Přednáška-zkouška
•Úvod - Analýza proteinu
–Domény
•fold-struktura (ss, PDB)
•Interakce (IntAct)
–Komplexy
•Funkce
•Lokalizace
–evoluce
•Konkrétní nová data – článek
•
•Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat poznatky z přednášek …

DNA-proteinové komplexy
Komplexy spojené s transkripcí
Komplexy podílející se na opravě DNA
Chromatinové strukturní komplexy

DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktorů
Obecné TFII komplexy a proces transkripce
Komplexy spojené s transkripcí
File:Transcription Factors.svg

Tvarová a nábojová specifita DNA determinuje typy DNA-vazebných domén (oproti velké rozmanitosti
protein-proteinových interakčních domén)
- sekvenčně specifická (např. transkripční faktory) nebo nespecifická (např. histony, HMG proteiny)
vazba
Bi7015 - Chemické vlastnosti, struktura a interakce nukleových kyselin (doc. Fojta a prof. Palecek)

Minor groove
Minor groove
Major groove
Major groove
J. Fajkus
většina sekvenčně-specifických DNA-vazebných domén se váže do tzv. velkého žlábku B-DNA – velký
žlábek je lépe přístupný => lze rozpoznat páry bazí

Vazba proteinů s DNA prostřednictvím vodíkových vazeb
•Gln a Asn mohou tvořit specifické vodíkové vazby s Ade zbytky N-6 a H-7 •Arg může tvořit
specifické vodíkové vazby s Cyt-Gua párem •Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům
a-šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny
Silná vazba, sekvenčně specifická - afinita nM – mM
Slabá vazba, strukturně specifická - afinita mM – mM

Vazba proteinů s DNA prostřednictvím solných můstků
•Arg a Lys mohou interagovat s fosfáty – solné můstky/salt bridges (positivní náboje Arg a Lys
vytváří vazbu s negativním nábojem fosfátové skupiny) •Elektrostatický náboj/povrch naznačuje
vazebné schopnosti proteinu
•
Gajiwala & Burley, COiSB, 2000
… vazba DNA na protein často indukuje změny v jeho struktuře (a naopak, vazba do MŽ) případně u
nestrukturovaným proteinů strukturu indukuje

Motivy DNA vazebných domén
•Zipper typ
–Leucinový zip
–Helix-loop-helix
•Helix-otáčka-helix
–Winged helix
•Zinkový prst
– bba zinc-finger
–Hormon-receptor
–Loop-sheet-helix
–Gal4
•Histon, HMG-box
• b-sheet
• b-hairpin/ribbon
•Enzymy
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e8/Leucine_zipper.png/220px-Leucine_zipper.pn
g
a-šroubovice
b-listy
Literatura: Luscombe et al, Genome Biology, 2000

Motivy DNA vazebných domén
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/e/e8/Leucine_zipper.png/220px-Leucine_zipper.pn
g
•Zipper typ (dle způsobu dimerizace)
–Leucinový zip (GCN4 – 2dgc)
•2 α-helixy (2 x 60 AMK)
•coiled-coil (30AMK, Leu, C-term)
•basická část (N-terminus, navazuje na CC)
•bazická šroubovice vázána do VŽ
–Helix-loop-helix (MyoD)
•CC a bazické části jsou odděleny smyčkou
•bazická šroubovice vázána do VŽ
•smyčka poskytuje větší flexibilitu pro vazbu
šroubovice-smyčka-šroubovice

Interakce bazických Arg(243)=Gua(32), Asn(235)-Cyt(29),



1YSA
1YSA
Jones a spol., NAR, 2003
NUCPLOT

Motivy DNA vazebných domén
•Zipper typ
–Leucinový zip
–Helix-loop-helix
•Helix-otáčka-helix
–Winged helix
•Zinkový prst
– bba zinc-finger
–Hormon-receptor
–Loop-sheet-helix
–Gal4
•Histon, HMG-box
• b-sheet
• b-hairpin/ribbon
•Enzymy
b-listy
a-šroubovice

•Obsahuje ~ 20 AMK ve dvou šroubovicích vzájemně kolmých
Øa-helix pro vazbu na DNA („recognition“) - b-obrátka – druhá šroubovice
ØSekvenčně-specifická vazba prostřednictvím „recognition“ šroubovice a velkého žlábku
Ønejčastější motiv u prokaryot -homodimery vážou palindrom. sekvence
ØHTH motiv se obvykle vyskytuje ve svazku 3-6 šroubovic (stabilizovaných hydrofobním jádrem)
Ømotiv může být buď součástí hlavního proteinu (Cro) nebo z něj může pouze vybíhat (LacI)
Helix-turn-helix motiv
Luscombe et al, Genome Biology, 2000

Helix-turn-helix motivy (spojené listy nebo šroubovicemi) – odstup HTH (34Å) odpovídá jedné otáčce
B-DNA
Sekvenčně se různé HTH příliš nepodobají
1. variabilita v rozpoznávaných sekvencích DNA
2. variabilita v pozici „recognition“ šroubovice ve velkém žlábku (paralelně k rovině bazí nebo
delší šroubovice jsou paralelně k cukr-fosfátové kostře)
Liljas a spol.
6CRO
1LMB

PthXo1
23 repetic obtáčí DNA ve VŽ
Mak et al, Science, 2012
TALEN technologie
Transcription activator-like effectors
Patogenní bakterie injikují do rostlinných buněk
ovlivňují transkripci rostlinných promotorů

Tandemové repetice (34)
AMK v pozicích 12 a 13 určují specifitu (repeat-variable diresidue) – hlavní:
HD, NG, NI, NN,
NS, HG, N*
Mak et al, Science, 2012
Interaguje otáčka/turn spíše než šroubovice

Regulace transkripce v kvasinkových buňkách
Typ buňky
Geny kontrolované MAT lokusem
a haploid
aSG      OFF
haploid SG    ON
a2
diploid
aSG      OFF
haploid SG    OFF
a2
a2
a1
Eukaryontní heterodimery vážou nesymetrické cílové sekvence (větší variabilita sekvencí)
1LE8
mat a2
mat a1

„Winged“ helix (okřídlená šroubovice)
Gajiwala & Burley, COiSB, 2000
Luscombe et al, Genome Biology, 2000
- „winged“ HTH obsahuje „recognition“ šroubovici (H3) a b-listy, které poskytují další kontakty s
DNA
-

Interakce bazí a cukr-fosfátové kostry se šroubovicí (H3)



- „winged“ HTH v mnoha specifických transkripčních faktorech ale také v „general“ TFII faktorech



Histon H1/H5 interaguje s DNA (nukleosomem) a vytváří dimery (nukl. diady) – WHD doména může
vytvářet více kontaktů (H3 šroubovice-MŽ, wing-cukrfosfátová kostra, protein-protein int.)
stereoskopický obrázek
docking (pouze model)
Skládání nukleosomů do kompaktnějších struktur
Fan & Roberts, PNAS, 2006

Kumar et al, PLoS One, 2012, Palecek et al, JBC, 2006
- „winged“ HTH obsahuje „recognition“ šroubovici (H3) a b-listy, které poskytují další kontakty s
DNA
- WHD (i další struktury) poskytují pouze „kostru“ a záleží na postraních řetězcích jaká DNA nebo
protein se naváže
Nse4 kleisin interaguje s SMC5 proteinem prostřednictvím hydrofobních vazeb

Motivy DNA vazebných domén
•Zipper typ
–Leucinový zip
–Helix-loop-helix
•Helix-otáčka-helix
–Winged helix
•Zinkový prst
– bba zinc-finger
–Hormon-receptor
–Loop-sheet-helix
–Gal4
•Histon, HMG-box
• b-sheet
• b-hairpin/ribbon
•Enzymy
b-listy
a-šroubovice

Zinc-finger/Zinkový prst
- cca 30 AMK ve dvou krátkých antiparalelních b-listech a a-šroubovici
- smyčka („hairpin“) stabilizovaná („crosslinked“) Zn2+ - koordinovaný 4xCys nebo 2xCys + 2xHis
(tetraedrická struktura)
 C2H2 motiv:
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His

- vazba na DNA je relativně slabá, takže se typicky vyskytuje tandemově několik domén za sebou (3x
v Zif268)
- a-šroubovice se váže do VŽ – v tandemu obtáčí VŽ
-
- a-šroubovice váže 3 sousední páry bazí (AMK na pozici -1,2,3,6)
- variancemi AMK v těchto pozicích lze dosáhnout různé sekvenční specifity

1ZAA, Zif268
-a-šroubovice váže 3 sousední páry bazí (AMK na pozici -1,2,3,6)
- a-šroubovice se váže do VŽ – v tandemu obtáčí VŽ

- CTCF (zkratka z CCCTC factor) izolátor/insulator brání transkripci
- váže se mezi transkripční aktivátory a general transkripční faktory
- obsahuje 11 zinkových prstů
CTCF
2749850_1471-2199-10-84-2
Razin a spol., Biochemistry, 2012

>

- obsahuje 11 zinkových prstů – k vazbě na DNA používá různé kombinace ZF
1-s2
Stitzel a spol., Cell Metabolism, 2010
Ohlsson a spol., TiG, 2001
- CTCF funguje též jako kotva pro nukleosomy
- interaguje s kohesinem a podílí se na utváření vyšších chromatinových struktur

„genome editing“
Zinc Finger Nucleases: Highly-specific Genomic Scissors Image
- a-šroubovice váže 3 sousední páry bazí (AMK na pozici -1,2,3,6)
- variancemi AMK v těchto pozicích lze dosáhnout různé sekvenční specifity (vazba do VŽ)
- proteiny obsahují několik zinkových prstů obtočených kolem DNA ve spirále
Full-size image (85 K)
Transcription activator-like
Perez-Pinera a spol., COiCB, 2012
64 variant pro všechny triplety

87_zincfingers
Vazba 2 zinkových prstů – spojuje 2 transkripční faktory (další ZnF vážou DNA): 1y0j
Protein interaguje s RNA HIV nukleokapsid (1a1t)
EEA1 protein se váže na specifický lipid obsažený v endosomech – esenciální pro transport molekul
do buněčných kompartmentů (1joc)
Rozdíl mezi Zinc-finger a RING-finger doménami (interakce mezi E2 a E3 proteiny)
Perry a spol., TiBS, 2008
- jeden z nejlépe prostudovaných motivů (váže DNA, RNA i v jiných typech proteinů)

Hormon receptor family
Jaderné receptory – steroidní hormony, thyroidní hormony a retinoidy – navázání ligandu stimuluje
translokaci receptoru z cytoplasmy do jádra a vazbu na HRE (hormon response element - regulaci
transkripce)
- α-šroubovice-smyčka(loop)-α-šroubovice (kolmé)
- 4 Cys koordinují Zn
- 1. helix ve velkém žlábku a smyčka s druhým helixem kontaktují cukr-fosfátovou kostru
- doména dimerizuje (přes smyčku)

File:Nuclear Receptor Structure.png
navázání ligandu stimuluje vazbu k DNA


třída I (homodimery, cytoplasma) a třída II (heterodimery, jádro) – vazba ligandu také moduluje
vazbu ko-aktivátorů (dalších transkripčních faktorů nebo chromatinových remodelátorů/např. histon
acetylasa – acetylace uvolní histon)
Nuclear_receptor_action
wikipedia

File:NR mechanism.png
- Hormony (estrogen) nebo syntetické látky (diethylstilbestrol) působí jako agonisté a stimulují
vazbu koaktivátorů
- antagonisté (synt., hydroxytamoxifen) brání vazbě agonistů a koaktivátorů a stimuluje vazbu s
korepresorem
http://en.wikipedia.org/wiki/Nuclear_receptor - seznam receptorů a jejich ligandů

Loop-sheet-helix
- smyčky vycházející mimo hlavní core doménu – vyčnívá b-list a α-šroubovice
- 3 Cys a 1His koordinují Zn
- helix ve velkém žlábku a smyčka v malém žlábku
- Aktivace transkripce skrze kyselou TA doménu
- core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy
a opravy poškozené DNA (nádorový supresor)
TFIID,TFIIH - transkripce
MDM2/MDM4 - ubi

Loop-sheet-helix
- Konsensus sekvence PuPuPuC(A/T)(T/A)GPyPyPy (v promotorech p21, PUMA)
- 95% “nádorových” mutací je v „core“ doméně (R273H)
-Regulace/aktivace modifkací C-koncové domény
Protein se váže jako tetramer (C-koncová doména)
-
- core/DNA-vazebná doména p53 – transkripční faktor důležitý pro regulaci buněčného cyklu, apoptozy
a opravy poškozené DNA (nádorový supresor)

Gal4
- 2 α-šroubovice
- 6 Cys koordinuje 2 Zn (2 Cys sdílené 2 Zn)
- 1. helix ve velkém žlábku a 2. kontakt s cukr-fosfátovou kostrou
- Dimerizuje přes krátký CC segment
Marmortstein et al.: Nature, 1992
- transkripční faktor reguluje v kvasinkách metabolismus galaktosy (kvasinkový dvou-hybridní
systém)

Gal4