CG030 – Struktura (architektura) a funkce proteinových komplexů
Oficiální fotografie doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat.
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
(garant)
2013
Paleček
Marek
Blažek
Kozáková
Krejčí
Murray

Informační zdroje
Liljas a spol: Structural biology (2009)
Golemis a Adams: Protein-protein interactions (2005)
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PLoS …
Databáze proteinových struktur: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do, http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/
Database protein-proteinových interakcí: http://string-db.org/newstring_cgi ...
http://www.ebi.ac.uk/intact/?conversationContext=1
Textbook Of Structural Biology Prot interakce kniha

- vyhodnoceni výsledků testu z proteomiky – dobrý background
- „díky za poznámky v anketě“ - písemný test – hlavní závěry z přednášek
- kdo na čem pracuje (zapsat) – přednášky o komplexech, na kterých pracují studenti – prohloubení
znalostí s novým úhlem pohledu
 - Pohled na vybrané procesy probírané v biochemii a molekulární biologii z hlediska proteomiky a
především z hlediska proteinových komplexů
-výběr komplexů majících vztah k tématům probíraným v laboratořích „chromatinových molekulárních
komplexů“ a skupin z MU
- doporučení přednášek: Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041), Proteomické metody
(CG080 - střet zájmů? :-)

CEITEC semináře (3. čtvrtek v měsíci)
21.2. ve 14.00 – A11, 132
Kdo viděl minulý seminář o dyneinu (A. Carter)?

- pohled na evoluci z hlediska proteinových komplexů (tzv. komplexně neredukovatelné systémy, od
genetické změny k proteinu a zase zpět)
19.2.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Paleček
Úvod - proteinové interakce, komplexy
26.2.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Marek
uvod do strukturni biologie
5.3.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Marek
signální dráhy, GPCR
12.3.2013
12-13.50hod
???
Mgr. Kozáková
ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom
19.3.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Paleček
DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy
26.3.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Krejčí
Oprava poškozené DNA, homologní rekombinace, Fanconi anemia komplex
2.4.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Paleček
chromatinové komplexy, modifikace histonů a remodelovací komplexy
9.4.2013
12-13.50hod
A2-2.11
Dr. Blažek
CDK
16.4.2013
12-13.50hod
A2-2.11

přednášky studentů
23.4.2013
12-13.50hod
A2-2.11
Dr. Murray
Restart replikačních vidlic
30.4.2013
12-13.50hod
A2-2.11

přednášky studentů
7.5.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Paleček
Evoluce komplexů
14.5.2013
12-13.50hod
A2-2.11

seminar v Praze
21.5.2013
12-13.50hod
A2-2.11
doc. Paleček
Zkouška - test

•na většině buněčných procesů se podílí komplexy (většina studií se zabývá jednotlivými proteiny
nebo aktivitami – pro zjednodušení problému analyzujeme většinou jednu enzymovou aktivitu či funkci
jednoho proteinu …)
~800 komplexů v S.c.
Bertero et al, Cell, 2010

~800 komplexů v S.c.
Bertero et al, Cell, 2010
RPA1, 2, 3 - heterotrimer
PCNA
homotrimer
•na většině buněčných procesů se podílí komplexy (většina studií se zabývá jednotlivými proteiny
nebo aktivitami – pro zjednodušení problému analyzujeme většinou jednu enzymovou aktivitu či funkci
jednoho proteinu …)
helikasa
hexamer

Bertero et al, Cell, 2010
•většiny klíčových procesů jako replikace DNA, transkripce, translace se účastní multiproteinové
molekulární stroje

Bertero et al, Cell, 2010
•většiny klíčových procesů jako replikace DNA, transkripce, translace se účastní multiproteinové
molekulární stroje (složené z více komplexů či podkomplexů)
•

Proteinové komplexy jsou složené z jednotlivých proteinů/podjednotek které spolu interagují - pokud
schází podjednotka, tak nefunguje celý komplex – komplex se nesestaví/rozpadá
SMC6
SMC5
Delece kterékoli podjednotky je pro kvasinkovou buňku letální
- Mutace mají relativně podobný fenotyp, ale …
Deplece kterékoli podjednotky lidského komplexu (není esenciální) má za následek pokles hladiny
ostatních proteinů
Sergeant et al., MCB, 2005

Ulrich, JCS, 2012
Fanconi anemia „komplementační skupiny“ – geny/proteiny jejichž mutace způsobují FA syndrom –
ukázalo se, že většina z nich tvoří jádro FANC komplexu (Krejčí)

přerušení protein-proteinové interakce je relativně snadné u slabých dimerů – větší komplexy jsou
většinou stabilizovány více interakcemi a je tedy obtížnější je narušit
SMC6
SMC5
Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet jednotlivých protein-proteinových interakcí
mezi podjednotkami (efekt přiblížení a zorientování partnera)
Nse4
Pull-down
kvasinkový
2-hybridní systém
wt
mut

Podjednotky komplexů koexprimovány (ko-translace)
Proteiny s nimiž ko-purifikovala jiná než jenom vlastní mRNA
Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe)

Duncan & Mata, PLoS Genetics, 2011 (S. pombe)
Proteiny se skládají hned po translaci, nebo za pomoci chaperonů, nebo až v určitém místě (např. v
mitochondrii po odštěpení signální sekvence …) - často jsou podjednotky komplexů koexprimovány
(podobná regulace transkripce + ko-translace)
samostatně by se neposkládaly, byly by nestabilní, toxické nebo by agregovaly (protein-proteinové
interakce často přes hydrofobní povrchy a je třeba je vytvořit co nejdřív) - koexprese a
kopurifikace proteinů (kdo purifikuje proteiny?)

Komplexy se utvářejí (převážně) prostřednictvím protein-proteinových interakcí
•Polypeptidový řetězec má tendenci vytvářet sekundární struktury -> terciární struktury ->
quarterní tj. komplexy (stejné typy nekovalentních vazeb, kritérium minimální energie) (šroubovice
a listy se k sobě skládají podobným způsobem)
–iontové, vodíkové, van der Waals, hydrofobní síly (kovalentní vazby - disulfidické můstky
především u extracelularních proteinů)
– - vodíkové můstky především u b-listů
•
•hydrofobní zbytky jsou tlačeny dovnitř proteinu (nikoli do solventu)
–součet hydrofobních sil je značný (převažuje u většiny interakcí)
•- hydrofobní povrchy se podílí na vytváření coiled-coil vláken
•
•
•Variabilita je velká – nelze je jednoduše definovat - obtížná predikce (založená na struktuře
„vyřešených“ komplexů, v 2010 pouze 300 struktur s partnery z celkem desítek tisíc PDB dat)
•
•
–

Coiled-coil doména je častým dimerizačním modulem proteinů
f
a
d
e
b
f
c
g
a
d
c
g
f
e
b
Dvě šroubovice s tzv. heptádovou repeticí  (hxxhxxx)
(vláknité struktury – A. Carter)
TRIM/RBCC proteiny vytváří bodies v buňkách (např. PML)
Lupas, TiSB, 1996
Meroni, BioEssays, 2005

+
polá
hydrofob
rní
ní
-
Ostatní domény/moduly lze definovat pouze obecně: proteiny musí mít komplementární tvar i charakter
-
malá změna povrchu může změnit interakční schopnosti
(např. WHD váže DNA i proteiny - Paleček)

Ostatní domény/moduly lze definovat pouze obecně: proteiny musí mít komplementární tvar i charakter
-
malá změna povrchu může změnit interakční schopnosti
(např. WHD váže DNA i proteiny - Paleček)

Z analýzy protein-proteinových interakcí lze usuzovat na potenciální stabilní komplexy vs přechodné
interakce
S jakými partnery a jak silně interagují vaše proteiny?
Bader et al, FEBS Lett, 2008

Tucker et al, TiCB, 2001
Interakční síť
(>15 protein-proteinových interakcí)
Velkou roli hraje multi-modulární/-doménové složení proteinů a jejich interakce (proteomika)
Multiproteinové komplexy (stabilní či přechodné) jsou dále fyzicky spojeny s dalšími komponentami
buňky – interakční a funkční sítě (algoritmy sociálních sítí)

Post-translační modifikace mění povrch – pro určité modifikace známe specifické vazebné domény
Např. SH2 domény váží fosfopeptidy – dvě vazebná místa (fosfoTyr a peptid – peptid určuje vazebnou
specificitu) – PDB: 2PLD

Takovéto domény jsou často jako moduly součástí proteinů rozmanitých funkcí
Např. SH2 domény se vyskytují v proteinech s různými biochemickými aktivitami (doménami) – způsob
jakým jsou propojeny funkčně odlišné proteiny fyzicky s regulátorem (např. kinasa s
autofosforylovaným Tyr dále fosforyluje proteiny, které obsahují SH2 vážící fosfoTyr-peptid a jsou
následně fosforylovány)
Golemis a Adams

Fosforylace a vazba fosfopeptidu je velice rozšířeným mechanismem spouštění biologických odpovědí –
kromě SH2 rozeznávají pTyr tzv. PTB domény (v dokovacích proteinech)
Golemis a Adams
Orlicky et al, Cell, 2003
Modifikace
AMK zbytek
interakční doména
Fosforylace
tyrosin
SH2, PTB

serin/threonin
14-3-3, WD40, WW, BRCT
acetylace
lysin
bromodoména
metylace
lysin
chromodoména
hydroxylace
prolin
VHL b
ubiquitinace
lysin
UIM, UBA, CUE
SUMOylace
lysin
SIM
SCF komplex – vazba fosfopeptidu (inhibitoru CDK na WD40 doménu) ukotví substrát pro ubiqitinaci –
b. cyklus (Kozáková, Blažek)
SCF komplex je typem adaptéru – substrát přiblíží k enzymu

Bottomley, EMBO rep., 2004
Modifikace histonů ovlivňují složení a přístupnost chromatinu – bromodoména GCN5 HAT navázaná na H4
lysin – PDB: 1E6I - (Fajkus, Paleček)

Bottomley, EMBO rep., 2004
Acetylace uvolňuje konce histonů, zatímco metylace neutralizuje náboj (kompaktnější) – chromodoména
HP1 navázaná na H3 lysin – PDB: 1KNA - (Fajkus, Paleček)

ubiquitinace
většinou jsou vlastnosti proteinů/komplexů kontrolovány a modifikovány prostřednictvím jejich
modifikací a interakcí se sousedními proteiny a dalšími komponentami buněk (DNA, RNA, fosfolipidy,
cukry a sekundárními posly)
Replikace
Oprava DNA
Buněčný cyklus

Protein-proteinové interakce moduluje velmi často GDP-GTP konverze – konformační změna (doc. Marek)
Mnoho proteinů obsahuje pouze interakční domény a mají jediný úkol: nukleace multiproteinových
komplexů  – scaffold (lešení)
Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005

Uetz and Finley, FEBS Lett. 2005
Přeskládáním modulů lze vytvářet komplexní biologické systémy
- některé viry využívají buněčné moduly k invazi do buněk
- v průběhu evoluce některé moduly fůzovaly
- některé oncogeny jsou výsledkem fůze modulů
Snaha připravit inibitory proteinových interakcí

Inhibice protein-proteinových interakcí/p53-MDM2
Shangary & Wang, Annu Rev Pharm Toxicol, 2009


přerušení protein-proteinové interakce je relativně snadné u malých komplexů (dimerů) – větší
komplexy jsou stabilizovány více interakcemi => inhibice?
Shangary & Wang, Annu Rev Pharm Toxicol, 2009
Inhibice protein-proteinových interakcí/p53-MDM2

Otázky při studiu nových proteinů
•Konzervace sekvence? Strukturní data?
•S jakými partnery interaguje přímo? Jsou koexprimovány a kolokalizovány? Skrze jaké domény
interagují?
•Je součástí komplexu? Architektura/funkce komplexu?
•Ovlivňují nějaké interakce aktivitu daného proteinu?
•Kde v buňce/organismu se protein nachází?
•
http://bhapp.c2b2.columbia.edu/PrePPI/cgi-bin/search.cgi?query=nse3&protein=Q05541
Zhang et al, Nature, 2012

Závěry
•na většině buněčných procesů se podílí komplexy (stabilní či dynamické)
•Stabilita komplexu je zpravidla větší než pouhý součet jednotlivých protein-proteinových funkce
celého komplexu je závislá na každé podjednotce (komplex se nesestaví nebo rozpadne bez všech
podjednotek)
•některé podjednotky mohou plnit funkci adaptérů či lešení
•proteiny jsou spojeny prostřednictvím interakcí mezi doménami
•protein-proteinové interakce můžeme znázorňovat jako  interakční/funkční sítě (databáze mohou
napovědět ...)