1 Strukturní biologie Jaromír MAREK, Centrum strukturní biologie, CEITEC MU Obsah • Předmět studia • Centrální dogma • Techniky strukturní biologie • Strukturní biologie a primární, sekundární, terciární a kvarterní struktury 2 Subjekt studia (strukturní) biologie Organismy Buňky Buněčné struktury SSBs polymerase Molekulární komplexy helicase primase 3-D struktury • Buňka se skládá z miliónů molekul • K normální funkci buněk je nutná „komunikace“ mezi molekulami. Chyby v přenosu informací mohou způsobovat poruchy funkce („nemoce“) • Pro pochopení principů vnitrobuněčného přenosu informací je zapotřebí znát atomární struktury molekul a cesty, kterými mezi sebou molekuly v buňkách interagují/komunikují Organismus →→→→ Orgán →→→→ Tkáň →→→→ Buňka →→→→ Molekuly →→→→ Atomy Úrovně studia biologických systémů 3 Atomický přístup v biologii RPARPA NER BER RR Molekula Strukturní genomika Interakce Strukturní proteomika Aktivita Strukturní systém. biologie Centrální dogma molekulární biologie 4 Centrální dogma strukturní biologie Počet struktur k určení 102103Proteinové sklady 103105Exp. určené struktury 106107Sekvence Membránové proteiny Rozpustné/ globulární proteiny Počet 5 Strukturní biologie v „postgenomické“ éře biologie DNA sekvence Proteiny Počet proteinových struktur v PDB 6 Techniky strukturní biologie na atomárním rozlišení NMR RTG krystalografie Výpočetní metody + metodiky „budoucnosti“ : kryoEM, … kryoEM: biomakromolekulární ansámbly 7 Rozdílnost přístupů NMR a rentgenové krystalografie RTG RTG Difrakční obraz Přímá detekce maxim elektronové hustoty Krystaly NMR RF RF Resonance H0 Nepřímá interpretace z meziatom. vzdáleností V roztoku Strukturní dynamika • Biopolymery jsou dynamické, a vesměs se vyskytují ve více než jediné možné prostorové konformaci • Výsledky ani NMR, ani RTG experimentu nemohou být reprezentovány jedinou „správnou“ konformací C N 8 Vliv a interpretace pohybu v RTG krystalografii a NMR RTG: • Difúznost elektronových hustot • Průměrná struktura + „teplotní“ kmity • Alternativní/násobné pozice NMR: • Ostrost rezonančních signálů • Ansámbl možných řešení -> průměrná struktura • Možnost studia přechodů mezi různými konformacemi Proč výpočetní strukturní biologie? • Experiment (RTG+ NMR) ne vždy funguje: velikost. limitace, stabilita/flexibilita, (ne)krystalizovatelnost, … • Potenciálně velmi rychlá cesta ke (správné?) struktuře • „Svatý Grál“ výpočetní strukturní biologie: ab-initio predikce 3-D struktur ze známé primární sekvence • Interpretace a vizualizace experimentálních výsledků: podobnost/rozdílnost struktur, povrchy/dutiny, mutace … • Dynamika, atomární mechanismus interakcí, QSAR, … 1 QQYTA KIKGR 11 TFRNE KELRD 21 FIEKF KGR výpočet 9 Od sekvence ke 3-D struktuře 20 geneticky kódovaných aminokyselin 10 Replikace DNA do primární struktury Vlastnosti aminokyselin V valine (val) 11 Polypeptidy Chemické interakce stabilizující proteiny • kovalentní vazby Cα-C • vodíkové můstky • elektrostatické interakce • S-S můstky • Hydrofobicita, • vdW interakce 12 Limitovaná konformační volnost proteinů β-struktury α-struktury Sekundární struktury proteinů Určující interakce • primární struktura – kovalentní vazby • sekundární struktura – vodíkové můstky Nejjednodušší: β-otočka – 4AA + 1H-můstek 13 Sekundární struktury proteinů: α-šroubovice • H-můstky uvnitř AA vlákna (mezi každou čtvrtou AA) • periodicita : 3.6 AA • posun mezi AA : 1.5 Å • délka „závitu“ : 5.4 Å • průměrná délka: 3 otočky Sekundární struktury proteinů: β-listy • H-můstky mezi paralelními AA vlákny (posun:2AA ~ 7Å) • H-můstky mezi protiběžnými AA vlákny 14 Struktura a topologie proteinů: (2D) zápis Sekundární struktura: 2D vs 3D Sekundární vs. terciární struktura proteinů • SS stabilizují protein jako celek • Rigidita – gen vs. struktura • CATH klasifikace 15 Sekundární struktura – přímé určení • Definice – H-vazby • Nepřímý indikátor– hodnoty úhlů φ a ψ • (α/β) charakteristika SS: CD, Cirkulární dichroismus Sekundární struktura - predikce Oktapeptid GSLVALGF: Metody predikce: • pravděpodobnostně/statistické techniky • homologie s experimentálně určenými strukturami Limitovaná přesnost - konce α/β struktur 16 Terciární struktura proteinů • Stabilizace struktury – O-H…O můstky, S-S můstky, iont. interakce, kovové atomy/ionty, substráty, … • Sklad/folding proteinů - teoreticky nevyřešený problém - výsledek závislý na modelu - velké proteiny: experiment je nezastupitelný Skládání proteinů 17 Proteiny – alternativní konformace model Prion PrPC: experiment Multidoménová struktura proteinů • Domény – separátně uspořádané terciární struktury • Evoluční původ – „gen v genu“, „protein u proteinu“ 18 Multidoménová struktura proteinů stabilizace FAD: flavoprotein Globulární a neglobulární proteiny • Rozpustné/globulární • Membránové proteiny • IDP – „intrinsically disordered“ proteins • Proteinová vlákna 19 Membránové proteiny Membránové proteiny – možné klasifikace • funkce • převažující SS: proteiny α/β 20 Membránové proteiny – možné klasifikace • průchod membránou • pozice vůči membráně Membránové proteiny – možné klasifikace •Topologie • Interakce Šroubovice Smyčky Lipid ve stěně Iont. interakce 21 Kvarterní struktura • 2 a více řetězců/podjednotek • Stabilizující interakce – shodné se silami stabilizujícími struktury terciární • Podjednotky – shodné/neshodné – homo/hetero multimery Homodimer HIV-1 proteasy s inhibitorem Kvarterní struktura • Dimer (?) + neshodné jednotky: inzulín • Stabilizace struktury – 2 Zn ionty • Metody určování kvarterní struktury – funkční multimery ? 22 Kvarterní + doménová struktura, multimery Kvarterní struktura + symetrie 23 Kvarterní struktury + „kulová“ symetrie