicylhydroxamovou (SHAM) a npropylgalátem. Pravděpodobná struktura enzymu je ukázán na obr. jedná se zřejmě o homodimer 2x32 kDa, obě jednotky jsou propojeny disulfidickým můstkem. Dvě velké hydrofilní domény jsou vystaveny směrem do matrix. Aktivní místo enzymu zřejmě obsahuje kovy. Role alternativní oxidázy není u všech typů rostlin zřejmá. Původní hypotéza, že se jedná o ochranu respirace v případě přítomnosti kyanidu v rostlinných glykosidech se nepotvrdila. Jasná je role enzymu při termogenezi některých květů liliovitých rostlin, kdy vzniklé teplo zvyšuje odpařování olejovitých látek přitahujících hmyz. Tato dráha byla dlouho považována za jakýsi ventil, který umožňuje reoxidaci částí vysoce redukovaného ubichinonového poolu v případě vysoké hladiny NADH. Pokud je redukce cytochromů blízká nasycení, tento alternativní pochod by měl umožňovat jejich rychlou reoxidaci. Tato hypotéza byla však postupně modifikována. Tato oxidasa se uplatňuje nejen při vysokém redoxním stavu respiračního řetězce. Alternativní oxidasa je regulována dvěma faktory:hladinou uhlíkatých metabolitů a kovalentní modifikací. Aktivita enzymu se silně zvyšuje přítomností α-oxokyselin (pyruvát, oxalacetát, glyoxylát, atd.). Aktivita enzymu je dále ovlivňována tvorbou disulfidového můstku homodimeru, zvyšuje se 4-5krát po redukci můstku na -SH skupiny. Tato redukce je indukována přídavkem citrátu a izocitrátu, které zřejmě cestou isocitrát dehydrogenasy zvyšují hladinu NADH a NADPH v matrix. Redukce difulfidového můstku alternativní oxidasy je zřejmě katalyzována thioredoxinovým systémem. Obrázek: struktura alternativní oxidasy, vznik dimeru (14.35) Obrázek: Role alternativní oxidasy, regulace: Obr. 14.33 22 Hladina enzymu je regulována na úrovni exprese. Byly detegovány nejméně dva izoenzymy. Okolní podmínky jako nízká teplota, sucho, tvorba aktivních forem kyslíku, herbicidy, inhibitory respiračního řetězce zvyšují koncentraci enzymu v buňce. Rovněž vysoká hladina citrátu indukuje transkripci alternativní oxidasy. Enzym se uplatňuje, pokud tok uhlíkatých látek převyšuje kapacitu respiračního řetězce. V případě nízké aktivity respiračního řetězce roste hladina NADH v cytosolu a tudíž dochází k inhibici Krebsova cyklu (regulace poměrem ATP/ADP a koncentrací NAD). Následkem toho roste hladina pyruvátu v buňce a dochází k aktivaci alternativní oxidasy. Vyšší hladina citrátu indukuje transkripci mRNA a syntézu enzymu. Vysoká koncentrace NADPH katalyzuje kovalentní modifikaci enzymu cestou thioredoxinu. Výsledkem je podstatné zvýšení aktivity alternativní oxidasy. To umožní rostlině udržovat dostatečně aktivní respiraci a zabránit poškození díky vniku aktivních forem kyslíku a eventuálně zabránit poškození buňky fermentačními procesy, ke kterým by mohlo docházet při vyšší koncentraci NADH (viz anaerobní glykolysa).. Obrázek 14.36 Tento faktor je důležitý zejména i u jiných organismů, např u dřevokazných hub, které žijí na substrátu obsahujícím velmi nízkou koncentraci dusíku oproti polysacharidům. Spálením celulózy až na oxid uhličitý a vodu zapojením alternativní oxidasy se omezí tvorba produktů, které by mohly sloužit jako substrát pro konkurenční organismy a navíc si tímto houba zajišťuje dostatek vody nutný pro svůj růst. METABOLISMUS LIPIDŮ Lipidy hrají v buňce roli strukturní, zásobní i regulační. Jsou hlavní součástí biomembrán, obdobně jako u živočichů. Membrány chloroplastů obsahují vysokou koncentraci galaktolipidů, ostatní membrány jsou složeny převážně z fosfolipidů. Triacylglyceroly tvoří důležitou energetickou zásobárnu buňky. jejich metabolismus je důležitý zejména u klíčících semen olejnatých rostlin. Důležitými signálními molekulami jsou fosfolipidy, produkty jejich hydrolýzy fosfolipasami, zejména kys. jasmonová: Řada látek lipidního charakteru jsou hormony nebo sekundární metabolity. Syntéza mastných kyselin Syntéza mastných kyselin probíhá u rostlin v plastidech a podobá se obdobným procesům u bakterií. Průběh syntézy je zcela analogický, jak jej známe z obecné biochemie. Zdrojem NADPH, nutného pro redukční reakce je fotosyntéza. AcetylKoA, který je startovní látkou syntézy, vzniká přímo v plastidech 23 pyruvádetdehydrogesavým komplexem. Pyruvát transportovaný do chloroplastů vzniká při anaerobní glykolýze. Komplex syntasy mastných kyselin v přírodě je dvojího typu. Type I nacházíme u živočichů a kvasinek, a je to multifunkční enzymový komplex . Každá jednotka z tohoto komplexu je schopna katalyzovat několik různých reakcí. Rostliny a bakterie obsahují type II, kdy každá jednotka katalyzuje svoji oddělenou reakci. Tento komplex funguje tedy spíše jako metabolická dráha. Kondenzační reakce, kdy se vytváří nová C-C vazba je katalyzovaná 3-ketoacyl-ACPsynthasou (KAS). Obr. 10.15. Rostliny obsahují tři typy tohoto enzymu. KAS I preferuje přenos C4-C14 zbytků, KAS II přenáší pouze dlouhé řetězce (C10C16) a KAS III přenáší acetylovou skupinu, kterou využívá jak primer. Typická reakce končí syntézou mastných kyselin 16:0 a 18:0. Některé rostliny, jako např. kokosová palma produkují větší množství mastných kyselin C10-C12. Poslední reakcí je hydrolýza thioesterové vazby, kdy se mastná kyselina uvolní, nebo přenos acylové skupiny na glycerolipid anebo desaturace acyl-ACPdesaturoasou. Tvorba kyseliny olejové (18:1) je katalyzovaná desaturasou. Tuto reakci jsou schopny provádět všechny eukaryontní a některé prokaryontní organismy. U živočichů probíhá tato reakce se substrátem stearoyl-KoA, enzym se nachází na ER. U rostlin probíhá tato reakce na se substrátem stearoyl-ACP. Enzym obsahuje nehemové železo ve formě Fe-O-Fe, reakce probíhá radikálovým mechanismem a donory reakce jsou ferreoxin nebo cytochrom b6. Obr. 10.20 Většina rostlinných desaturas je vázána na membrány ER nebo chloroplastů. Syntéza MK s dlouhým řetězcem Rostliny obsahují další mastné kyseliny C26-C32, které jsou nutné pro syntézu vosků. Také sfingomyeliny obsahují mastné kyseliny C24 a C22. Rostliny stejně jako další eukaryontní organismy obsahují tzv. elongasy, které jsou schopny doplňovat další douuhlíkaté zbytky C16 a C18. Tento systém je obdobný syntase mastných kyselin popsaný v předchozí kapitole. Tento systém není lokalizovaný v plastidech nýbrž v cytosolu a neobsahuje ACP. Oleje některých rostlin obsahují další MK, které nenajdeme u živočichů.. Mezi nejdůležitější patří polynenasycené mastné kyseliny, jako je kys. linolová a linolenová. Vznikají postupnou desaturací MK v lipidu enzymovými systémy. Obr. Deaturace 10.26 Další neobvyklé mastné kyseliny mohou obsahovat cis-dvojné vazby, hydroxylové skupiny, epoxidové kruhy, cyklopropylové kruhy apod. Tyto neobvyklé MK jsou často taxonomicky typické. Např. kys. chalmoogrová, která se dlouho používala pro léčení lepry, se vyskytuje u rodiny Flacourtiaceae, kys. petroselinová u rodiny Apiaceae (mrkev, petržel), kysl laurová u vavřínovitých roslin a palem. Přítomnost těchto neobvyklých mastných kyselin je velmi důležitá z potravinářského hlediska, protože mohou způsobovat závažné zdravotní problémy. Příkladem je kyselina eruková (20:1∆14 ) obsažená v řepkovém oleji, u které byla zjištěna souvislost mezi vyšší konzumací a infarktem myokardu. Některé z těchto kyselin jsou silně toxické , jako např. monoacetylenové kysliny a jsou proto využívány rostlinami jako obranné látky. 24 Syntéza lipidů Obr. 10.25 10.27 Syntéza lipidů Syntéza glycerolipidů probíhá u rostlin obdobně jako u živočichů tak, že se na glycerolfosfát přenáší postupně mastné kyseliny za vzniku kys. fosfatidové, která pak bud hydrolyzuje na diacylglycerol, z kterého pak vzniká triacylglycerol, nebo se z něj syntetizují fosfolipidy. Syntéza kys. fosfatidové se u rostlin realizuje dvěma způsoby: buď v plastidech nebo v ER. Plastidová cesta (stejná jako u prokaryontní) zahrnuje přenos acylu přímo z acyl-ACP na glycerolfosfát. V případě druhé cesty (eukaryontní) se acyl exportuje do cytosolu ve formě acylKoA, odkud se přenáší transferasami do lipidů ER. Díky specifitě platidové acyltransferasy obsahují lipidy syntetizované v plastidech MK většinou 16:0 v poloze sn-2 a 18:1 v poloze sn-1. Acyltransferasa v ER produkuje kys. fosfatidovou obsahující 18:0 nebo 18:1 v poloze sn-2. Mezi oběma kompartmenty existuje čilá výměna. Kys. fosfatidová vznikající v chloroplastech je hydrolyzována na DAG, který slouží jako prekurzor pro syntézu galaktolipidů a sulfolipidů, které jsou tvoří 16% glycerolipidů chloroplastu. Kys. fosfatidová vznikající v ER slouží pro syntézu fosfolipidů pro jiné membrány než plastidy. Na druhé straně DGA vznikající v ER se vrací do chloroplastů, kde z něj vznikají glycerolipidy chloroplastu. Díky specifitě transferas mastných kyselin lze ze složení MK odhadnout, kde daný glycerolipid vzniknul. Obrázek 10.29, možná 10.30 Transport ve vodě nerozpustných mastných kyselin a glycerolipidů mezi organelami probíhá pomocí tzv. LTP (lipid transfer proteinů). Tyto proteiny jsou malé hydrofilní bílkoviny obsahující uvnitř své molekuly kavitu ve tvaru tunelu, která je schopna vázat uvnitř molekulu mastné kyseliny. Galaktolipidy a sulfolipidy vzniká v plastidech z kyseliny fosfatidové, která je hydrolyzována specifickou fosfatasou. Vzniklý DAG slouží jako prekurzor syntézy galaktolipidů reakcí s UDP galakotsou, kdy vzniká monogalaktosylDAG a digalaktosylDAG (viz obr. 10.39). Sulfolipidy vznikají cestou přeměny UDP-glukosy na UDP-sulfochinovosu , která pak reaguje s DAG. Přítomnost galaktolipidů a sulfoilipdů v chloroplastech má pro rostlinu velký význam. Protože fosfát je u rostlin limitující nutriční prvek, využití galaktoslipidů a sulfolipidů, které v membráně nahrazují fosfolipidy znamená pro rostlinu velkou úsporu. Obr. 10.39 a 10.40. Syntéza acylglyceroů Tyto látky jsou hlavní zaásobní formou energie rostlinných buněk. V roslině jsou přítomny ve formě olejových tělísek. Tato tělíska jsou obklopena jednoduchou membránou, která je odděluje od cytosolu. Hydrofobní část této membrány je orientovaná do vody, zatímco řetězce mastných kyselin jdou orientovány do středu tělíska. Membrána těchto tělísek obsahují značné množství bílkoviny, zvané oleosin. Tato bílkovina o mol. hm. 10-25 kDa obsahuje sekvenci hydrofobních aminokyselin. N a C-konec bílkoviny tvoří doménu, která spočívá na povrchu olejového tělíska. 25 Tyto oleosiny se nacházejí v semenech nebo v pylu. Jejich role je zřejmě stabilizovat tato tělíska při nízké koncentraci vody a regulovat jejich velikost. Olejová tělíska semen obsahují velmi často neobvyklé mastné kyseliny, zatímco membrány těchto rosltin obsahují pouze běžné mastné kyseliny. Přítomnost těchto neobvyklých MK by měnila vlastnosti membrán nežádoucím způsobem. Metabolismus mastných kyselin Oxidace mastných kyselin probíhá u živočichů v matrix mitochondrií. U rostlin probíhá tento proces v peroxisomech (v zelených částech rostliny) a glyoxisomech (klíčící semena). Tyto organely mají u rostlin podobnou strukturu. Zatímco u živočichů je cílem tohoto procesu úplná oxidace a získání energie, u rostlin jsou lipidy porekurzory sacharidů, například při klíčení semen. Jednotlivé kroky β-oxidace které probíhají v peroxisomech nebo glyoxisomech jsou totožné s procesem β-oxidace probíhajícím v mitochondriích. U živočišných mitochondrií jsou tyto enzymy lolalizovány v matrix a jedná se o čtyři samostatné enzymy. V peroxisomech a glyoxisomech probíhá tento proces na enzymovém komplexu. Mastné kyseliny jsou uvolňovány z olejovitých tělísek lipasami a aktivovány na acylKoA. Hlavní metabolický rozdíl spočívá v tom, že FADH2 vznikající při oxidaci acylKoA se u živočichů oxidován v respiračním řetězci, zatímco u rostlin se oxiduje kyslíkem za vzniku H2O2. Velké množství peroxidu je rozkládáno katalasou, která je u peroxisomu a glyoxisomu obsažena ve velkém množství. Zvlášť studována byla oxidace mastných kyselin u semen olejnatých rostlin. AcylKOA je přeměňován cestou glyoxylátového cyklu, který je modifikací Krebsova cyklu. Klíčovým enzymem tohoto procesu je isocitrátlyasa, která štěpí izocitrát na glyoxylát a sukcinát. Sukcinát přechází do mitochondrií, kde z něj vzniká malát a ten přechází do cytosolu. Glyoxylát vzniklý štěpením izocityrátu kondeznuje další molekulu acetlKoA za vzniku malátu, který je poté oxidován na oxalacetát. Tento proces umožňuje zpracování dvou molekul acetylKoA a přitom přitom se rostlina brání ztrátám uhlíku ve formě CO2,(ke kterému by docházelo v Krebsově cyklu). Malát je v cytosolu převáděn na sacharidy cesotu glukoneogeneze. Sumární rovnice glyoxylátového cyklu je následující: 2 CH3COSKoA + NAD + 2H2O → HOOC-CH2CH2COOH + NADH + H + 2HS- KoA Obr. Schéma glyoxylátového cyklu Úprava olejů a jejich vlastností mutacemi?? 26 METABOLISMUS DUSÍKATÝCH LÁTEK Dusík tvoří jeden z nejhojnějších prvků v živých organismech. Vyskytuje se mnoha podobách a mocenstvích. Tab. 16.1 Většina dusíku obsaženého v živých organismech prochází recyklací z dusíkatých látek, které byly předtím obsaženy nebo vyloučeny jiným organismem. Obr. 16.1?? Většina dusíku na Zemi je však přítomna ve formě atmosférického dusíku, který je pro většinu organismů nedostupný. Schopnost fixovat tuto formu dusíku mají pouze prokaryontní organismy. Amoniak vzniklý touto cestou je pak zabudován do uhlíkaté kostry aminokyselin, nebo konvertován nitrifikačními bakterie na NO2- a NO3-. Na druhé straně nitráty jsou redukovány asimilační nebo disimilační cestou na nitrity a přes další metabolity až na amoniak nebo na dusík. Fixace atmosférického dusíku Dvojatomová molekula dusíku je značně inertní látka. jeho přeměna redukcí vodíkem chemickou cestou je exergonická reakce N2+ 3H2 → 2 NH3 (∆Go = -46,1 kJ/mol) Probíhá při vysoké teplotě a tlaku za katalýzy železem (Haber-Boschova syntéza) z důvodů vysoké aktivační energie. Tuto reakci jsou schopny katalyzovat některé prokaryontní organismy tzv. diazotrofy, z nichž některé žijí v symbiose s rostlinami. Souhrnná rovnice této energeticky náročné reakce je následující. N2 + 16 ATP + 8e- + H+ → 2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi Tabulka: Příklady diazotrofů Tyto procesy byly studovány na volně žijících organismech jako Clostridium, Klebsiella, Azotobacter, atd. Tato reakce je katalyzována nitrogenasovým komplexem. Tento komplex byl izolován z bakterií a byla stanovena jeho trojrozměrná struktura. Skládá se ze dvou proteinů: Fe proteinu a MoFe proteinu. MoFe protein je heterotetramer (α2β2) o celkové hmotnosti 240 kDa.Je kódován dvěma strukturními geny nifD a nifK. Fe protein je homodimer (γ2) o celkové mol. hmotnosti 128 kDa a je kódován strukturním genem nifH. Fe protein, jehož standardní redox potenciál je -400 mV přijímá elektrony od ferredoxinu nebo flavodoxinu a přenáší je na MoFe protein, kde probíhá vlastní redukce dusíku. Oba dva proteiny, FE protein a MoFe protein, obsahují velmi neobvyklé typy železosirných klasterů. Celý tetramer MoFe proteinu obsahuje 4 FeS klastery dvojího typu. První z nich (Pklaster) je 8Fe-7S klaster je kovalentně vázaný k bílkovině železem přes cysteinové zbytky. Jeho struktura je znázorněna na obrázku. Skládá se za dvou polovin. první část se podobá Fe4S4 klasteru, druhá polovina obsahuje pouze 7 atomů: Fe4S3. jeden z atomů síry je vázán v oxidovaném stavu 4 vazbami, zatímco v redukovaném stavu 5 vazbami. Tato prostetická skupina se v redukovaném stavu podobá dvěma klusterům typu Fe4S4, zatímco v oxidovaném stavu se dolní klaster otevře. Druhý typ klasteru obsahuje molybden. Existují 3 formy tohoto kofaktoru: FeMo-kluster, FeV-kluster, 27 FeFe-kluster. Nejefektivnější formou je FeMo-kluster. Tato forma existuje u symbiotických bakterií. Volně žijící bakterie mohou v případě molybdenové deficience syntetizovat FeV-nebo FeFe-kluster. Tato forma je vázaná v nitrogenase přes jediný cystein a histidinový zbytek. Struktura FeMo-klasteru je ukázána na obrázku. Skládá se ze dvou polovin. První polovina je 4Fe-3S klaster a druhá polovina je 1Mo-3Fe-3S. Tyto dva klastery jsou přemostěny třemi atomy síry. Atom molybdenu je vázán na 3 atomy síry, na histidinový zbytek a molekulu homocitrátu. Obr.16.8. 16.9 Fe-protein, první část nitrogenasového komplexu je homodimer , který váže klastser pouze jediný 4Fe-4S, což je neobvyklé. Tento enzym je schopen vázat MgADP nebo MgATP. Přitom se velmi výrazně mění jeho konformace. Při vazbě ATP se FES klaster Fe-proteinu posouvá směrem dolů smětem k P-klasteru MoFe-proteinu. Mechanismus redukce Substrátem enzymu je nejen moleulární dusík, ale také další látky jako je H+, acetylén, kyanid, azid, oxid dusný a další. Oxidovaný Fe-protein je redukován jedním elektronem pocházejícím z ferredoxinu. Poté váže 2 molekuly ATP. Po konformační změně dojde k redukci FeMo-proteinu. Vazba ATP na Fe-protein totiž silně snižuje redoxní potenciál jeho FeS klasteru. Poté se 2 molekuly ATP hydrolyzují na ADP. Oxidovaný Fe-protein je opět redukován 1 elektronem, váže 2 molekuly ATP a redukuje FeMo-protein. Přenos 2 elektronů tedy souvisí s vazbou 4 molekul ATP. Přenos redukčních ekvivalenů přes FeMo-protein jde nejdřív přes P-klaster, kde se elektrony akumulují a poté se přenesou na FeMo-kofaktor. Na tento kofaktor se váže substrát, tedy N2. Vedlejší produkt nitrogenasové reakce je H2. Mezi produktem redukce dusíku je hydrazin: N2H2. Pro úplnou redukci dusíku na NH3, je tedy zapotřebí 6 elektronů a tudíž 12 ATP, zbývající 4 ATP se spotřebují na redukci H2. Přesný molekulární mechanismus redukce N2 není ještě zcela objasněn. Poměr mezi vznikajícím H2 a NH3 však závisí na dalších faktorech, jako je například parciální tlak dusíku. Navíc, H2 může zpětnou inhibicí blkovat syntézu NH3, protože s e váže do aktivního místa N2. Obrázek, asi vlastní, cyklus redukce Aktivita enzymu se měří pomocí substrátu acetylenu, který se redukuje na ethylen. Koncentrace této látky se stanovuje pomocí plynové chromatografie. Nitrogenasa, a to její Fe-protein je velmi citlivá na kyslík, proto probíhá u anaerobních organismů. Anaerobní glykolýza i anaerobní respirace však nejsou dostatečným zdrojem ATP. Z tohoto důvodu musí anaerobní bakterie metabolizovat veliké množství substrátu. Aerobní organismy, např. ty které žijí v symbiose s rosltinami zajišťují velké množství ATP v respiračním řetězci. V tom případě, ale musí existovat mechanismus, který ochrání nitrogenasu před zhoubným vlivem kyslíku. Funkce nitrogenázy vyžaduje striktně anaerobní podmínky, na druhé straně je však určitá koncentrace kyslíku u aerobních diazotrofů nutná pro zajšitění ostatních životních pochodů. Tyto dva neslučitelné požadavky jsou řešeny různou strategií ochrany nitrogenázy před atmosferickým kyslíkem, např.: a) fotosyntetizující mikroorganismy neobsahují fotosystém II a nedochází tedy k produkci kyslíku. 28 b) respirační řetězec některých diazotrofů neslouží ani tak k produkci ATP spíše jako k odstranění kyslíku. Donorem tohoto respiračního řetězce může být i vodík produkovaný v průběhu nitrogenázové reakce. c) symbiotické diazotrofy (vikvovité rostliny) jsou chráněny leghemoglobinem produkovaným rostlinou. Tento hemoprotein má vysokou aktivitu ke kyslíku, chrání Rhizobium před poškozením a současně je zásobuje kyslíkem nutným pro respiraci. Symbiotická fixace dusíku rostlinami Symbiotická fixace dusíku má velký význam. Skoro 80% dusíku, který rostliny využívají pochází ze symbiosy. Existuje několik typů této symbiosy. První z nich se účastní Gram-negativní bakterie, rhizobia, které žijí v symbiose s luštěninami (sója, čočka, fazole, hrách, vojtěška, apod.). Druhý nejrozšířenější typ symbiosy je Grampozitivními aktinomycetami (Frankia), které žijí v symbiose se stromy a keři. Tato symbiosa je nesmírně důležitá v lesních ekosystémech. Nejlépe popsaným typem symbiosy je interakce mezi Rhizobii a luštěninami. Evoluční původ této symbiosy není zcela objasněn. Hostitelská rostlina dovoluje invaznímu organismu proniknout do kořenového systému. Proniknutí rhizobií do rostliny je charakterizováno tvorbou nodulů. Tyto noduly jsou tvořeny zcela rostlinným materiálem. Po proniknutí do buňky vytvářejí rhizobia bakteroidy, které jsou morfologicky odlišné od volných bakterií. V jádře rostliny jsou obsaženy série genů nutných pro vývoj nodulů. Tyto geny se obecně nazývají noduliny. Jedním z těchto genů kódovanou rostlinou je gen pro leghemoglobin, protein vázající kyslík. Další geny kódují nízkomolekulární látky typu flavonoidů, které se podílejí na expresi nodulačních genů bakteroidu. Geny nacházející se v bakterii a zodpovědné za syntézu nitrogenasy se nazývají nif geny. Bakteriální geny zahrnuté do procesu nodulace se nazývají nod geny (A, B, C a D) obsažené v plasmidu bakterie. Tyto geny nejsou exprimovány ve volně žijící bakterii, s výjimkou nodD, exprimovaným konstitutivně. NodD má schopnost vázat specifické flavonoidy vylučované kořeny hostitelské rostliny. Po vazbě flavonoidů se nodD stává transkripčním aktivátorem ostatních nod genů bakterie, které kódují enzymy syntézy nodulačních faktorů. NodD systém spolu s flavonoidy reguluje nejméně 20 operonů. Struktura těchto flavonoidů, typických pro jednotlivé luštěniny je ukázána na obr. Obr. Struktura flavonoidů Produktem nejdůležitějsích nod genů jsou tzv. Nod-faktory. Jedná se o lipooligosacharidy, deriváty chitinového typu. Tato struktura (3-5 Nacetylglukosaminových zbytků) je kódována NodC a je modifikována acylací neredukujícího konce faktory NodA a NodB a další modifikací, například acetylací nebo vazbou fukosových zbytků. Obr. Struktura nodulačních faktorů 16.24, Tyto nodulační faktory působí pouze na hostitelské rostliny. Nodulační faktory se pravděpodobně vážou na specifické receptory na povrchu plasmatické membrány hostitelské buňky. Vazba těchto látek o koncentraci nižší než 10-9 M vyvolává během několika minut depolarizaci membrány, což je spojeno s výtokem chloridů a 29 draselných iontů. Nodulační geny vyvolávají expresi genů hostitelské rostliny. Tyto geny se nazývají noduliny. Tato detekce byla pozorována 6 h po infekci. Vazba Nod faktorů vyvolává produkci obranných proteinů rostliny (jako jsou prolin-rich proteiny, peroxidasy, apod.). Dělení buněk v místě invaze je pozorováno asi 18 - 30 po infekci. Signály, které koordinují morfogenezi však nejsou objasněny. Je zajímavé, že houby obecně produkují tzv. elicitory, které jsou chitooligosacharidy obsahující 5-7 Nacetylglukosaminových jednotek. Tyto látky se od Nod-faktorů liší nepřítomností mdofikujících skupin, jako je např. acylová skupina. Jejich interakce s rostlinou vyvolává podobné reakce, jako u Nod-faktorů, tzn. depolarizaci membrány, výtoky iontů a syntézu obranných látek, nedochází však k nodulaci. Nod-faktory a chitinové elicitory se tudíž vážou na odlišné receptory a regulují expresi odlišných genů. Uvnitř nodulu je generováno specifické mikroprostředí, které umoňuje zásobování buňky kyslíkem za účelem produkce ATP a současně brání nitrogenasu před zhoubným vlivem kyslíku.Toto je zajištěno tím, že některé části parenchymu nodulu tvoří nepermeabilní bariéru pro kyslík. Dalším faktorem je leghemoglobin produkovaný rostlinou. Tento monomerní hempoprotein a je obsažen v cytoplasmě. Jedna molekula leghemoglobinu váže jednu molekulu kyslíku. Tato látka koordinuje přenos kyslíku uvnitř nodulu. Obdobně jako hemoglobin je by mohla být ovlivňována malými molekulami, mechanismus však není znám. Koncentrace kyslíku v nodulu je dále regulována respiračním řetězcem. Cytochromoxidasa bakteroidu má vysokou afinitu ke kyslíku (Km = 8 nM, zatímco Km rostlinného enzymu se pohybuje v oblasti 100 nM). Je zajímavé že Km enzymu ve volně žijící bakterii je zhruba 50 nM. Kyslík je spořebováván bakteriální respirací za vzniku ATP. Toto ATP je využíváno nitrogenasou. Pokud koncentrace kyslíku vzroste, dojde k inaktivaci nitrogenasy, zastaví se spotřeba ATP a vysoký poměr ATP/ADP inhibuje repiraci. Obr. 16.30 Faktory regulující zásobování nodulu kyslíkem. Syntéza nitrogenasy je regulována kyslíkem na úrovni exprese. Produkty fotosyntézy syntetizované rostlinou vstupují do nodulu jako sacharosa, avšak bakteroidem jsou využívány ve formě organických kyselin, jako PEP, oxalacetát nebo malát. Oxalacetát je cestou Krebsova cyklu přeměňován na 2oxoglutarát, látku nutnou pro vazbu amoniaku vytvořeného nitrogenasou. Méně podrobně je popsána symbióza mezi dvouděložnými dřevinami a aktinomycetou Frankia. I když jejich interakce vede k tvorbě nodulů, symbiont není obalen peribakteroidní membránou nýbrž vrstvou polysacharidů pocházejících z rostliny. Je popsána přítomnost látky podobné hemoglobinu mající stejnou úlohu jako leghemoglobin u vikvovitých rostlin. Asimilace nitrátu a nitritu Nitrát je důležitým zdrojem dusíku pro rostlinu. Prvním krokem asimilace je redukce na nitrit, katalyzovaná enzymem nitrátreduktasou (NR) NO3- + NAD(P)H + H+ → NO2- + NAD(P) + H2O Nitrátreduktasa je metaloenzym tvořící homodimer nebo homotetramer. Mol.hmotnost monomeru je 115 kDa. Tento enzym obsahuje 3 kofaktory:FAD, 30 hemové železo a molybdenový kofaktor MoCo. V tomto kofaktoru je molybden vázán ve formě komplexu s molybdopterinem (na rozdíl od nitrogenasy) Obr. 16.39.A Sekvence přenosu elektronů je od NADH, na hem a dále na MoCo směrem k nitrátu Obrázek, 16.38 NR monomer má tři hlavní domény, vázající FAD (C-konec enzymu), hem (uprostřed enzymu) a MoCo (poblíž N-konce enzymu). Enzym obsahuje regulační oblasti, které jsou fosforylované kinasou a dále vážou 14-3-3 proteiny. Struktura FAD-vázající oblasti je vysoce homologní ferredoxin-NADP oxidoreduktase (fotosyntéza). Oblast vázající hem je velmi podobná hemoproteinům typu cytochrom b5. Poslední oblast obsahující MoCo se podobá enzymům typu xanthinoxidasy, sulfitoxidasy, a dalším. NR je lokalizována v cytosolu buněk vegetativních orgánů, jako jsou kořeny nebo listy. Vysokou aktivitu najdeme v epidermálních buňkách nebo buňkách kortexu blízko povrchu kořene. C4 rostliny obsahují vysokou koncentraci NR v mesofylu, který generuje vysokou hladinu NADPH při fotosyntéze. Eznym je schopne redukovat chlorečnan na chloritan, který je toxický, což je podstatou herbicidního účinku chlorečnanu.Vegetaticní orgány obsahují kromě NR současně nitrireduktasu, a to v koncentraci mnohonásobně vyšší než NR. Tím se zajistí efektivní odbourání vznikajícího nitritu. NR je regulována několika faktory, jako je koncentrací nitrátu a dusíkatých metabolitů (zejména glutaminu), dále uhlíkatými metabolity, hotmony nebo světelm. Transkripce NR genu je velice efektivní. Koncentrace mRNA pro NR vzroste v buňce po přídavku nitrátu během několika minut.Je zajímavé, že v listech vyžaduje exprese NR přítomnost funkčních chloroplastů, což zajišťuje že vznikající nitrit bude odbourán. Pro maximální idukci NR je vyžadováno světlo a dostatek uhlíkatých metabolitů, např. sacharosy. Nadbytek dusíkatých látek tuto indukci blokuje, regulačním metabolitem je pravděpodobně glutamin. Aktivita NR je posttranslačně regulována kovalentní modifikací příslušné proteinkinasy a v obráceném směru pomocí proteinfosfatasy. Fosforylace na serinovém zbytku způsobuje inaktivaci NR, k této inaktivaci však dochází až po vazbě 14-3-3 proteinu. Faktorem vyvolávajícím tuto inaktivaci je nedostatek světla nebo nízké koncentrace CO2. Obrázek: 16.42 zjednodušený Redukce nitritu Navazující reakcí NR je redukce vznikajícího nitritu šesti elektrony pomocí nitritreduktasy (NiR). Eznym je lokalizován v plastidech. Zdrojem redukce je ferredoxin, který ve fotosyntetizujících orgánech je redukována světlem a v kořenech enzymem ferredoxin-NADP reduktasou pomocí NADPH NO2- + 6 Fdred + 8H+ → NH4+ + 6 Fdox + 2H2O NiR NADPH + 2 Fdox → NADP+ + 2Fd red + H+ ferredoxin-NADP reduktasa Vlastní NiR je monomerní enzym o mol. hmotnsoti 60 - 70 kDa, který má dvě funkční domény a kofaktory. N-terminální část váže pravděpodobně ferredoxin, C- 31 terminální část obsahuje 4Fe-4S klaster a sirohem. Sirohem je hemoprotein obsahující tetrahydroporfyrin s osmi karboxylovými skupinami v bočním řetězci. Obrázek: struktura sirohemu Struktura NiR 16.43 (sehnat 3D strukturu NiR) Nitrit vznikající v cytosolu je transportován do plastidů, kde je redukován. NiR je transkripčně regulována současně s NR, a to světlem a nitrátem. Efektivní redukce nitritu vyžaduje intenzivní světlo, z tohoto důvodu obsahuje jarní zelenina poměrně vysokou koncentraci nitrátu. Asimilace amoniaku Amoniak se do rostliny dostává mnohými cestami. Transportem NH4+ z vnějšího prostředí, fixací vzdušného dusíku, nitrátovou asimilací anebo jako produkt fotorespirace nebo deaminace aminokyselin. Primárním enzymem, který inkorporuje amoniak do uhlíkaté kostry je u rostlin glutaminsyntetasa. Katalyzuje přenos dusíku do amidické skupiny L-glutaminu HOOC-CH2-CH2-CH-COOH + ATP + NH4 + ⇔ ADP + H2N.CO-CH2-CH2-CH-COOH + Pi ⏐ ⏐ NH2 NH2 Meziproduktem reakce je glutamylfosfát, který je hydrolyzován amoniakem. Rostlinná GS je oktamer o mol. hmotnosti celkem 350 - 400 kDa. Glutaminsytetasa (GS) se vyskytuje ve formě izoenzymů. V cytosolu se vyskytuje izoenzym GS1 a v plastidech izoenzym GS2. Oba dva enzymy jsou vysoce homologní, avšak jsou produkty rozdílných genů. Izoenzym GS2 je homooktamer kódovaný jedním jaderným genem. Izoenzym GS1 je heterooktamer, který se skládá ze dvou až čtyř typů podjednotek, které jsou opět kódovány jaderným genomem. U luštěnin, které žijí v symbiose s rhizobii produkují noduly další izoenzym GSn. Funkce izoenyzmů GS je rozdílná. Izoenzym GS2 převládá v listech, kde asimiluje amoniak vznikající např. nitrátovou asimilací nebo dusík vznikající při fotorespiraci. Geny pro GS2 jsou exprimovány zejména v mezophylu. GS1 je obsažena v listech pouze v nízké koncentraci, oproti kořenům. Jeho role je asimilace amoniaku, který se transportuje nebo vzniká v kořenech. Geny pro GS1 se exprimují zejména ve floemu a GS1 tedy zajišťuje syntézu glutaminu, který je transportován na delší vzdálenosti. GS je velmi S Fe S Fe Fe FeS S S S S S Cys Cys Cys Fe Cys Struktura sirohem-Fe4S4 centra 32 efektivní systém asimilace amoniaku. Její Km pro amoniak je řádově 3 - 5 µM. Specifickými inhibitory této reakce jsou glutamátové analogy methionin sulfoximin nebo fosfinotricin. (viz obrázek). Glutamátsyntasa L.glutamin je redukčně deaminován reakcí s oxoglutarátem enzymem glutamátsyntasou (GOGAT: glutamin:oxoglutarát aminotranferasa) H2N.CO-CH2-CH2-CH-COOH HOOC-CH2-CH2-CH-COOH ⏐ ⏐ NH2 + 2H + + 2e ⇔ NH2 + HOOC-CH2-CH2-CO-COOH HOOC-CH2-CH2-CH-COOH ⏐ NH2 Ve vyšších rostlinách existují dvě skupiny GOGAT. První z nich je ferredoxin dependentní (Fd-GOGAT) a najdeme ji výlučně ve fotosyntetizujících organismech. Druhý enzym NAD(P)H-dependentní GOGAT existuje v rostlinách a bakteriích. U rostlin se oba typy enzymů vyskytují v plastidech. Fd-GOGAT je Fe-S protein skládající se z jedné podjednotky 140-160 kDa. NADH dependentní glutamátsyntáza je rovněž monomer zhruba 200 kDa. Imunologické studie prokazují, že příbuznost ferredoxinového enzymu a NADH enzymu je velmi malá, jedná se tudíž o dva různé proteiny. Cyklus GS/GOGAT je u rostlin hlavní drahou asimilace amoniaku. Obr. 8.6. Zatímco u GS je rozdílná funkce izoenzymů GS1 a GS2 mimo pochybost, u GOGAT není role obou enzymů zcela objasněna. Ferredoxinový enzym najdeme v listech a je zodpovědný za více jak 95% aktivity. NADPH dependentní enzym je sice přítomen v nízkých koncentracích v listech, avšak tvoří dominantní izoenzym v nezelených orgánech jako jsou kořeny. Fd-GOGAT se tedy zřejmě podílí na asimilaci amoniaku vznikajícího při fotorespiraci, zatímco NADPH dependentní enzym asimiluje amoniak vznikající primární cestou, např. redukcí nitrátu. Mutanty deficientní na FdGOGAT jsou poškozovány v případě, pokud u rostliny probíhá fotorespirace, avšak jsou schopny asimilovat amoniak vzniklý primární cestou. Nízká koncentrace NADPH-dependentní GOGAT je zřejmě dostatečná k asimilaci amoniaku. Jiným enzymem, který se u bakterií podílí na asimilaci amoniaku je glutamátdehydrogenasa: 2-oxoglutarát + NAD(P)H + NH4+ ⇔ L-glutamát + NAD(P) Reakce je posunuta ve prospěch syntézy glutamátu. U rostlin hraje tato cesta zřejmě roli pouze v případech silného nadbytku amoniaku, z důvodu relativně vysoké hodnoty Km = 10 -80 mM, která se v listech nevyskytuje. Předpokládá se, že by hlavní roli enzymu byla spíše deaminace glutamátu na amoniak. Dusík přenesený na L-glutamát se účastní transaminačních rekcí katalyzovaných transaminasami, z nichž nejdůležitější je aspartátaminotransferasa. U C4 rostlin slouží 33 aspartát k transportu substrátů z mezofylových buněk do buněk pochev cévních svazků. Transportní a zásobní formy dusíku Transportní a zásobní formy dusíku jsou dusíkaté látky obsahující vysoký poměr N:C. Tento transport je důležitý především v klíčícím semeni, stárnutí rostliny, transport dusíku z nodulů, apod.. Jednou z nejdůležitějších látek je aspararagin. Poměr N:C u asparaginu je 2:2, zatímco u glutamátu 1:5. Asparagin byl první aminokyselinou, která byla izolována zhruba před 200 roky. Vyskytuje se ve vysokých koncentracích ve floemu. Syntézu asparaginu katalyzují dva enzymy: Glutamin-dependentní a amoniak-dependentní asparaginsyntetasa. Tato reakce využívá ATP. Obecně platí, že Km pro glutamin je nižší než Km pro amoniak. Například u sóji je Km pro glutamin 0.18 mM, zatímco pro amoniak 3 mM. Obr. 8.19 Syntéza asparaginu je u některých rostlin velmi výrazně inhibována světlem a sacharosou. Luštěniny lze podle transportující se formy dusíku rozdělit na ty, které transportují amidy (asparagin, glutamin), což jsou zejména luštěniny mírného pásma nebo ureidy v případě luštěnin tropického původu, jako je sója.. Těmito ureidy je např. allantoin nebo kys. allantoová. Obrázek ureidů Cesta syntézy ureidů je složitá. Vznikají z purinové baze inosinmonofosfátu přes xanthin a kys. močovou. Přes složitost je syntéza ureidů o 50% levnější (ATP) než syntéza asparaginu. Cesta odbourání ureidů je rovněž složitá a v principu se jedná o postupné odbourávání allantoinu na allantoát, ze kterého se pak odštěpuje močovina rozkládaná ureázou na oxid uhličitý a amoniak. Skladovací formou dusíku u dřevin je arginin. Metabolismus síry Síra je vyskytuje v buňce buď v redukované formě, SH-skupiny, je součástí vitaminů. Jako sulfátový ester je součástí polysacharidů. Nejdůležitější látkou obsahující síru je peptid glutathion. Hlavní formou, která se transportuje do rostliny je síran. Síran se přes plasmatickou membránu transportuje kotransportem s protony, stechiometrie přenosu je 3H+/SO42-, transport je tedy elektrogenní. Ukazuje se však, že rostliny obsahují několik transportních systémů pro sírany. Transportní systém přenášející sírany do vakuoly je zřejmě uniport řízený velikostí transmembránového potenciálu, který je kladný uvnitř. Obr. Transport síranu 16.56, do vakuoly?? Redukce síranu probíhá v chloroplastech, sírany tvoří součást obsahu vakuoly. Redukce síranu probíhá v několika stupních, výsledkem redukce je sulfid. SO42- + ATP + 8e + HH+ → S2- + 4H2O + AMP + PPi 34 Tato reakce je energeticky náročná (∆Go= 732 kJ/mol). Energie je kryta jednak pomocí ATP a dále reduktanty pocházejícími z fotosyntézy (u nezelených částí rostliny zřejmě pomocí NADPH redukovaného v pentosafosfátovém cyklu). Prvním krokem reakce je aktivace sulfátu na adenosin-5´-fosfosulfát (APS) enzymem ATP-sulfurylasou. SO42- + ATP ⇔ PPi + APS strukturní rovnice APS obsahuje makroergickou vazbu mezi fosfátem a síranem a reakce je silně posunuta doleva (∆Go = +42 kJ/mol). Vznikající difosfát je hydrolyzován pyrofosfatasou, čímž se reakce posouvá více doprava. Enzym je lokalizován zejména v chloroplastech, minoritní podíl izoenzymů obsahuje cytosol.. Enzym je tetramer o mol. hmotnosti 4x 50 kDa. Průběh redukce APS na sulfid není zcela objasněn. S největší pravděpodobností se síran redukuje na siřičitan. Enzym redukující siřičitan na sulfid je v rostlině dobře znám. Jedna z hypotéz předpokládá, že APS se fosforyluje pomocí ATP na fosfoadenosinfosfosulfonát (PAPS) rovnice a ten se pak redukuje PAPS reduktasou na siřičitan. Zdrojem redoxních ekvivalentů je thioredoxin (tato cesta existuje u mikroorganismů a cyanobakterií). PAPS reduktasa však u rostlin zatím nebyla popsána. Druhou možností je přímo redukce APS pomocí APS reduktasy. Zdrojem redukce je redukovaný glutathion. Tento enzym byl popsán u Arabidopsis. obr. 16.61 Sulfitreduktasa katalyzuje redukci siřičitanu na sirník. SO3 2+ 6 ferredoxin(red) + 6H+ ⇔ S2+ 3H2O V nezelených částech rostliny probíhá redukce pomocí NADPH. Struktura enzymu připomíná nitritreduktasu a je s ní silně homologní. Enzym obsahuje sirohem jako kofaktor a klaster 4Fe-4S. Je složen ze 2 - 4 podjednotek (64 - 70 kDa). Sekvenční analýza prokázala, že oba enzymy patří do jedné superrodiny anionreduktas. Sulfitreduktasa ze špenátu je schopna redukovat nitrit, i když afinita enzymu pro nitrit je mnohem nižší. Sirník vznikající redukcí sulfitu je inkorporován do molekuly cysteinu sledem dvou reakcí. První reakce tvorba O-acetylserinu ze serinu a acetyl-Koa. Druhá reakce je thiolysou. Obrázek 16.64 Ačkoli redukce síran u vyžaduje redukovaný ferredoxin, nezdá se být regulována světlem, na rozdíl od enzymů redukce nitrátu. Enzymy jsou vysoce aktivní ve vyvíjející se rostlině, zatímco v dospělé rostlině aktivita silně klesá. Při nedostatku 35 síry v rostlině aktivita enzymů rovněž silně vzrůstá (opačně je tomu u nitrátu, kdy enzymy jsou exprimovány v přítomnosti nitrátu). Asimilace CO2 - fotosyntéza Fotosyntéza je oxidoredukční proces, kdy se CO2 redukuje na cukerné látky (CH2O). Redukující látkou H2X je nejčastěji voda, vznikající oxidovanou látkou X je pak kyslík. Tato redukce je silně endergonická. Změna volné energie po tvorbu jedné hexosy je ∆Go = +2840 kJ/mol, tato energie je kryta elektromagnetickým zářením. CO2 + 2H2X → (CH2O) + 2X + H2O U eukaryontních organismů je tento proces lokalizovaný ve speciálních plastidech chloroplastech. Předpokládá se, že tato organela vznikla endosymbiosou protoeukaryontní buňky a fotosyntetizující bakterie. Chloroplast obsahuje vnitřní membránový systém zvaný thylakoidy. Vnitřek chloroplastu se nezývá stroma. Membrána thylakoidu odděluje lumen thylakoidu od stroma chloroplastů. Některé thylakoidy jsou stohovány a pod mikroskopem se jeví ve formě tzv. gran. Obrázek chloroplastu 12.1 Granální thylakoidy a thylakoidy stromatu Fotosyntéza zahrnuje dvě fáze, světelnou (tzv. Hillovu reakci) a temnou (tzv. Calvinův cyklus). První z nich produkuje ATP, NADPH a eventuelně O2, které jsou pak využívány při temné fázi, tj. redukci oxidu uhličitého. Tyto reakce jsou lokalizovány v rozdílných částech chloroplastu: světelná fáze probíhá na thylakoidní membráně, temná fáze ve stroma chloroplastu. Světelná fáze fotosyntézy Při Hillově reakci se využívá energie světla k oxidoredukční reakci, kdy se NADP+ redukuje na NADPH a voda se oxiduje na kyslík. Tento typ fotosyntézy se nazývá oxygenní. 36 H2O → 1/2 O2 + 2H+ + 2e Eo = + 0,81 V NADP + 2e + H+ → NADPH Eo = - 0,32 V ∆Eo = -1,14 V ∆Go = +220 kJ/mol Standardní volná energie této reakce je tedy ∆G = +220 kJ/mol. Přenos elektronů přes fotosyntetické komplexy je spojen s produkcí elektrochemického potenciálu protonů, který je využit k syntéze ATP enzymem ATP- synthasou. ADP + Pi → ATP ∆Go = + 30 kJ/mol Existuje však typ fotosyntézy, kdy nedochází k uvolňování kyslíku, tzv. fotosyntéza anoxygenní, např. kdy nedochází k oxidaci vody, nýbrž H2S, takže produktem reakce je síra, nebo v případě tzv. cyklického transportu elektronů, kdy je energie světla využívána pouze k produkci ATP Tato reakce je umožněna díky speciálním barvivům zvaným chlorofyly. Světelné kvantum je absorbováno elektronovým systémem těchto chlorofylů, který se přitom excituje do tzv. excitovaného singletového stavu (nazývaný proto, že se spin elektronu se při excitaci nemění). Množství pohlcené energie ∆E je přitom nepřímo úměrné vlnové délce světla. ∆E = hc/λ Tento stav trvá velmi krátkou dobu (řádově 10-9 s). Během tohoto stavu se může spin elektronu obrátit a molekula přejde do tripletového stavu, jehož doba života je nesrovnatelně delší (řádově až sekundy). Návrat elektronu do základního stavu může proběhnout tzv. relaxací, kdy se energie vyzáří ve formě tepla, nebo fluorescencí, kdy je energie vyzářena ve formě fluorescenčního záření. Třetí možností je tzv. transfer energie, kdy se energie přenese postupně na další molekuly, které se nacházejí v těsné blízkosti. Poslední, a v případě fotosyntézy nejdůležitějším pochodem, je přenos náboje, kdy se elektron přenese na akceptor, který se tímto redukuje. Obrázek elektronových přechodů hν chlorofyl → chlorofyl* chlorofyl* + A → chlorofyl+ + AEnergie 1 fotonu o vlnové délce 700 nm je 2,83 .10-19 J. Tato energie je absorbována při excitaci molekuly chlorofylu ze základní hladiny na hladinu excitovanou. 1 mol chlorofylu (6,02 .1023 molekul) pohltí tedy 170 kJ. Pro redukci 1 molekuly NADP je tedy zapotřebí teoreticky 1-2 fotony. Praktická hodnota je však 4 fotony (viz níže). Světelná energie může být rovněž využita k tvorbě protonmotivní síly přes membránu thylakoidů a tudíž k syntéze ATP prostřednictvím ATP-synthasy. 37 Struktura a funkce fotosyntetických pigmentů Většina fotosyntetizujících organismů obsahuje chlorofyl (rostliny, řasy a cyanobakterie), některé anaerobní bakterie obsahují bakteriochlorofyl. Některé bakterie obsahují další pigmenty absorbující zelené světlo, tzv. fykobiliny. Součástí fotosyntetických systémů jsou navíc karoteny. Všechny fotosyntetizující organismy produkující kyslík obsahují chlorofyl a a karoteny. Rostliny a zelené řasy obsahují navíc chlorofyl b. Některé eukaryontní oragnismy obsahují namísto chlorofylu b jiné chlorofyl b, c, nebo d.Červené řasy a cyanobakterie obsahují kromě chlorofylu a fykobiliny. Struktura chlorofylů se podobá hemu, s následujícími nejpodstatnějšími rozdíly: chlorofyly mají atom chelatovaného Mg2+ namísto železa, obsahují dlouhý hydrofobní řetězec C20, zvaný fytol a obsahují kromě čtyř pyrrolových jader navíc pátý kruh. Syntetická dráha chlorofylů do stadia protoporfyrinu IX je totožná s hemem. Od tohoto bodu se obě dráhy větví. Enzymem magnesiumchelatasou se do molekuly inkorporuje Mg2+, poté dochází k methylaci řetězce na kruhu III a vytvoření cyklu V. Po redukci vinylové skupiny na kruhu II se redukuje kruh IV. Po připojení fytylového 38 zbytku vzniká chlorofyl a. Chlorofyl b vzniká oxidací methylové skupiny na formylovou na kruhu II. Chlorofyly mají dvě hlavní absorpční maxima. První v oblasti kolem 430 nm (absorpce modrého světla), druhé maximum kolem 650 (??) nm (červené světlo). Chlorofyly b, c d ??? Syntéza chlorofylu 12.5 Další skupinou účastnící se fotosyntézy jsou tetraterpeny karoteny. Cesta jejich syntézy vede od geranylgeranyldifosfátu, přes fytoen k lykopenu, které se liší počtem dvojných vazeb. Enzymy, které katalyzují tuto oxidaci se nazývají desaturasy. Prostřednictvím cyklasy pak vzniká buď β-karoten nebo α-karoten, které se liší polohou jedné dvojné vazby na levém kruhu. Z α-karoteinu pak hydroxylací vzniká lutein. Z β-karotenu hydroxylací a epoxidací vznikají zeaxanthin a violoxanthin (tyto látky nazýváme xanthofyly). Karoteinoidní pigmenty absorbují v oblasti 400 - 500 nm, jsou tedy žluté a oranžové. Hrají roli jako pomocné látky při záchytu světla a přenosu na chlorofylovou molekulu, dále mají důležitou strukturní roli v LHC (light harvesting complex, viz dále). jejich nejdůležitější role je však ochranná. Excitace chlorofylu může vést k tvorbě tripletového stavu (a tudíž k jejich zablokování) nebo ke vzniku singletového kyslíku, který má destruktivní účinek. Mutace, která blokuje syntézu karotenoidů, je pro rostliny vystavené světlu letální. 39 schéma účinku karotenů tripletový kyslík Schéma syntézy karotenoidů, upravené 12.7 Červené řasy a cyanobakterie obsahují další fotosyntetické pigmenty zvané fykobiliny. Tato barviva jsou tetrapyrrolové lineární struktury neobsahující atom kovu. Jsou hydrofilní díky nepřítomnosti lipidního řetězce. Na bílkovinu jsou vázány prostřednictvím thioéterových můstků.Existují dva základní typy těchto barviv: fykocyanobiliny a fykoerythrobiliny. Obrázek 12.9 Tato barviva absorbují světlo v oblasti 500 - 650 nm. Obrázek XY ukazuje absorpční maxima všech barviv, které se podílejí na fotosyntéze. 40 Obrázek spekter 12.6 Struktura fotosyntetického reakčního centra Fotosyntetická reakční centra realizují reakci přenosu náboje z excitovaného chlorofylu na akceptor. hν chlorofyl → chlorofyl* chlorofyl* + A → chlorofyl+ + AStruktura těchto center je postupně objasňována u mnoha fotosyntetizujích organismů. První etapa těchto rozsáhlých studií byla prováděna na Rhodobacter sphaeroides. Tento relativně jednoduchý komplex obsahuje zvláštní pigment P865, což je dimer bakteriochlorofylu, nazvaný podle svého absorpčního maxima. U rostlin byly nalezeny analogické pigmenty P680 a P700. Kromě tohoto pigmentu obsahuje reakční centrum ještě bakteriopheophytin (chlorofyl neobsahující hořčík), lipidní chinony a atom železa. Sérií reakcí přenosů náboje se elektrony z excitovaného chlorofylu postupně na další složky reakčního centra. Tyto přenosy probíhají řádově v čase 1 ps, 200 ps a 100 - 200 µs. Struktura a přenos elektronů z P865 je ukázána na obrázku. Tento přenos probíhá pouze jednou cestou v jedné polovině komplexu. 41 Obr. 12.11 Všechny oxygenní fotosyntetizující organismy, bakterie, řasy a rostliny obsahují dva typy reakčních center: FSI a FSII. Struktury těchto center nebyly ještě určeny. Jejich složení je uvedeno v tabulce: FSI P700 chlorofyl a fylochinon Fe-S centra FSII P680 feofytin plastochinon (Qa) plastochinon (Qb) FSI obsahuje komponenty velmi podobné reakčnímu centru R. sphaeroides nebo R. viridis. Předpokládaná struktura FSII u rostlin je uvedena na obrázku. Elektron se přenášejí z excitovaného P690 postupně na feofytin a obě plastochinononé molekuly. Obdobný model pro FSI byl stanoven na základě studií komplexu FSI cyanobakterií. Elektrony se přenášejí z P700 na molekuly chlorofylu a, na fylochinon a poté přes tři Fe-S centra až na akceptor, kterým je ferredoxin. 42 Obrázek 12.12 a zjednodušený 12.13 + 12.15 Kromě těchto chlorofylů reakčních center obsahuje membrána thylakoidů další molekuly chlorofylu a ve formě tzv. antén, a to zhruba 250 molekul chlorofylu a na 1 reakční centrum. Tyto molekuly absorbují při kratších vlnových délkách, než barviva P680 a P700. Energie světla absorbovaného těmito anténami se postupně přenáší až na pigmenty P680 a P700 pomocí tzv. "rezonančního transferu energie". Tento přechod (bez vyzáření a absorpce světla) vyžaduje těsnou blízkost donoru a akceptoru a blízkost energetických hladin jejich excitovaných singletových stavů. Transport elektronů fotosyntetickým systémem Thylakoidová membrána chloroplastů obsahuje FSI, FSII a další složky, které při tzv. necyklickém transportu produkují O2, NADPH a ATP. Těmito složkami účastnícími se elektronového transportu jsou především plastochinon, transmembránový proteinový komplex cytochrom b6f, plastocyanin, ferredoxin, ferredoxin-NADP oxidoreduktasa a ATP-synthasa. FSII je integrální membránový proteinový komplex. Jeho struktura u rostlin není přesně známa. Obsahuje více než 20 proteinů. Proteiny D1 a D2 (32 a 34 kDa) jsou hlavními bílkovinami vázajícími chlorofyly, feofytiny a chinony. Další bílkoviny CP43 (51 kDa) a CP47 (43 kDa) vážou chlorofyly a anténního systému. Součástí celého systému jsou dále hydrofilní proteiny 33, 23 a 17 kDa, které se podílejí na oxidaci vody. Většina těchto bílkovin je kódována genomem chloroplastu, některé jaderným genomem. Absorpcí světla se redoxní potenciál fotosystémů posouvá do záporných hodnot, tzn. zvyšují se jejich redukční schopnosti. Tyto elektrony se poté přenášejí na komponenty s elektropozitivnějším potenciálem. Akceptorem elektronů v systému FSII je molekula plastochinonu, kdy se účinkem dvou fotonů molekula Qb postupně mění na semichinon a poté na dianion Qb 2. Poté se tento dianion asociuje s dvěma protony ze stroma. Vzniklý QbH2 oddisociuje od FSII do membrány thylakoidu. Oxidovaný P680, který je silným oxidovadlem, doplní chybějící elektrony z vody (D). hν P680.Pheo.QaQb → P680*.Pheo.QaQb→ P680+ .Pheo.QaQb→ P680+ .Pheo.Qa - Qb→ D hν P680+ .Pheo.QaQb → P680.Pheo.QaQb → P680*.Pheo.QaQb → P680+ .Pheo- .QaQb - → 43 D P680+ .Pheo.Qa - Qb → P680+ .Pheo.QaQb 2→ P680.Pheo.QaQb 2Obrázek - přenos elektronů 12.22 A,B FSII funguje jako voda-plastochinon oxidoreduktasa, která je dependentní na světlo.Plastochinon je oxidován na straně lumen komplexem cytochromu b6f, oba protony přitom acidifikují prostor lumen. Tento komplex se svojí strukturou a funkcí podobá komplexu III respiračního řetězce (cytochrom bc1). Je složen z cytochromu f (typ cytochromu c, 32 kDa), železo-sirného proteinu 2Fe-2S (19 kDa) a cytochromu b6 (se dvěma typy hemu b, 24 kDa). Poslední složkou je protein vázající chinon (17 kDa). Obrázek 12.25 Tyto proteiny jsou kódovány chloroplastovým a jaderným genomem. Cytochrom b6f je integrální membránový protein, oxidoreduktasa, oxidující plastochinon a redukující platocyanin. Tato oxidace je spojena s přenosem 4H+/2e ze stroma do lumen. PQH2 + 2PCox + 2H+ (stroma) → PQ + 2PCred + 2H+ (lumen) Dva protony přitom pocházejí z oxidace PQH2. Obdobně jako u cytochromu bc1 probíhá tato translokace pravděpodobně přes Q cyklus, přímé důkazy zatím chybí. Plastocyanin je malý protein (11 kDa) vázaný na straně lumen a obsahující měď. Tento protein redukuje FSI oxidovaný přenosem náboje vyvolaným absorpcí fotonu. 44 FSI lze chápat analogicky jako FSII jako plastocyanin-ferredoxin oxidoreduktasu závislou na světle. Tento integrální membránový komplex obsahuje zhruba 15 proteinů, z toho dva hydrofobní proteiny (80 kDa), které vážou elektronové přenašeče jako je P700, chlorofyl a, fylochinon a jeden železo-sirný klaster. Další malý železosirný protein (9 kDa) obsahuje dvě železo-sirná akceptorová centra Fa a Fb. Vazba plastocyaninu na straně lumen a ferredoxinu na straně stroma je zajištěna dvěma hydrofilními proteiny 17 a 18 kDa. Funkce dalších komponent není doposud známa. Proteiny komplexu FSI jsou kódovány jaderným a chloroplastovým genomem. Ferredoxin lokalizovasný na straně stroma má standardní redox potenciál - 0.42 V, je tedy schopen redukovat NADP prostřednictvím enzymu ferredoxin-NADPoxidoreduktasy. Enzym obsahuje FAD jako kofaktor a redukce probíhá přes stádium semichinonu. Ferredoxin může sloužit jako redukční substrát dalších enzymů, jako je glutamátsynthasa, nitritreduktasa, sulfitreduktasa, apod. Obrázek Oxidace vody komplexem FSII Při necyklické fotosyntéze se oxidovaný komplex FSII opět redukuje, prostřednictvím vody. 2 H2O → O2 + 4H+ + 4e Tento proces vyžaduje předání 4 elektronů. Standardní redoxní potenciál páru O/H2O je +0.82 mV, to znamená že pár P680/P680+ musí být mnohem elektropozitivnější (1- 45 1,2 V). Bylo prokázáno, že oxidaci vody katalyzuje protein obsahující čtyři manganaté ionty. Deficience manganu u řas způsobuje poruchy při vývoji kyslíku. Zdá se pravděpodobné, že tyto manganaté ionty působí jako akumulátor elektronů a přitom se oxidují na Mn3+. Manganaté ionty přitom nejsou přímým donorem pro P680. Pomocí bodové mutageneze se prokázalo, že tímto mezičlánkem je Tyr-160 podjednotky D1 systému FSII, kdy vzniká tyrosinový radikál (Z+) schopný oxidovat Mn2+ . Mn2+ -Z-P680 → Mn2+ -Z-P680+ → Mn2+ -Z+ -P680 → Mn3+ -Z-P680 Cyklický transport elektronů při fotosyntéze. Chloroplasty jsou schopny provádět cyklický transport elektronů, na kterém se podílí pouze FSI. Nedochází při něm k vývoji vody (tedy bez účasti FSII) a produktem není NADPH. Funkce řetězce apůsobuje přenos prtotonů ze stromatu do lumen thylakoidů. Tento gradient je pak využit k syntéze ATP přenosem H+ z lumen thylakoidů zpět do stromatu. Jediným produktem je ATP. Donorem elektronů pro FSI je cytochrom b6f, který sám je cyklicky redukován ferredoxinem. Způsob přenosu elektronů na ferredoxin není zcela objasněn. Předpokládá se, že ferredoxin je oxidovaný plastochinonem při reakci katalyzované Fdx-PQ oxidoreduktasou. Transport elektronů přes cytochrom b6f generuje elektrochemický potenciál H+ v Q cyklu. Tento gradient je pak využíván při syntéze ATP. 46 I když existence Fdx-PQ-oxidoreduktasy je zatím hypotetická, použití inhibitorů elektronového transportu u chloroplastů tento model potvrzuje. Obrázek 12.34 Použití specifických inhibitorů napomohlo ověření správnosti sekvence jednotlivých článku elektronového transportu při fotosyntéze. Tyto inhibitory bývají často používány jako herbicidy. Jedním z nejdůležitějších inhibitorů jsou látky typu Diuronu, deriváty N-alkylmočoviny, nebo herbicid atrazin. Tyto látky působí na úrovni FSII, a to tak, že inhibují přenos elektronů mezi chinony Qa a Qb. Blokují tudíž vývoj kyslíku. Energie excitovaného P680 se pak vyzařuje ve formě fluorescence, kterou lze měřit. Druhým typem inhibitorů jsou derriváty plastochinonu (DBMIB), které blokují vazbu PQ na cytochrom b6f. Z toho plyne, že DBMIB, na rozdíl od diuronu blokuje cyklický transport elektronů. Posledním typem inhibitoru ja paraquat (známý také pod názvem methylviologen), který funguje jako akceptor elektronů ve FSI, na úrovni železosirných center. Blokuje tudíž redukci ferredoxinu. Přitom se paraquat oxiduje kyslíkem za tvorby vysoce aktivního superoxidového radikálu, který poškozuje fotosyntetický aparát. Na tom je založen jeho herbicidní efekt, který se projeví pouze na světle. 47 Obrázek 12.33 Syntéza ATP: Protonmotivní síla: ∆µH+ = ∆pH + ∆ψ U chloroplastů je hlavní součástí ∆µ složka koncentrační ∆pH. ATPsyntasa: orientovana hlavou do stromatalni částí thylakoidů. Enzym je analogický mitochondriálnímu: CFo + CF1. Eznym obsahuje 9 růlzných podjednotek. Kódovány jaderným i chloroplastovým genomem. CF1 - α3β3 (6x 50 kDa) + γ,δ, ε γ-kobttroluje zřejmě tok H+ přes enzym, δ připojuje CF1 k CFo, ε je regulační jendotka, blokuje hydrolýzu ATP v temnu. γ a δ jsou kódovány jaderným genomem. CFo složena ze 4 typů podjedotek. Hlavní je podjednotka III, která zajišťuje translokaci protonů . je nejmenší (8 kDa) a je přítomna jako dodekamer. Obr. 12.35 48 Organizace PSI a PSII Chlorofyl a se nachází pouze v reakčních centrech, zatímco chlorofyl b je obsažen v anténních komplexech. Chlorofyl v membráně je asociován se specifickými proteiny, všechny jsou kódovány jaderným genomem. Jejich interakce s chlorofyly mění jejich absorpční maximum. Další pigmenry jsou karotenoidy (chlorofyl:karoteny = 0.5)Energie 400 - 500 nm je takto předávána na chlorofyly. Chlorofyly hrají roli přenašeče anergie - radiationless tranfer (nezářivý přenos enerfgie) Hlavním centrem je LHC II (Ligh harvesting center II). Je ho obsaženo zhruba 50% totálního proteiny thylkakoidové membrány. Jeho struktura: 3 transmembránové helixy, 12 mol chl a a b, 2 molekuly karotenu Obr. 12.16 (chla temně zelený, chlb světle zelený, karoten žlutý) Organizace thylakodiu. Komplexy PSI a PSII nejsou rozloženy rozvnoměrně. PSI zejména stormatové thylakoidy, PSII zejména stohované a granální thylakoidy. ATPsynthasa a ostatní komlexy nerovnoměrně. ATPsyntaha vylucne stromatálních thylakoidech. Poměr mezi FSI a FSII není rovnoěmrný.FSII/FSI je u volně žijících bakterií 0,5, u rosltin je vyšší nez 1 a závisí na složení vlnové délky světla (1,2 - 2,3). Obr. 12.19 49 Regulace LHC-II Tento komplex vylucne lokalizovaný v granálních thylakoidech. Funkce tohoto systému apočívá v regulaci přítoku fotonů. Část LHCII podstupáuje fosforylaci. Po této fosforyoaci s emění náboj a LHC s epřesouvá do méně hydrofobní stromatální oblaasti. 50 Obr. 12.20 Temná fáze fotosyntézy Většina rostlin produkuje sacharidy tzv. C3 cestou před glycerladehyd-3-fosfát. Enzymy tohoto Calvinova cyklu se nacházejí ve stroma chloroplastů. Klíčovým enzymem této reakce je Ribulosa-bisfosfát-karboxylasa oxygenasa (Rubisco). Enzym katalyzuje vazbu CO2 na substrát (ribulosa-1,5-bisfosfát) ve formě endiolového intermediátu. Rubisco rotlinného původu se skládá z osmi velkých podjednotek L (56 kDa) a osmi malých podjednotek S (14 kDa) L8S8. Katalytickou aktivitu má podjednotka L, role podjednotky S není ještě objasněna. Podjednotka L je kódována chloroplastovým a podjednotka S jaderným genomem. Některé fotosyntetické bakterie obsahují pouze podjednotku L. Obr. 12.39, 12.40 červené smal, vidět jsou jen 4. Modré a zelené – large reakce katalyzovaná Rubisco regenerace pentos Calvinův cyklus zahrnuje tři fáze: karboxylaci, redukci vzniklé kys. 3-fosfoglycerové a regeneraci ribulosabisfosfátu. Při těchto reakcích jsou spotřebovány ATP a NADPH nasyntetizované ve světelné fázi. Mnoho enzymů této dráhy je v plastidech součástí jak Calvinova cyklu, tak obráceného procesu, hexosamonofosfátové dráhy. 51 Obr. 12.38 Nejdůležitějšími regulačními faktory Calvinova cyklu jsou pH a koncentrace Mg2+ ve stromatu chloroplastů. Hořčík se váže ve formě karbamátového komplexu na lysinovou skupinu (Lys-120) v aktivním místě Rubisco a způsobí tak jeho aktivaci. Fotontetický proces vyvolává alkalizaci stromatu (přenos protonů ze stromatu do lumen). Pokles pH způsobí deionizaci NH3+- skupiny lysinu kde se naváže CO2 ve formě karbamátu a poté se vytvoří jeho komplex s Mg2+. Při transportu H+ do prostoru lumen ve světelné fázi je transport kladného náboje kompenzován transportem Mg2+ do stroma, přičemž jeho koncentrace vzroste zhruba třikrát. Obr. 12.42 Řada enzymů temné fáze fotosyntézy je regulována tvorbou disulfidových můstků. Tento mechanismu byl nalezen u NADP-glyceraldehydfosfát-oxidoreduktasy, některých enzymů regenerace pentos a dokonce i u ATP-synthasy. Tyto enzymy jsou modifikovány přes ferredoxin-thioredoxinový systém, napojený na FSI. (Obr. 12.43). Tímto způsobem, to je redukcí disulfidových můstků může světlo zvyšovat aktivitu enzymů temné fáze fotosyntézy. Enzym RUBISCO je jedinečný svou schopností katalyzovat ještě druhou enzymovou dráhu, a to oxidaci ribulosa-1,5-bisfosfátu. Produkty jsou 3-fosfoglycerladehyd a 2fosfoglykolát. Tomuto pochodu se říká fotorespirace, protože při něm dochází ke spotřebě kyslíku vyvolané světlem. Oba substráty, kyslík a oxid uhličitý si kompetují. I když katalytická konstanta karboxylace je zhruba třikrát vyšší, vzhledem k vysoké 52 koncentraci kyslíku v atmosféře je proces fotorespirace u většiny rostlin srovnatelný s karoxylací, čímž se snižuje výtěžek fotosyntézy. Obr. 12.38 Asimilace cestou C4 Některé jednoděložné rostliny jako kukuřice, cukrová třtina, i některé dvouděložné fixují oxid uhličitý cestou nikoli přes Rubisco, nýbrž za vzniku čtyřuhlíkatých sloučenin. Listy těchto rostlin mají zvláštní anatomii: obsahují dva typy buněk s chloroplasty - mesofylové buňky a buňky pochev cévních svazků. Obr. 12.45 C4 rostliny mají účinnější systém fixace CO2, zejména při vyšší teplotě a předpokládaných ztrátách vody. Při vyšších teplotách klesá totiž výrazně karboxylační aktivita Rubisco a vzrůstá oxygenační aktivita. Stejně tak při vyšších teplotách vzrůstají ztráty vody. Cesta C4 je založena na interakci mezi oběma typy buněk. Fixace CO2 probíhá v mezofylových buňkách, akceptorem je fosfoenolpyruvát (enzym PEP-karboxylasa). Vlastním susbtrátem enzymu je hydrogenuhličitan, jehož 53 koncentrace v cytosolu je vyšší, nikoli CO2. Kromě tohoto, Km pro HCO3- je mnohem nižší (?) než Km CO2 pro Rubisco. Produktem reakce je oxalacetát. Tento produkt prochází po redukci nebo transaminaci ve formě malátu nebo aspartátu z mezofylových buněk do buněk pochev cévních svaků, kde se z něj vzniká zpět CO2 (který se v Calvinově cyklu mění na glukosu) a pyruvát, který se vrací do mezofylu recykluje se. Obr. 12.46 Efektivnost tohoto mechanismu spočívá ve zvláštním složení chloroplastů buněk pochev cévních svazků, se sníženým obsahem FSII. Produktem fotosyntézy tudíž není kyslík, čímž se blokuje fotorespirace. Buňky mezofylu obsahují chloroplasty s FSI a FSII. produkce kyslíku zde nevadí, protože PEP karboxylasa není ovlivňována kyslíkem. Jednotlivé typy C4 rostlin se odlišují podle cyklujícího metabolitu mezi spolupracujícími buňkami. Může to být malát nebo aspartát. 54 Obr. 12.48 Mezofylové buňky musí obsahovat vysokou koncemtraci PEP. Tento vzniká ve zvláštní reakci katalyzované enzymem pyruvát-fosfát-dikinasou. CH3COCOOH + Pi + ATP → CH2COP-COOH + AMP + PPi reakce je posouvána doleva enzymem pyrofosfatasou. Fixace CO2 tedy vyžaduje 2 makroergické vazby. Ačkoli tato cesta je energeticky náročnější než C3 cesta, díky nepřítomnosti fotorespirace je energeticky výhodnější. Regulace enzymů Souhra mezi metabolismem probíhajícím v mezofylu a buňkách pochev cévních svazků vyžaduje dokonalou regulaci. Klíčové enzymy této dráhy, PEP-karboxylasa, pyruvát-fosfát-dikinasa a NADP-malátdehydrogenasa jsou regulovány světlem. Regulace NADP-malátdehydrogenasy probíhá cestou tvorby disulfidových můstků, přes ferredoxin-thioredoxinový systém. Zbývající dva enzymy jsou regulovány příslušnými kinasami klasickým mechanismem. PEP-karboxylasa fosforylovaná kinasou: Enzym PEP-karboxylasa-kinasa je regulován světlem. Aktivní forma stimulována světlem provádí fosforylaci serinového zbytku pomocí ATP. Temná 55 forma (defosforylovaná) je inhibována již nízkými koncentracemi malátu a má nízkou afinitu k substrátu, PEP. Fosforylovaná forma (světelná) není inhibovaná malátem. Tento mechanismus zajišťuje, aby fixace CO2 probíhala na světle přes rostoucí koncentraci malátu v buňce. Obr. 12.49 Eznym pyruvát fosfát dikinasa syntetizující fosfoenolpyruvát je regulován rovněž světel fosforylací. Mechanismus je složitější než u předchozího enzymu, světlem stimulovaná aktivní forma je však desfosforylovaná, fosforylovaná forma vznikající příslušnou kinasou je inaktivní. CAM, varianta C4 metabolismu. Tato varianta (crassulacean acid metabolimu) existuje u rostlin žijících v extrémně suchých podmínkách (např. sukulenty jako kaktusy, anebo ananasovité rostliny). metabolimus velmi připomíná typickou C4 cestu avšak procesy jsou zde odděleny nikoli lokálně, ale časově. Vysoká intenzita světelného záření je zde komplikována vysokou teplotou a tím vysokým odparem vody. Proces fixace CO2 na PEP za vniku oxalacetátu tedy probíhá pouze v noci, kdy se průduchy buněk otevřou za podmínek relativně nižší teploty a vyšší vlhkosti. Vznikající malát je ve vysokých koncentracích skladován ve vakuole. Po dobu světelné a horké periody se průduchy uzavírají, malát opouští vakuolu a je dekarboxylován. Vznikající CO2 je asimilován Calvinovým cyklem, potřebné ATP a NADPH vzniká ve fotosyntéze. Vysoké koncentrace PEP potřebné během noční periody nemohou vznikat pomocí ATP. PEP tedy vzniká cestou anaerobní glykolýzy. 56 Obr. 12.51 Klíčový enzym této dráhy, PEP-karboxylasa existuje v aktivní noční formě, a neaktivní denní formě. Regulace probíhá opět cestou kinasy, fosforylací. Na rozdíl od typického C4 metabolismu se v tomto případě nejedná zřejmě o regulaci přímo světlem, ale circardiánským rytmem. Některé rysy C3, C4 a CAM rostlin jsou pro srovnání uvedeny v následující tabulce: C3 C4 CAM Typický představitel pšenice, rýže, brambory kukuřice, cukrová třtina ananas Fotorespirace až 40% fotosyntézy nd nd Intracelulární obsah CO2 (µl/l) 200 100 10000 Efektivnost využití vody (g CO2/kg vody) 1 - 3 2 - 5 10 - 40 Max. růstová rychlost (g/m2.d) 5 - 20 40 - 50 0,2 Vysoká efektivnost fotosyntézy u C4 rostlin je zajímavá z technologického hlediska. 57 Fotorespirace Fotorespirace je světlem stimulovaná spotřeba kyslíku a výdej CO2. Již ve dvacátých letech minulého století byla zjištěna souvislost tohoto procesu s fotosyntézou. Pokud byla zvýšena koncentrace kyslíku na dvojnásobnou hodnotu obvyklé koncentrace, rychlost fixace CO2 výrazně klesala. Obráceně byl pozorován intenzivní vzrůst asimilace při poklesu koncentrace kyslíku pod hodnotu 2%. Po ukončení osvětlovací periody byl navíc pozorován pulz výdeje CO2. Byla zjištěna kompetice mezi kyslíkem a CO2 při fotosyntéze. Tento proces je intenzivní zejména u rostlin typu C3. Příčinou fotorespirace je dvojí susbtrátová specifita enzymu Rubisco. Tento enzym katalyzuje buď karboxylaci ribulosa-5-fosfátu na dvě molekuly kys. 3-fosfoglycerové anebo jeho oxygenaci, kdy vzniká jedna molekula kys. 3-fosfoglycerové a kys- fosfoglykolová. Obrázek Poměr rychlosti karboxylace vc a rychlosti oxygenace vo v závislosti na koncentraci plynů je definován vztahem vc/vo = ( Vc/Kc)(Ko/Vo) ([CO2]/[O2]) 58 kde Vc a Vo jsou limitní rychlosti, Kc a Ko Michaelisovy konstanty. Při ekvimolární koncentraci plynů je poměr vc/vo roven 100. Vzhledem k aktuální koncentraci CO2 (8 µM) a O2 (250 µM) v atmosféře je však tento poměr roven zhruba 3.2. Produkt fotorespirace, kys. fosfoglykolová je pak metabolizována ve dvou organelách: peroxisomech a mitochondriích. Cílem procesu je regenerace trojuhlíkatého metabolitu. Fosfoglykolát je defosforylován a vznikající glykolát je transportován do peroxisomů. Tam je oxidován enzymem glykolátoxidasou na glyoxylát a peroxid vodíku. Glyoxylát je transaminován na glycin. Tento je transportován do mitochondrií. Glycin je metabolizován komplikovaným mechanismem. Enzymový komplex glycin dekarboxylasa s kofaktorem kysl. folovou, lipoátem, pyridoxalfosfátem a FAD rozkládá glycin na CO2, NH3, NADH a methylentetrahydrofolát. 59 Glycin se váže na pyridoxalfosfát a po jeho dekarboxylaci se methylenaminová skupina přenese na lipoát. Po deaminaci přechází methylenová skupina na folát. Methylenová skupina je pak z methylentetrahydrofolátu přenesena na další molekulu glycinu za vzniku serinu. Reakci katalyzuje enzym serinhydroxymethyltransferasa. Serin se přenáší zpět do peroxisomu, kde se deaminuje na hydroxypyruvát a redukuje na glycerát. Tento je pak využit v chloroplastech v Calvinově cyklu. Obr. 12.48, zjednodušit Produkt fotorespirace NH3, je toxický. Amoniak je pak asimilován v chloroplastech cestou glutaminsynthetasy a glutamátsynthasy. Kofaktorem glutamátsynthasy je světel redukovaný ferredoxin (viz asimilace amoniaku). Role enzymu Rubisco a selekční tlak fotorespirace se postupně uplatňoval od počátku vývoje Země, kdy koncentrace kyslíku dosahovala minimálních hodnot. Postupně jak koncentrace kyslíku v atmosféře narůstala a klesal obsah CO2, klesal výtěžek karboxylační reakce.Za těchto podmínek se cesta C4 rostlin ukázal být málo efektivní Selektivnost reakce CO2 oproti O2 závisí velmi podstatně na teplotě. S teplotou klesá více rozpustnost CO2 než O2 ve vodě. Z tohoto důvodu je maximum efektivnosti karboxylační reakce u C3 rostlin mezi 25 - 35 °C, u C4 rostli mezi 30 - 40°C. 60 Molekulární mechanismus signalizace rostlinných buněk Po dobu svého vývoje vyvinuly rostliny dokonalý systém signalizačních drah, které umožňují reagovat rostlině na podněty fyzikálního a látkového typu. Fyzikálními podněty jsou světlo, teplota, mechanický stres, zranění, ultrafialové záření, zemská tíže, membránový potenciál, apod. Stimuly chemického typu jsou koncentrace plynů, vlhkost a koncentrace minerálních látek a dále přítomnost látek, které se k rostlině dostávají jako produkty metabolismu jejích vlastních buněk (např. hormony) nebo okolních organismů (alleopatické látky, elicitory obranných reakcí). Všechny tyto signály jsou rostlinou rozpoznány, zesíleny a modulovány a poté se projeví jako změny v koncentraci elektrolytů, enzymových aktivit anebo jako regulace exprese příslušných genů. Tyto procesy se odehrávají na dvou úrovních. Buďto s eprojeví jakožto krátkodobé efekty řádově vteřiny až minuty od aplikace signálu, anebo jako změny dlouhodobé, řádově hodiny až dny. Například regulace aktivity určitého enzymu může být těmito signály vyvolána v podobě kovalentní modifikace, jako například fosforylace (krátkodobá změna) anebo ve formě aktivace transkripce příslušného genu (dlouhodobý proces) Obr. 18.1, 18.2 Studium těchto signalizačních drah si bere jako základ analogické pochody, které jsou detailně prozkoumány na živočišných, bakteriálních či kvasničných buňkách. Ukazuje se, že v podstatě je tato signalizace velmi analogická, v detailech však často dosti odlišná. Receptory Stejně jako u živočichů, existují u rostlinných buněk dva typy receptorů, s ohledem na lokalizaci. První jsou lokalizovány na povrchu cytoplasmatické membrány, druhý typ receptorů se nachází v cytoplasmě.Tyto receptory jsou schopny reagovat na chemické signály, to je na přítomnost látek jako jsou např. hormony nebo elicitory obranných 61 reakcí. Kromě těchto receptorů jsou však buňky schopny vnímat i elektrické signály i světlo, a to pomocí tzv. iontových kanálů, schopných otevírat se nebo uzavírat v závislosti na směru a velikosti elektrického signálu. Obr. Funkce receptoru membránového, cytosolového, kanálu Obr. 8.11 Receptor je obvykle monomerní nebo oligomerní integrální protein, mající většinou tři funkční části. První z nich se nachází na vnějším povrchu cytoplasmatické membrány (nejčastěji N-terminální část) a obsahuje domény schopné selektivně interagovat s ligandem. Druhou částí receptoru jsou transmembránové hydrofobní domény. Třetí část receptoru se nachází na cytosolové části proteinu a je zodpovědná za přenos signálu na další části signalizační kaskády (nejčastěji C-terminální část). 62 Obr. 18.14 Z hlediska mechanismu přenosu signálu rozlišujeme u živočichů a prokaryotů tři základní druhy receptorů. Předpokládá se, že existují i u rostlin. První typ receptoru jsou iontové kanály ovládané ligandem. Příkladem takového receptoru je receptor na IP3 (inositoltrisfosfát) nacházející se na membráně vakuoly. Vazba IP3 vyvolá otevření vápenatého kanálu. U rostlin byl prokázán rovněž iontový kanál regulovaný cADPR, 63 Obr. 18.15 Druhý typ receptoru je receptor spojený s G-proteiny. Třetí typ receptoru je receptor s enzymovou aktivitou, nejčastěji proteinkinasovou. 64 Proteinkinasy katalyzují fosforylaci serinových/threoninových, histidinových anebo tyrosylových zbytků. Proteinkinasy tyrosinového typu jsou však u rostlin poměrně vzácné. Zvláštním druhem receptoru jsou tzv. protein kinasy receptorového typu RLK (receptor-like protein kinases). Vazba ligandu zde způsobuje dimerizaci receptoru, čímž se do blízkosti dostávají cytosolové části receptoru. Následující fosforylace pak stabilizuje aktivovaný komplex. Nejčastěji zde dochází k modifikaci serinových nebo threoninových zbytků Tento stabilizovaný komplex pak může reagovat s dalšími membránovými nebo solubilními proteiny, jako jsou G-proteiny nebo Ras. Obr. 18.11 + RLK U rostlin, obdobně jako u bakterií byl prokázán tzv. dvoukomponentní receptorový systém. První částí systému je receptorová bílkovina, nejčastěji homodimer. Po vazbě ligandu dochází k autofosforylaci v obou C-terminálních částech, nejčastěji na histidinovém zbytku. Druhou komponentou je regulační protein, který je aktivován přenosem fosfátového zbytku z receptorového histidinu na aspartát. Aktivovaný regulátorový protein pak aktivuje transkripci nebo jiné signální proteiny. Regulárotorvý protein může tvořit hybrid s receptorem . Příkladem je známý receptor na ethylen (viz.) Obrázek : dvoukompomentní a hybridní systém receptorů 18.18 Z hlediska specifity mohou být receptory přísně specifické, to znamená že reagují pouze s jedním typem ligandu, např. auxinem. Jiné receptory jsou susbtrátově široce specifické. Příkladem je receptor, interagující s oligoglukany (viz obranné reakce rostlin). Vazba ligandu je obvykle velmi pevná, s nízkou Kd a je reverzibilní. 65 G-proteiny Tyto bílkoviny vázající GTP s autokatalytickou aktivitou regulují aktivity mnoha systémů v živočišných buňkách. Aktivní forma vázající GTP se po hydrolýze GTP na GDP stává inaktivní. Rozlišujeme dva základní typy těchto bílkovin. Heterotrimerní G-proteiny se skládají z podjednotek α,β a γ. Druhý typ G-proteiny jsou tzv. malé monomerní a u živočichů zahrnují bílkoviny typu Ras, Rap, Rho a další. Existence Gproteinu u rostlin byla prokázána imunochemicky a molekulárně biologickými metodami, a to jak heterotrimerů, tak monomerů (Rho proteiny). Jejich role při buněčné regulaci však není zcela objasněna. Předpokládá se, že by mohly regulovat aktivitu fosfolipas C a fosfolipas A2. Obrázek- funkce G-proteinů 18.31 Fosfolipasy a proteinkinasy jako součásti signalizačních kaskád Fosfolipasy katalyzují hydrolýzu esterových vazeb fosoflipidu. podle místa zásahu se rozdělují na fosfolipasy A1, A2, C a D. Obrázek - fosfolipasy 18.35 Fosfolipasa C je typickým příklad regulačního enzymu. Enzym byl přečištěn a charakterizován z několika rostlin. Substrátem enzymu PI-PLC je fosfatidylinositol- 4,5-bisfosfát (PIP2). Produktem je inositol-1,4,5-trisfosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). Obě dvě látky jsou druzí poslové. IP3 difunduje do cytosolu a váže se na receptor lokalizovaný na vakuolární membráně. DAG zůstává vázán v cytoplasmatické membráně. Signální molekula IP3 je degradována fosfatasami až na myo-inositol. Tvorba a regenerace PIP2 je katalyzovaná sérií reakcí přes PI, PIP a nakonec PIP2.Inhibitorem fosfatas jsou Li+ ionty. 66 Fosfolipasy A degradují fosfolipidy na lysofosfolipidy a mastné kyseliny.Mastné kyseliny a lysofosfolipidy jsou regulátory mnoha membránových enzymů, např. HATPasy. Nejdůležitějším enzymem je fosfolipasa A2, která je pravděpodobně regulována G-proteiny. Tento enzym uvolňuje mastné kyseliny a lysofosoflipidy. Tyto látky silně stimulují aktivitu H-ATPasy. Důležitým produktem reakce tohoto enzymu je uvolňována kys. linolenová, která je prekurzorem kys. jasmonové (viz), důležitou látkou hrající roli při signalizaci rostlin. . V poslední době se poukazuje na regulační roli fosfolipasy D. tento enzym uvolňuje kys. fosfatidovou a příslušnou bázi, např. cholin. Kys. fosfatidová hraje rovněž roli druhého posla a uplatňuje s epři stárnutí rostlin a dozrávání plodů. Předpokládá se, že další její role spočívá v transportu vápenatých iontů přes membránu jakožto ionofor. Na druhé straně, kys. fosfatidová může vznikat fosforylací diacylglycerolu (vuolňovaného pomocí fosfolůipasy C) příslušnou kinasou. vixz obrázek: kombinace PLC, PLD a DAG kinasy. 67 Proteinkinasy Proteinkinasy fosforylují serinového, theroninové, tyrosinové nebo histidinové zbytky bílkovin, zejména enzymů. Účastní se pochodů jako je odpověď na hormony, ataky patogenů, reakcí na světlo, stres, zranění, apod. Podílejí se tak významnou měrou na regulaci jejich aktivity. Protienkinasa C je u živočichů regulována nejčastěji DAG a vápenatými ionty. Další varianty této protienkinasy jsou Ca2+ necitlivé. Homologické proteinkinasy C nebyly doposud u rostlin zjištěny, avšak výsledky za použití specifických inhibitorů a aktivátorů nasvědčují, že mnohé regulační dráhy u rostlin probíhají cestou proteinkinasy C. 68 Obr. 18.34 Co se týče mechanismu propojení s receptorem, byly u rostlin nalezeny proteinkinasy několika skupin. První z nich jsou tzv. RLK (receptor-like kinases). Tyto přenášejí signál přímo od ligandu přes membránu. Interakce s ligandem vyvolá tvorbu homodimeru spojenou s fosforylací cytosolové domény receptoru (viz receptory). Vazebné místo některý RLK obsahuje doménu LRR (leucin rich repeat), která je zřejmě zodpovědná za protein-proteinovou interakci. Druhou skupinou jsou Ca2+/kalmodulin dependentní proteinkinasy. Tyto proteinkinasy, na rozdíl ode všech ostatních obsahují na C-terminální části část vázající specificky vápník, což je sekvence homologní kalmodulinu. Tyto kalcium dependentní proteinikinasy (CDPK) bývají často vázány na cytoplasmatickou membránu. Jedna z těchto proteinkinas (CpCK1) obsahuje na N-konci myristoylační část, která připojuje enzym reverzibilně k membráně. Vápenaté ionty mění konformaci enzymu, způsobují myristoylaci a aktivují enzym. Obr. 18 62 - Proteinkinasa clamodulinmoveho typu Významnou součástí signalizační kaskád jsou tzv. mitogen-activated protein kinases, MAP-kinasy (MAPK). Tyto kinasy jsou zodpovědné za aktivaci transkripčních faktorů, a to prostřednictvím dalších MAP- kinas (MAPKK). U živočichů jsou tyto enzymy aktivovány malými GTP-vazebnými proteiny (Ras, Rap, Rho,atd.). Obr. 18.63, zjednodušený MAP-kinasy se účastní přenosu mechanických signálů jako je dotek, zranění, vítr, ale také přenášejí signály vedoucí k aktivaci transkripčních faktorů po interakci s růstovými faktory (gibbereliny, auxin, ethylen, houbové elicitory, apod.). Aktivace transkripčních faktorů znamená jejich fosforylaci, protože řada těchto bílkovin je schopna vázat se na DNA teprve po své fosforylaci. Proteinfosfatasy tvoří komplementární enzymy k činnosti proteinkinas. provádějí hydrolýzu fosfátových skupin vázaných esterovou vazbou na cílovém enzymu. 69 Analogicky s živočišnými buňkami byly u rostlin identifikovány dvě skupiny fosfatas: 1 a 2A. Tyto enzymy jsou blokovány několika antibiotiky, jako je calyculin, kys. okadaová a microcystin. Tímto způsobem byla npř. prokázáno, že hormon kys. abscisová aktivuje signalizační dráhu zahrnující proteinfosfatasu. ROSTLINNE HORMONY Hormony jsou látky, které jsou syntetizovány živými organismy, jsou distribuovány do jiných částí za účelem regulace metabolismu. Původní, nejdéle známá skupina rostlinných hormonů zahrnovala auxiny gibbereliny, cytokininy, kys. abscisovou a ethylen. V poslední době k nim přibyly další látky, jsou polyaminy a brassinosteroidy, jejichž role je rovněž hormonální. Fyziologické účinky některých hormonů jsou známy víc jak sto let. Postupně byla odhalována jejich struktura, cesty jejich syntézy a degradace. Molekulární mechanismus jejichž účinku , receptory a signalizační dráhy, které jsou jimi aktivovány však doposud nebyly zcela objasněny. Podobně jako živočišné hormony mají rostlinné hormony obdobný způsob interakce s buňkou. Receptory se nacházejí buď na povrchu cytoplasmatické membrány (v tom případě se jedná o odpověď rychlou) anebo v cytoplasmě. Některé receptory se nacházejí na membránách organel, jiné v cytosolu. Vazba hormonu na receptor má za následek aktivaci transkripce genů. 70 Většina hormonů má však zřejmě receptory obojího typu. navíc se velmi často jedná synergické působení více hormonů, kdy platí že, že efekty první a druhého hormonu izolovaně jsou zcela odlišné od účinku obou hormonů dohromady (například auxin a cytokinin). Obr. 17.1 Gibbereliny Gibbereliny byly poprvé izolovány v roce 1926 jako metabolity houby Gibberela fujikuroi. jejich účinky jsou popsány v učebnicích rostlinné fyziologie. Gibbereliny (GA) jsou tetracyklické diterpenoidy. V současnosti jich existuje zhruba kolem 125. Dvanáct z nich lze nalézt ve výše uvedené houbě, 100 derivátů je syntetizováno samotnými rostlinami. Obsahují buď 20 nebo 19 uhlíkových atomů (C19 nebo C20). Druhá skupina nese navíc γ-laktonový kruh. Gibereliny jsou klasifikovány číselně GA1-125. 71 Obr. 17.3. Většina rostlin syntetizuje minimálně 10 derivátů. Fyziologické účinky gibberelinů jsou velmi pestré. Klasickým fyziologickým efektem gibberelinů je prodlužování stonku trpasličích mutantů, potlačení chladové nebo světelné periody pro vývoj květů, zpomaluje stárnutí listů a plodů. Výrazným efektem na úrovni genové exprese je stimulace exprese α.amylasy v klíčícím zrnu. Syntéza gibberelinů probíhá izoprenoidní cestou přes geranylgeranyldifosfát. Produktem cyklizace geranylgeranyldifosfátju je ent-kauren. Obr 17.9 a 17.10 Enzymy této cyklizace jsou přítomny v plastidech. Další syntéza pokračuje oxidací na GA12 aldehyd a je katalyzována cytochromem P450 na endoplasmatickém retikulu. Obr. 17.12 Další cesta syntézy pokračuje přes GA12 přes postupné hydroxylace na a dekarboxylací, kdy vznikají C19-GA. Zjednodušit obr. 17.13 ?? Deaktivace gibberelinů může probíhat například další hydroxylací, oxidací nebo glykosidací. Signální dráha gibberelinů zahrnuje aktivaci tanskripčních faktorů. Obr. 18.68 Modifik. obr. 17.16 ?? Doplnit?? 72 Kyselina abscisová Kys. abscisová byla objevena již v roce 1950 jako látka inhibující prodlužování koleoptilu ovsa. Postupně byla struktura této látky ztotožněna s dalšími aktivními látkami urychlujícími opadávání listů a faktor nabuzující dormanci. V roce 1965 byla určena struktura této látky, nazvané kys. abscisová. Jedná se o chirální látku a pouze jeden její enantiomer je aktivní (S-enantiomer, 2 cis, 4 trans). Později se zjistilo, že látkou, která vyvolává opadávaní listů není kys. abscisová, ale spíše ethylen. Obr. 17.21 ABa je důležitou látkou, která hraje roli při adaptaci rostliny na stres. Její role je regulace dozrávání semen (zejména blokování viviparie) a zejména regulace otevírání průduchů. 17.23 Tento hormon má poměrně jednoduchou strukturu, jeho syntéza však byla dlouhou dobu předmětem spekulací. Podle nejnovějších poznatků je hlavní cestou syntézy štěpení karotenoidů. Hlavní produkt syntéza karotenoidů, β-karoten oxidován a hydroxylován na all-trans-volaxanthin a tento je izomerován na 9-cis-violaxanthin. Dvojná vazba v poloze 11 je štěpena kyslíkem, produktem je xanthoxin. Tento je postupně hydroxylován a oxidován až na kys. abscisovou. Syntéza ABA na úrovni transkripce se zvyšuje, pokud se rostlina nachází ve stresu (např. teplotním nebo solném). 73 Nejpravděpodobnější cesta degradace je oxidace na kys. 8´-hydroxy-ABA, kys. phaseovou, dihydrophaseovou a konjugace na glykosid. Některé pathogenní houby (Cercospora) jsou schopny syntetizovat velké množství ABA a tím likvidovat rostlinu. Obr. syntéza kys. abscisové 17.24 Kys. abscisová se váže na specifické receptory. Tyto receptory se nacházejí uvnitř buňky a také na cytoplasmatické membráně. Receptory na cytoplasmatické membráně jsou pravděpodobně vápenaté kanály. Vápenaté ionty pronikající dovnitř buňky aktivují protein ABI1. Tento protein má vysoce homologní sekvenci se Ser/Thr proteinfosfatasami. Protein ABI1 katalyzuje odštěpení fosfátu z regulačního proteinu. Jeho modifikací se aktivuje genová exprese. 74 Obr. 18.27 Působení kys. abscisové na regulaci otevírání průduchů předpokládá aktivaci Gproteinů. Působení ABA na buňky zvyšuje pH cytosolu. Je pravděpodobné, že mobilizace vápníku indukovaná ABA aktivuje tvorbu c-ADPR, který indukuje výtok vápenatých iontů z vakuol. Vysoká koncentrace vápníku aktivuje draselné kanály. Výtok draslíku má za následek ztrátu turgoru a uzavření průduchů. Dále schéma?? viz přednáška? Cytokininy Cytokininy jsou N-deriváty adeninu. Jejich účinek byl poprvé popsán v roce 1950, kdy bylo zjištěno, že kokosové mléku stimuluje dělení buněk. Podobný efekt vykazoval produkt autoklávování DNA, který jak se později ukázalo, obsahoval artefakt, l N6-furfuryladenin. První přirozený cytokinin, zeatin, byl izolován v roce 1963 z kukuřičných semen. Cytokininy obsahují adenin substituovaný v poloze N6 např. izopentenylovým řetězcem. . Syntetický derivát, N6-benzyladenin (nebo benzylaminopurin - BAP) má stejné účinky. Fyziologické účinky těchto látek jsou velmi pestré. Indukují otevírání průduchů, potlačují apikální dominanci vyvolanou auxiny, inhibují stárnutí listu. Ve spojení s auxiny indukují buněčné dělení a diferenciaci. Ekvimolární koncentrace auxinu a cytokininu stimulují proliferaci nediferencovaných kalusů. Obr. 17.30 A - artefakt, B-přirozený, C umělý Cytokininy jsou syntetizovány z AMP a dimethyalallyldifosfátu. N6-izopentenylAMP je hydroxylován, poté je odštěpen fosfát a ribosa. Schéma zjednodušené 17.32a 75 Některé patogenní bakterie jsou schopny syntetizovat cytokininy (Např. Agorbakterium tumefaciens). Geny pro syntézu hormonu jsou lokalizovány na plasmidu, který se integruje do genomu rostliny. Nadprodukce hormonu vyvolá tvorbu nádoru. Některé tRNA rostlin, živočichů a mikroorganismů obsahují báze, které byly modifikovány za vzniku cytokininů, např. N6-isopentenyladenosin nebo jeho zeatinový analog. Množství těchto modifikovaných tRNA obsahujících cytokininovou strukturu je zřejmě mnohem nižší než cytokininů syntetizovaných de novo. Pro biologickou aktivitu cytokininů je esenciální přítomnost bočního řetězce. Tento řetězec je odštěpován cytokininoxidasou, která zřejmě hraje významnou roli při regulaci. Produktem oxidace izopentenyladeninu je adenin a 3-methyl-butenal. Obr. 17.39a Další cestou regulace aktivity cytokininů je jejich O-glykosidace. Vzniklé O-βglykosidy jsou sice biologicky inaktivní, mohou se však snadno hydrolyzovat glykosidasami na aktivní hormon. Druhou skupinou konjugátů jsou 3-, 7-, nebo 9 Nβ-glykosidy, které jsou zřejmě ireverzibilní cestou jejich deaktivace. 76 Obr. 17.40 a,b Cytokininy se vážou na receptory, jejichž účast při signalizaci není ještě objasněna. Jedním z nich je zřejmě protein CKI1, o sekvenční homologii blízké hybridním dvoukomponentním kinasam. Auxiny Auxin byl jedním z prvních objevených rostlinných hormonů. jeho účinky, fototropismus a geotropismus byly studovány již v 19. století Darwinem. Struktura auxinu, jako kys. indolyl-3-octové byla získána v roce 1926. Postupně byly objeveny další deriváty mající auxinový efekt, některé z nich zcela syntetické. Typické fyziologické účinky auxinu jsou apikální dominance, tropismy, prodlužování buněk. Syntetické auxiny jsou ve vyšších koncentracích používány jako účinné herbicidy. Obr. Syntetické a přirozené deriváty auxinu Prekurzorem syntézy auxinu de novo je L-tryptofan. Místem syntézy je apikální meristém a mladé listy, odkud se transportuje směrem ke kořenům. Kys. indolyl-3- 77 octová může vznikat z tryptofanu dvěma cestami. První zahrnuje transaminaci na indolyl-3-pyruvát, dekarboxylaci na aldehyd a poté oxidaci na kyselinu. Druhá cesta dekarboxylací přes tryptamin je méně pravděpodobná. Existují však i méně časté cesty syntézy, např. u brukvovitých rostlin, přes acetonitril. U některých rostlin byl nalezen další auxin, kys. indol-5-máselná, která vzniká z kys. indol-3.octové připojením acetátu. Degradační cesty auxinu jsou poměrně pestré. Mohou probíhat dekarboxylací a následnou oxidací peroxidasou, na aromatickém jádře nebo bočním řetězci. Obr. Modifikované schéma 17.45 Část auxinu je metabolizována konjugací a je možné, že tyto deriváty jsou skladovány ve vakuole a použity pro zpětnou syntézu auxinu. Na níže uvedeném obrázku je zachycen derivát auxinu a kys. asparagové (ireverzivbilní cesta konjugace) a βglykosid auxinu (reverzibilní cesta). 78 17.46b Některé bakterie jsou schopny syntetizovat auxin, stejně jako cytokininy (A. tumefaciens). Geny pro syntézu se nacházejí v plasmidu, který se integruje do genomu rostliny. Je zajímavé, že syntéza auxinu může být ovlivňována jinými rostlinnými hormony. Například gibbereliny mohou výrazně zvyšovat obsah auxinu , naopak cytokininy obsah auxinu snižují. mechanismus této regulace není znám. Účinek auxinu na celou rostlinu je velmi komplexní. Molekulární mechanismus účinku v buňce je předmětem intenzivního studia. Fototropismus je zprostředkován flavoproteinem zvaným fototropin.Nejúčinnější část světelného spektra je v oblasti flavoproteinů. Auxin je tranpsortován z růstového vrcholu do zastíněné části stonku, kde způsobuje prodlužování. Rovněž gravitropismus. Auxin je transportován z růstového vrcholu na spodní stranu kořene, kde inhibuje růst. Polárníá transport: trensoirt dovnitř vkivem pH gradientu (alkalicky cytosol), dale asymtericka distribuce přenašeče (přernšeč se přenáší z Golgiho aparátu). Molekulární mechanismus účinku je dvojí. Krátkodobý efekt auxinu způsobuje změny v transportu iontů (okyselování apoplastu). Turgor buňky působící na změkčenou buněčnou stěnu způsobuje prodlužování buněk. Tyto změny jsou iniciovány vazbou auxinu na receptor, pravděpodobně transmembránový protein ABP1 (auxin binding protein). Vazba auxinu způsobuje konformační změny v C-terminální oblasti proteinu. Signální dráha zahrnuje pravděpodobně fosfolipasu A2. Uvolněné lipidy pravděpodobně aktivují H+-ATPasu cestou fosforylace. Zvýšená kyselost apoplastu může způsobit prodlužování buněčné stěny . Dlouhodobý účinek auxinu je způsoben změnami v transkripci genů. Auxin se dostává do buňky cestou aktivního transportu přes cytoplasmatickou membránu. Váže na specifický protein ARF1 (auxin response factor). Tato bílkovina je transkripčním faktorem. Váže se v jádře na sekvenci TGTCTC. Tato sekvence je součástí promotorů genů, které reagují na auxin. Ethylen Fyziologické účinky ethylenu byly pozorovány již koncem 19. století, kdy se zjistilo, že plyn používaný ke svícení ovlivňuje výrazným způsobem růst klíčících etiolovaným semen hrachu. Pomocí sérií klasických chemických reakcí se podařilo prokázat, že plynnou složkou zodpovědnou za tyto efekty je ethylen. Teprve kolem roku 1930 se podařilo prokázat, že ethylen je syntetizován samotnou rostlinou. Studium jeho syntézy a role jakožto rostlinného hormonu byla omezena metodami jeho stanovení, což je dnes plynová chromatografie, Jakožto hormon ovlivňuje klíčení semen, růst stonků a kořenů, stimuluje opadávání listů a zrání plodů. Účastní se rovněž obranných reakcí proti patogenům. Cesta jeho syntézy byla velmi intenzivně studována. Hlavním prekurzorem je Sadenosylmethionin (aktivní methionin - SAM), která je v běžném metabolismu donorem methylové skupiny. V případě syntézy ethylenu však vzniká 1aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina (ACC) a 5´-methylthioadenosin. Cyklický derivát se pak oxiduje za vnaiku ethylenu, CO2, a kyanovodíku. 5´methylthioadenosin se pak regeneruje na methionin. Klíčovým enzymem syntézy ethylenu je ACC synthasa. Kofaktorem enzymu je pyridoxalfosfát. Je tedy citlivý na příslušné inhibitory, jako je kyselina aminoxyoctová. Druhý enzym, ACC oxidasa využívá jako koenzymu kys. askorbovou. 79 Obrázek 17.54 Syntéza ethylenu je regulována hladinou ostatních hormonů, zejména auxinu. Auxin zvyšuje hladinu ACC synthasy v buňce a transkripci některých izoforem mRNA. Při napadení rostliny patogenem se hladina ethylenu rovněž přechodně zvyšuje. Ethylen se váže na specifický receptor, který byl jako jeden z prvních rostlinných receptorů klonován. Jedná s eo protein ETR1 (79 kDa), jehož C-terminální část je homologní s dvoukomponentní kinasou. ETR1, jakožto jeden z těchto receptorů, existuje v membráně jako dimer. Po vazbě ethylenu dochází k dimerizaci obou monomerů, autofosforylaci a přenosu fosfátu na aspartátový zbytek. Exiostuje velmi těsná korelace mezi syntézou ACC synthasy a a hladinou celulasy, která by s emohla podílet na dozrávání plodů a opadávání listů. Brassinosteroidy Steroidní struktura, hormony byly poprvé izolovány z pylu řepky (Brassica), dále z kaštanu. Dva typy brassinolid, castasteron. Obr. 17 57 80 Vyskytují se v řasách lišejnících nahosemenné rostliny, krytosemenné rostliny. C27, C28, C29, celkem izolováno asi 40. Fyziologické účinky: růst stonků, inhibice růstu kořenů, aktivace protonové pumpy, reorientace celulosových mikrofibril, růst pylových zrn, syntéza ethylenu. Syntéza brassinolidů: zdroje je campesterol - hydroxylace Obr. 17.62a, zjednodušené schéma přes castasteron jako příklad Cesta deaktivace: obr. 17.65 mechanismus funkce – receptor, odlišný od sterodiního receptoru živoičichů brassinost., receptor rosltin zřejme RLK napojenou na MAPK Polyaminy Existence v rostlinách zjištěna již dávno, jejich hormonální role objevena nedávno. Role: buněčné dělení, syntéza DNA, RNA a proteinů. Koncentrace v buňkách poměrně vysoká asociovány s kyselými složkami, DNA, RNA, fosfolipidy a kyselými proteiny buněčné dělení, tvorba, hlíz, tvorba kořenů, embryogeneze, rozvoj květů, zrání plodů putrescinmn, spermidin a spermin schéma syntézy: 17.68 81 pozoruhodná role donoru propylaminu: S-adenosylmethioninu a dekarboxylasy cesty ,katabolismu: diaminoxidasa - substráty putrescin, kadaverin (méně sprmidin a spermin), tvorba aminoaldehydů ppolyaminoxidasa - substráty spermidin a spermin obr, 17.70 82 Kyselina jasmonová Strukturně podobná prostaglandinům, včetně cesty její syntézy. Původně byla objevena jako látka inhibující růst (1971), teprv epozději byla zjištěna role při obraně rostlin. Oba typy látek se syntetizují z mastných kyselin.. V roce 1980 byl jasmonát a methyljasmonát objeveny jako látky zpomalující růst a urychlující stárnutí. Existuje mnoho derivátů, stereoisomery. Obr. 17.72, deriváty jasmonátu Přirozenými a nejčastějšími deriváty jsou (-)-JA a (-)-methyljasmonát,. Methylester je těkavý. Fyziologické efekty: inghinbice růstu rýže, pšenice, zpomalení růlstu kořenů, urychlování zrání plodů, roel při torbě květů a plodů.. Hormadí se při zranění rostliny, při kontaktu s elicitory (oligosacharidy) a systeminem. Moduluje expresi četných genů. Aktivuje syntézu fytoalexinů. Syntéza kys. jasmonové: zdrojem kysl. linolenová Obr. 17.73 Klíčové enzymy: lipoxygenasa, allen oxid synthasa a cyklasa. Allenoxid synthasa je klíčový enzym, obsahuje P450, nevyžaduje však kyslík, ani NADPH. Transkripce enzymu je indukována zraněním. Degradace, hydroxylací a glukosidací. Mechanismus – kys. Jasmonová se indukuje při zrenění rostliny neboi po napadení herbivorním hmyzem 83 Salicylát Salicylát je přítomen konstitučně v mnoha rostlinách. Je znám efekt zpomaluje stárnutí květů, prodlužuje kvetení (přídavek do vázy s květinami). Podobnou roli hraje methylester, který je těkavý. Známá je role při termogenezi v květu aronovitých roslin (aktivace CN necitlivé repirace). Látka vyvolávající termogenezi byla identifikována v roce 1987 jako salicylát. 0.12 µg/g. SA hraje významnou roli při obraně rostlin indukci PR proteinů. Přídavek SA vyvolává indukci PR proteinů (β-1,3 glukanasy, chitinasy). Je SA 84 látkou, která způsobuje systémovou rezitenci, přenos signálu? Toto se neprokázalo, signál který se šíří teprve vyvolá syntézu SA v místě obrany. Syntéza SA: přes PAL, cinnamoylKOA, odbourání β-oxidací na benzoát., hydroxylací na salicylát, dále konjugace na glykosid. Obr. 17.82 85 SEKUNDÁRNÍ METABOLITY Terpenoidy Alkaloidy Fenylproanoidy Flavonoidy Ligniny Neúčastní se přímo růstu a vývoje, metabolismu. Jejich role – při ekologické interakci, alleopatie. Obranná funkce proti patogenům. Syntetizovány buď konstitučně nebo indukovány. Allelopatie: Věda, kteráí struduje oricesy zahrnující sekundární metabolity produkované roslktinami, řasami, bakteriemi, houbami, které ovlivňují růst a vývoj zemědělských a biologických systémů Obsah sekundárních metabolitů v rosltině je součtem syntézyt aodbourávání. Zásicí na růstopvé periodě, části rosltiny, denním období, světle, apopd. Tyto látkse de okolí šíří: těkaním (terpenoidy). Lohováním a smývánm z listů (ve vodě rozpustné lítku, déšť rosa), louhováním z kořenů a semen do půdy, při rozklady zbytku rosltin. Efekty: potklační růstu, klíčení (dlouhodobé efekty – až 3 roky). Pěstování monokultur – zvyšování obsaju látek. Terpenoidy Základní jednotka izopren (C5). Velmi pestrá skupina, stejná dráha jako syntéza četných hormonů, steroidů, karotenů, apod. Monoterpeny –C10 – vonné a těkavé látky rosltin Seskviterpeny – C15 – fytoalexiny, ak. absicová Diterpeny C20, např. fytol, gibbereliny, atd. Základní syntetická dráha : přes HMG-CoA – k mevalonátu k isopenteyl DiP Obr. 24.4. Syntéza buď v ER nebo v plastidech. Další syntéza přikládáním IPP Obr. 24.7. Enzymem je prenyltransferasa – karbokationický indtermediát Obr. 24.8. pouze 1. část 86 Syntéza monoterpenů – z geranyldifosfátu Obr. 24.9. 87 Další příklady monoterpenů – Obr. 24.10. 88 Seskciterpeny – syntezovány z farnesyldiP Obr. 24.13 capsidiol – fytoalexin, gossypol – obranná látka bavlníku, 89 ALKALOIDY Alkaloidy –obsahují převázžen bazický heterocyklický dusík (alakoidy prave), pseudoalkaloidy nebosahují heterocyklický dusík. Původně rostlinného původu (monou být i živočišné) Alkaloidy se tovří v zelených čásseych tosltiny. Transpoortují se do celé rostliny, Nevyšší obsah alkaloidů bývá v semenech. Tyto látky mohou být metabolizovány a použity jako zdroj dusíku. Majá převevší, allelopatickou funci. Inhibice růstu a klčení inhibice bakterií, jedovaté látky pro býložravcům. příklady koniin- bolehlav - paralýza motoriciých nervů obr. 24.19 Tropanové alkaloidy Atropin - Hyoscyamus, Atropa belladona - anticholinergní alkaloid Obr. 24.20 Isochinolinové alkaloidy )Kodein, morfin, heroin Obr. 24.21, 24.23 90 Indolové alkaloidy Pyridinivé a piperidinové alkaloidy Nikotin 24,25 Kokain 24.24 - tropanový alkaloid Kofein 24.26 91 Steroidní alkaloidy .27 Senecionin 24.28 Použití sekundárních metabolitů v medicíně - tabulka 24.1. Syntetizovány jako kosntitutivní obrana, avšak lze je indukovat elicitory Např. nikotin je kosntitutivní, po zranění vzniká N-acetylnikotin (tento je toxický pro členovce, zatímco vlasntí nikotin ne). Syntézy: Tryptaminová cesta 24.33, avšak pouze syntéza streictosidinu (secologanin je terpen) 92 dále obr. 24.34 Tyraminová cesta - obr. 24.37, pouze do stadia reticulinu dále 24.38 93 Fenoláty Nejrozsáhlejší skupina, skoro 40% biomasy (viz lignin). - vznikají fenylpropanoidním metabolismem (lignin, lignany, taniny, flavonoidy, kumariny, stilbeny…) 94 Záklandí cesta je PAL Obr. 24.49 pouze levá část Další reakce: aromatické hydroxylace, O-methylace, CoA ligace a NADPH redukce 1. aromatické hydroxylace: cinnamoylhydroxylasa, P450, mikrosomální enzym 2. O- methylace , kofaktor S-adenosylMet 3. vazba CoA, dále reukce kysleiny na ldehyd a Lakohol - NADPH Lignany - dimery phenylpropanu, dimarizace 8-8´, můřže být i dimarizace 8-6´i jiné pinoresinol vzniká dimarizaci koniferylalkoholu 24.55 95 taniny - hydrolyzovatelné: kopolymer cukrů , kysů gallové a kys. elagové, obranná reakce, vyvkytují s eu některých dvouděložných obr. 24.47 nehydrolyzoivatelné taniny kondenzované taniny - vyskytují s eu všech rosltin, strukturou proanthokyanidiny, polymery až 50 flavonoidů Lékařství, čaj, víno. Tvoří černé sloučeniny s Fe - inkoust 96 Flavonoidy Barevná součást květů, signalizační látky, Obr. 24.66 Apigenin, luetolin. sibgnalizační látky při interakci s Rhizobii (obr. 24.69 obranná látka- medikarpin 97 Chalkonsaytnthasa, kondenzace 3 acetylKoA + kumarylKoA viz starý výklad Kumariny - většinou role ochrany proti UV, inhibitory klíčení viz obr. 24.73 psolaren – furokumariny 98 interkalace do DNA, reakce s pyrimidinem, aktivace UV světelem. Někteříá motýli detoxikují furokumariny syntéza - obr. 24.75, pouze první část stilbeny a pyrony - tvoří součást pasivní a aktivní ochrany rosltin, antibakteriální a fungicidní vlastnosti, ochrana proti požírání resveratrol- protirakovinná látka ve víně Flavonoidní vůně - viz box 24.6 99 Využií sekundárních metabolitů Pyrethrum Produkce Tanacetum cinerariaefolium, chrysantéma. Čínský prášek. Složení: 6 esterů pyrethriny. Rozkládá se snadno v prostředí. Není karcinogenní, neškodí živočichům. Vyrábí se 100 tis. tun ročně Účeink, blokování Na\kanálu hmyzu. 100 Taxol Boj proti rakovině. Taxol 1960. Výsledek screeningu. Objevena látka v kůře tisu. Původně se myslelo, že taxol destabilizuje mikrotubuly. Zjištěno, že naopak indukuje přeměnu tubulinu na mokrotubuly. Problémm byla nutnost velkého množsrví materiálu. Strom pomalu roste. Objevena látka baccatin, izolována z jehličí Taxus bnaccata. Z ní syntetizován taxol. Relativně nejedovatý. Klinickyu zkoušen proti některým druhům rakoviny. (vaječníky) 101 Castanospermin – látka pro HIV Izolován z australského ořechu Castanospermum australe. Inhibuje tvorbu proteinu gp120. Virové částice jsou neschopné se vázat na CD4 receptor, Artemisin ABSTRACT: Jedna z největších metel lidstva. Mechansmus malárie....Díky rezistenci jsou látkyt chininového typu účinné – rezistence Velmo účinný se zdá artemisin, Artimisia annua (pelyněk), tradiční lék v Číně. . 102 Although the Syntetizováno mnoho derivátů. Původní látka je velmo špatně rospustná ve vodě. (Artesunate, dihydroxyartemisinin, artemether, arteether, artelinic acid jsou rozpustné) Výhody: artemisin a jeho deriváty jsou velmi málo toxické. Účinek: Parazit – Plasmodium rozkládá hemoglobin, uvolňuje volný hem. Železo redukuje peroxid artemisinu, produkce peroxidových radikílů. INTERAKCE ROSLTIN S PATOGENY Patogeny: houby, bakterie, viry, členovci Obrana rosltin: konstitutivní (kutikula, přítomnost sekundárních metabolitů). Tyto látky toxické povahy jsou přítomny často ev vakuole a uvloňují s epo ataku. příkladysekundární metabolity. Příklad 103 avenacin - k ořenech ovsa. Velmi účinnýc proti některým parazitům houbám. Daůší houby jsou schopny detoxivoat avenacin štěpoení vazeb 1-2 a 1-4 glukosy. glukosinoláty (stávají s eaktivní teprve po myrosinase, po ataku): obr. 21.17 Obrana indukovaná přítomnosti patogenu způsoby infekce: nejčastěji kořeny nebo listy Pronikání: stomata, enzymy (hydsorlýza kutikuly, celulosy, buněčné stěny), zranění nekrotrofie: patogeny zabíjí hostitele a využívá odumřelou hmotu, obvykle široká specifita pohyb virů: přes plasmodesmata a floemem (nejsou enzymy) biotrofie: hostitel zůstává naživu. obvykle velmi úzká specifita hostitele hemibiotrofie: hostitel naživu, ale je zabíjen později (Phytophthora infestans patogen - obecný termín, virulentní: patogen způsobující nemoc použitá strategie patogenu: enzymy hydorlyzující buněčnou stěnu, toxiny Výsledky interakce patogne-rosltina: 104 1. po interakci neposkytuje rosltina vhodné podmínky - nehostitelská - nekompatibilní interakce 2. rosltina má vytvořenou bariéru /kutikula, metabolity), ubrání se rezistence nehostitelská, interkace nekompoatibilní 2, patogen napadne rosltinu, ta jej rozpozná, startuje obrannou reakci, invaze je pouze lokální, inkompatibilita 4. Roztlina nerozpozná patogen ,je hpostitelská, infekce, komaptibilní interakce (zvláští forma je symbiosa) Hypersenzitivní reakce a programovaná buněčná smrt: Rozpoznání patogenu má za následek aktivaci obranných mechanismů. Proces omezen na buňky v okolí ataku: látky vyvolávající obrannou reakci: elicitory (exogenní a endogenní - pocházející z rosltiny). Následkem je smrk buněk v okolí ataku, brání se dalšímu šíření patogenu. Geny avirulence a geny rezistence Vysvětlují porč některé kultivary roisltiny jsou odolné vůči ataku (genetický důvod). Model gen vs. gen Obrana se aktivuje, jestliže rosltina vlastní gen reiztence R, který je komplementární ke genu avirulence patogenu (Avr). Modle paltí pro biotrofní patogeny. Gen resistence je obvykle receptor. Porduktem genu avirulace je buď látka (bílkovina, nzíkomolekulární látka, oligosacharid). Viz Obr. 21.18 Jiný model zahrnuje interakci toxin (patogen) a detoxikující enzym (rosltina) 105 Obr. 21.21 PříkladyBakterie Psedomonas. Porudktem genu avirulence avrD bakterie je syringolid, který vyvolává rezietnci u soji, nesoucí gen rezietnce Rpg4. Geny avirulance u hub. příklad PHytophthora, gen avirulance - gen sysntetizující elicitiny, v případě genu reizstence R u tabáku (receptor). Identifikace genů rezistence R Většinou molekulárně biologické metody. Metoda spočívá v identifikaci sekvence genů při porovnání rezistentních a nerezistentních kultivarů rostlin a poté v identifikaci této sekvence vložením pohyblkivého úseku - transposonu, který vede ke zničení tohoto genu. Bylo idnetifikováno jen málo těchto R genů. Tyto geny byly klonovány. Ukázalo se, že tyto geny mají zčasto sloečné motivy, podobsjí s evelice receptorům u živočichů: LRR - leucin rich repeat, NBD - nucleotide binding site, TIR (Toll-interlekin1 resistence domain LRR - opakující se sekvence xxLxLxx, kdy xx jsou AK vystavené do slovnetu a určující variabilitu a specifitu interakcí NBS - obvykle váže ATP nebo GTP, ale nemá kinasovou aktivitu TIR - struktiurní a funkční podobnost proteinu Toll z Drosophily, vyskutyju se u savců jakožto homolog Toll proteinu, dále podobnost receptoru na interleukin 1. Další recepeotry rosltin obsahují proteinkinasy anebo jsou to receptory spojené s Gproteiny. Receptory mohou být buď cytoplasmatické nebo transmembránové Obr. 21.26 106 Rceptor má dvě hlavní funkce: rozpoznání produkru avr genu a dále vytvoření a přenos signálu. Mechanismus vzniku rezitenmce nebo naopak kompatibility Mutací avr genů, která je mnohem častější než mutace R genů u rosltin. Geny R mohou existovat v několika allelách. Většina R genů v rosltinách je součáastí multigenní rodiny a existují v rosltině ve skupině homologních genů (např. gen Cf-9 na rajčeti - 5 homologních gneů). Tyto geny jsou sdruženy do klasterů. Jinou možností je existence pouze jediného genu, avšak uvnitř jednoho rosltinného druhu existuje ve formě mnoha allel. Některé geny R existují pouze v minimální diverzitě allel. Obr. 21.32 Nové varianty mohou vzmnikat bodovou muatcí (např v oblasti LRR) nebo typicky genetikým postupem, Obr. 21.33 Mechanismus obranné reakce: Po kontaktu elicitoru s receptorem (patogenu v buňkou) pozorujeme Rychlá odpověď: syntéza AOS, otevření iontových kanálů, depolarizace memvrány, syntéza NO, aktivace proteinkinas, hypersenzitivní reakce syntéza fytioalexinů, modifikace sekundárního a primárního metabolismu, syntéza PR-proteinů, 107 akumulace signálních melekul (kys. salicylovám ethylen, k. jasmonová), zesílení buněčné stěny (kalosa, lignin, HPRP) systémová rezistence Hyperznsitivní reakce vnziká tek, že se bud aktivuje apotptoza anebo jsou buňky likvodovány aktivními formami kyslíku, ukazuje se, že hraje roli i syntéza NO. Je možná i likvidace buněk toxickými produkty patogenu. HR není vždy nuntým průvodním jevem interakce nebo vzniku rezistence. Syntéza aktivních forme kyslíku. Superoxidový radikál a H2O2. TYto látky vznikají aktivací NADPOH oxidasy. NADPH + 2O2 → NADP + H+ + 2O2Superoxidový raidkál se dále rozkládá uperoxiddismutasou na H2O2 2 O2- + 2H+ → H2O2 + O2 Tento enzym je velmi podobný (nikoli však totožný - s analogickým enzymem neutrofilů, imunologicky podobný). Na rozdíl od tohoto enzymu je to monomer. (Arabidopsis). 6 transmembránových domén, FAD a NADP vazebné místo. V cytosolu je EF doména vázající vápník (aktivace enzymu, u savců chybí)). TRojúhelníky označují lokalizaci dovu hemů. U neutrofilů aktivace kumlací několika jendotek z cytosolu. Obr. 21.36 Role H202 - zabájení patogenu? nebo Fentonove reakcae (H2O2 + Fe2+ - vznik OH radikálu). Substrát syntézi ligninu, peroxidas. askorbát peroxidasa, glutathion peroxidasa. H2O2 je rovněž signální molekula , samotný peroxid indukuje torbu kys. salicylové Syntéza NO Tato látka hraje signální roli u savců a bakterií, imunitní, nervové, cévní systém. Rzopaná patogenu je rpovázeno u rosltin syntézou NO. HR není samotná způsobena 108 pouze H2O2, na to je zapiotřebí i NO. Možná je jejeho role v inhibici peroxidasy a katalasy. Ukazuje se složitější role, aktivace genů, syntéza mRNA. Modifikace buněčné stěny Ukládání kalosy, syntéza ligninu Extracelulární HRGP - hydroxyprolin rich glykoport. - již předtím přítomný váže se přes cross link do stěny přes tyrosin (PPPPY) prostřednictvím H2O2. Další HRGP de novo aktivuje syntézu ligninu inhibitor polygalakturonasy - extracelulární, inhibuje enzym patogenu PGs (polygalakturonasu), výsledek zřejmě vede k nárůstu konc oligogalakturonidů aktivace obranné rekace =elicitory Salicylaát a benzoát Aktivace phenylpropanoidové dráhy interakcí s patogenem - transgenní rosltiny s genem nahG (salicyláthydroxylasa), konveruje SA na katechol - silně se snižuje rezistence tabáku proti TMV Obr. 21.41 Syntéza JA - navyšuje po ataku patogenu nebo hmyzu. Transgenní rosltiny bez JA dráhy syntézy JA - snižuje se rezistence proti nektrotrofním parazitům ale nikoli biotrofním (proč?). Stejně tak se zvyšuje syntéza ethylenu. Zjisitlo se, že pro expresi obranné reakce není ethylen enzbytný, avšak při kompatibilních intgerakcích syntéza ethylenu zvyšuje účinky HR. PR - proteiny Tabulka 21.4 několik minut až hodin po infekci se zvyšuje koncentrace transkriptů něškterých genů. Tyto PR proteiny jsou chtinasy, glukanasy a enzymy degradující stěnu hub. Bylo zjištěno, že transkripce některých genů je zpotředkována přes SA a ethylen. Mezi další obranné rpoteiny patří lipoxygenasy -stimulace syntézy JA. Defensiny - proteiny 7 kDa bohaté na Cys, signál jd epřes JA a ethylen ale nikoli SA. Homologie s defensiny hmyzu, ptáků a savců 109 Obr. 21.44 A Fytoalexiny Ltáky nízkomolekulární produkované po ataku aptogenem. několik skupin: terpenoidy, flavonoidy a stilbeny. Zřejmě nutná aktivace všech anymů dané dráhy. Enzymy syntézy flavonoidů (PAL, 4CL a C4H) jsou regulovány jak na úrovni trasnkripoce, tak translace. Mechnismus účinku řady phytoalexinů není znám. , příklady známých resveratrol - stilbenyantibskteiální účinky, fungicidy, inhibice růstu konkurenčních rosltin camalexin proteinase inhibitory - inmdukují s epo ataku hmyzem, inhibice serinových, cysteinovývh a aspartátových proteinas v trávicím traktu. Systémová získaná rezistence (SAR - systemic acquired resistence) Vity, bkaterie, houby. Lokální nekrosa mv místě ataku, spojená s akumulací SA a vznik signálu, který se šíří floemem. V důsledku toho se ve vzdálených místech zvyšuje koncentrace SA a methylsalicylátu. Odpovídající nárůst koncentrace PR proteinů. Tato rezistence je nespecifická, chrání proti širokému spoektru dalších patogenů. 110 Některé látky jsopu schopny vyvolat SAR, například INA (2,6-dichloroisonikotinát) nebo BTH Obr. 21.49 Jejich přídavek však nevyvolává nárůst SA, tudíž signály jdou dráhou, která je pod signalizací SA. Odpověď na atak hmyzem: Hmyz, housenky, zranění vyvolávají nárůst ethylenu a JA, tekavý methylJA se šíří (systemin) , aktivují odpoved, narůstá koncentrace protinasových inhibitorů (PI) ve vzdálených místech Celkové schéma 111