Přednáška-zkouška 7.5. Rektorské volno??? 21.5. (14.5. jsem v Praze) •Úvod - Analýza proteinu –Domény •fold-struktura (ss, PDB) •Interakce (IntAct) –Komplexy •Funkce •Lokalizace –evoluce •Konkrétní nová data – článek • •Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat poznatky z přednášek … - Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi - DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - komplexy podílející se na replikaci DNA - komplexy opravující poškozenou DNA - komplexy účastnící se přepisu informace - REPLIKACE ORC helikasy polymerasy PCNA TFIIB Rpb4/7 RNA pol II TFIIE TFIIF TFIIH TBP TFIIA TRANSKRIPCE - Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi - DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy Nukleosom oktamer histonů H2A, H2B, H3, H4 histon fold komplexy vytvářející strukturu chromosomu Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) figure 4-26 Sestavování nukleozomu: Nukleosom musí být dostatečně stabilní, ale zároveň je třeba s ním „pohybovat“ (transkripce, replikace) Silnější je interakce mezi H3-H4 - Dimery H2A-H2B se vážou následně z obou stran tetrameru (H3-H4)2 H3 existuje ve více variantách CENP-A je centromerickou variantou (podílí se na určení oblasti centromery) – přichycení kinetochor H2A existuje ve více variantách H2A.Z je v pericentromerách a telomerách (heterochromatinová struktura) H2A.X (g-H2A / fosforylovaný) v místech dvou-řetězcových zlomů figure 4-51 Sestavování nukleozomu: Nukleosom musí být dostatečně stabilní, ale zároveň je třeba s ním „pohybovat“ (transkripce, replikace) Silnější je interakce mezi H3-H4 - Dimery H2A-H2B se vážou následně z obou stran tetrameru (H3-H4)2 H3 existuje ve více variantách CENP-A je centromerickou variantou (podílí se na určení oblasti centromery) – přichycení kinetochor H2A existuje ve více variantách H2A.Z je v pericentromerách a telomerách (heterochromatinová struktura) H2A.X (g-H2A / fosforylovaný) v místech dvou-řetězcových zlomů Figure 4-51 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) CENP-A je centromerickou variantou a podílí se na určení oblasti centromery (epigenetika) Tsabar & Haber, CO in GD, 2013 Modifikace: - struktura chromatinu - transkripce - poškození DNA Remodelovací komplexy Histon H1/H5 interaguje s DNA (nukleosomem) a vytváří dimery (nukl. diady) – WHD doména může vytvářet více kontaktů (H3 šroubovice-MŽ, wing-cukrfosfátová kostra, protein-protein int.) stereoskopický obrázek docking (pouze model) Skládání nukleosomů do kompaktnějších struktur Fan & Roberts, PNAS, 2006 J. Fajkus Nukleosom/H1 solenoid/vlákno – další non-histon proteiny komplexy vytvářející strukturu chromosomu - ohyb a rozvolnění párování dsDNA může napomáhat procesům replikace, transkripce a rekombinace/opravy poškozené DNA - ohyb napomáhá přiblížení vzdálených míst nebo zpřístupňuje DNA pro transkripční faktory - HMG má vysokou afinitu k neobvyklým strukturám DNA (four-way junctions …) Prof. Fajkus - HMGB (B-box) obsahuje 3 šroubovice uskupené ve tvaru L - 1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ - interkalace Phe (aromatický kruh) způsobuje ohnutí DNA - HMGB (B-box) obsahuje 3 šroubovice uskupené ve tvaru L - 1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ - interkalace Phe (aromatický kruh) způsobuje ohnutí DNA - ohyb napomáhá rozvolnění struktury chromatinu tj. moduluje pozici nukleosomů - ohyb může pomáhat TBP a iniciaci transkripce - pomáhá zpřístupnit DNA pro transkripční regulátory Prof. Fajkus Struktura chromatinu - HMGB (B-box) obsahuje 3 šroubovice uskupené ve tvaru L HMG – high-mobility group (PAGE) - HMGA obsahuje AT-hook (Arg a Gly) a váže se na AT-bohatou DNA – také ohýbá DNA a pomáhá transkripci - HMGN obsahuje nucleotid-binding doménu a chromatin unfolding doménu - snižuje kompaktnost chromatinu embor102-f4 - HMGN obsahuje nucleotid-binding doménu a chromatin unfolding doménu - snižuje kompaktnost chromatinu - HMGN interaguje s DNA i histony a uvolňuje H1 - Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi - DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy Repetitivní sekvence vytvářející specifický chromatin – CENP-A histon, který kotví kinetochoru (kolem je pericentromerický heterochromatin a SMC komplexy) tah mikrotubulů a kohesiny zajišťují správnou segregaci v anafázi Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006 10 Repetitivní sekvence vytvářející specifický chromatin – CENP-A histon, který kotví kinetochoru (kolem je pericentromerický heterochromatin a SMC komplexy) tah mikrotubulů a kohesiny zajišťují správnou segregaci v anafázi Velké komplexy viditelné EM > 10 Mad2 komplexy kontrolují ukotvení kinetochor (konformační změna - dokud nejsou všechny nedojde k segregaci) APC komplex (ubiquitin ligasa) proteolyticky štěpí např. sekurin (uvolňuje separasu, která štěpí kleisin tj. otevírá kohesin) COMA, MIND, NDC … komplexy jsou konzervované Telomerase TELOMERA http://telomerase.asu.edu/ Shelterin ochrana telomer před opravou či fůzí Telomerása Prodlužování telomer (zkracují se nedoreplikováním konců) Dyskerin Stabilizuje RNA podjednotku http://www.sabiosciences.com/images/FIGURE_01_Telomeres_480.jpg TRF1 a TRF2 vážou dsDNA (TTAGGG), zatímco POT1 váže ssDNA (3'-overhang ) - TIN2, TPP1 a Rap1 dotváří komplex D-loop a T-loop – ochrana konce Martinez & Blasco, NRC, 2011 nrc2275-f1 Telomeráza je RNA-dependentní reverzní transkriptáza jejíž templátová RNA (telomerase RNA component (TR)) je součástí enzymu (in vitro stačí TERT ale in vivo 6 podjednotek) TERT obsahuje N-terminalní doménu (TEN), telomerase RNA-binding domain (TRBD), reversní transkriptasu (RT) a C-terminalní extensi (CTE). in vitro stačí TERT ale in vivo 6 podjednotek – p50 a Teb1 stimulují/pomáhají v prodlužování telomerových sekvencí Pomocí FLAG-tagu a anti-FLAG protilátky určili pozici jednotlivých podjednotek TERT obsahuje N-terminalní doménu (TEN), telomerase RNA-binding domain (TRBD), reversní transkriptasu (RT) a C-terminalní extensi (CTE). > b) Alternativní prodlužování telomer (ALT) Strategie pro udržování délky telomer Harley, C.B. Nat. Reviews Canc., 2008 Murray, JM and Carr, AM. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008 a) telomeráza - Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi - DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy Model separace chromosomů (S. cerevisiae) APC=anaphase promoting complex Uhlmann et al., Nature, 1999 Komplex Mad2/Cdc20 inhibuje APC – po jeho uvolnění degraduje (ubiquityluje) sekurin – uvolní se tak separasa – štěpí Scc1 kleisin kohesinového komplexu Separasa-securin Komplexy SMC Složení: SMC dimery (homo- a hetero-) - konzervovanější (starší) než histony non-SMC podjednotky (2 – 6) Prokaryota Eukaryota (esenciální) homodimer 2x > ATPase-binding cassette (ABC) ATP-binding Hinge Dimerizace, vazba na DNA Loading i exit přes otevírání head konce … Kohesin „objímá” DNA Haering et al, Mol Cell, 2002 SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Použití fůzních proteinů při studiu kohese sesterských chromatid SMC3-Scc1-Frb + SMC1-FKBP12 (vážou rapamycin) Gruber et al., Cell, 2006 Uzamčení je pro buňku letální Full-size image (60 K) Loading přes hinge, exit přes head Full-size image (60 K) An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is fx1.jpg Loading přes hinge, exit přes head dvěma způsoby – štěpením kleisinu nebo ATP-řízený - regulace acetylací SMC3 - regulace fosforylací Scc3 Chan et al, Cell, 2012 Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012 Loading přes hinge, exit přes head dvěma způsoby – štěpením kleisinu nebo ATP-řízený - regulace acetylací SMC3 - regulace fosforylací Scc3 Losada & Hirano, 2005, Gen&Dev Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012 Cohesin a condensin ?SMC5-6 komplex? ?oprava poškozené DNA? ?kooperuje s kohesinem?