‹#› ENZYMY V MOLEKULÁRNÍ BIOLOGII VEKTORY, KLONOVÁNÍ ZNAČENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN Metody genomiky a proteomiky, Lekce 2 ‹#› 2 RESTRIKČNÍ ENZYMY Specifická vazba a štěpení dvouvláknové DNA ve specifickém místě. RE typu I: jeden protein má modifikační (metylační) i restrikční aktivitu. Váže se na rozpoznávací sekvenci, ale štěpí v náhodném místě v okolí. RE typu III: jeden protein má modifikační (metylační) i restrikční aktivitu. Štěpí v rozpoznávací sekvenci, pak disociuje od substrátu. RE typu II: restrikčně modifikační systém – RE štěpí ve specifické sekvenci metyláza modifikuje v téže sekvenci Rozpoznávací místo: většinou 4 – 6 nukleotidů, palindromové sekvence ‹#› 3 RESTRIKČNÍ ENZYMY NOMENKLATURA: ZKRATKA VÝZNAM POPIS E Escherichia rod co coli druh R RY13 kmen I první pořadí, ve kterém byla RE identifikována v dané bakterii EcoRI ‹#› 4 RESTRIKČNÍ ENZYMY • vznik kohezních konců EcoRI (GAATTC) – 5´kohezní konce 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ PstI (CTGCAG) – 3´kohezní konce NNNNNCTGCAGNNNNNNN NNNNNGACGTCNNNNNNN NNNNNCTGCAGNNNNNNN NNNNNGACGTCNNNNNNN NNNNNCTGCA pGNNNNNNN NNNNNGp ACGTCNNNNNNN 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 5´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ 3´ ‹#› 5 RESTRIKČNÍ ENZYMY • vznik tupých konců HaeIII (GGCC): NNNNNGGCCNNNNNNN NNNNNCCGGNNNNNNN NNNNNGGCCNNNNNNN NNNNNCCGGNNNNNNN NNNNNGG CCNNNNNNN NNNNNCC GGNNNNNNN MOLEKULÁRNÍ KLONOVÁNÍ ‹#› 6 Specifické metylační systémy v E. coli: • dam - metylace 6N adeninu v sekvenci GATC role v opravných procesech, replikace DNA, exprese genů BamHI – GGATCC + (Bacillus amyloli) BclI – TGATCA - (Bacillus caldolyticus) MboI – GATC - Sau3AI – GATC + • dcm - metylace vnitřního cytozinu (5C) v sekvenci CCAGG, CCTGG EcoRII - BstNI + • EcoKI – metylace adeninů AAC(N)6GTGC, GCAC(N)6GTT • • DNA (plasmidová) namnožená a izolovaná z kmene E. coli dam+ je rezistentní ke štěpení restrikční endonukleázou MboI Klonováním zmizí původní metylační obraz; při použití dam+ a dcm+ kmenů mají klony metylaci v místech specifických pro daný kmen METYLAČNĚ – RESTRIKČNÍ SYSTÉM Bakteriální obranný mechanismus, bakteriální genomová DNA není systémem rozpoznávána ‹#› 7 Odbočka – metylace DNA Metylace C v symetrických sekvencích - CpG (dublety) - CpNpG (triplety; rostliny) Metylace C v asymetrických sekvencích (rostliny, omezeně u živočichů) Distribuce metylace v eukaryotických genomech: ‹#› 8 METYLAČNĚ CITLIVÉ RE v rozpoznávací sekvenci mají cytosin, (ne)štěpí, pokud je metylován CG: HpaII mCmCGG CfoI GmCGC SmaI CCmCGGG TaiI AmCGT ClaI ATmCGAT CNG: MspI mCCGG CHH: Sau96I GG(A/T)mCmC (záleží na tom, co v sekvenci následuje) ‹#› 9 DNA POLYMERÁZY E. coli DNA polymerase I: 5 ´ 3´ polymeráza 5´ 3´ exonukleáza !!! 3´ 5´ exonukleáza Značení DNA „nick translation“: http://bios-project.blogspot.cz/2009/03/nick-translation.html ‹#› 10 DNA POLYMERÁZY Klenow fragment: 5 ´ 3´ polymeráza 3´ 5´ exonukleáza Značení DNA „random priming“: http://www.thermoscientificbio.com/molecular-labeling -and-detection/biotin-decalabel-dna-labeling-kit/ ‹#› 11 DNA POLYMERÁZY Termostabilní DNA polymerázy: Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus) Optimální reakční teplota 72 – 80 °C Polymerázová řetězová reakce (Lekce 4) ‹#› 12 Reverzní transkriptáza RNA-dependentní DNA polymeráza MuLV (Moloney murine leukemia virus) AMV (avian myeloblastosis virus) „SuperScript“: vyšší teploty bez RNaseH aktivity (detaily – Lekce 4) Při teplotě 37 – 42 °C http://9e.devbio.com/article.php?id=32 ‹#› 13 Terminální transferáza http://bioweb.wku.edu/courses/biol350/RestrictionEnz3/Review.html Přenáší dNTP na 3´hydroxylový konec DNA purin – Mg2+ pyrimidin – Co2+ Preferuje substráty s 3´ přečnívajícími konci 3´ koncové značení DNA: ‹#› 14 DNA ligázy Bacteriophage T4 DNA ligase: spojuje kohezní i tupé konce E. coli DNA ligase: spojuje kohezní konce http://ocw.mit.edu/courses/biological-engineering/20-109-laboratory -fundamentals-in-biological-engineering-fall-2007/labs/mod1_3/ ‹#› 15 T4 polynucleotidyl kinase: Přenos fosfátu z ATP (v poloze g) na 5´konec DNA (defosforylovaný templát) koncové značení DNA (end labelling) Alkalická fosfatáza: Odstranění 5´P (před koncovým značením; zabránění self-ligaci vektorů) bakteriální alkalická fosfatáza (BAP) calf intestinal phosphatase (CIF) ‹#› 16 NUKLEÁZY Bal31 nuclease: štěpí 3´ a 5´ konce v dsDNA, AT-bohaté oblasti rychleji endonukleáza – ss úseky v dsDNA (niky, mezery) Identifikace terminálních sekvencí (telomer) Mapování pozice restrikčních míst v kratších fragmentech DNA Nuclease S1: štěpí ssDNA (RNA), nespecif. endo- a exonukleolytické štěpení nízké pH (4.5) – depurinace, limitace použití Odstranění jednovláknových přesahů Otevření vlásenkových smyček Mung Bean Nuclease: štěpí ssDNA („jemnější“ ve srovnání s S1) Odstranění jednovláknových přesahů Nuclease P1: štěpí ssDNA a RNA, nespecif. endo- a exonukleolytické štěpení nedegraduje dsDNA Exonuclease III: štěpí 3´ OH konce dsDNA, neštěpí ssDNA (3´přesahy delší než 4 nt jsou rezistentní) ‹#› 17 NUKLEÁZY RNase A: endoribonukleáza, štěpí ssRNA po Py nepotřebuje kofaktory a kationty purifikace preparátů DNA mapování jednobázových mutací v DNA DNase I: endonukleáza, štěpí dsDNA i ssDNA po Py zavedení náhodných nicků do DNA (značení nick translací) mapování interakcí DNA – protein (DNA footprinting) ‹#› 18 VEKTORY - PLASMIDY Plasmid_(english) -Plasmid_emNL http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/plasmid.php ‹#› 19 VEKTORY - PLASMIDY ‹#› 20 VEKTORY - PLASMIDY http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869N/CHEM869NLinks/www.fermentas.com/techinfo/NucleicAcids/mappuc1819. htm ‹#› 21 VEKTORY - PLASMIDY http://www.biochem.arizona.edu/ IPTG: isopropyl-b-D-thiogalactosid X-gal: 5´-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-galactosid ‹#› 22 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 1. Digesce DNA restrikční endonukleázou Ligation-1 http://www.biochem.arizona.edu/ ‹#› 23 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 2. Digesce plasmidu restrikční endonukleázou Ligation-2 plasmidová DNA Fosfatázování linearizovaného plasmidu (BAP, CIP) – zabrání recirkularizaci http://www.biochem.arizona.edu/ http://humgen.wustl.edu/hdk_lab_manual/ ‹#› 24 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 3. Ligace – štěpená DNA + štěpený plasmid Ligation-3a http://www.biochem.arizona.edu/ ‹#› 25 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 4. Transformace bakterií rekombinantním plasmidem Bakteriální kmen K12: odstraněn metylačně-závislý restrikční systém mutace v genu recA (prevence nežádoucích přestaveb) mutace v genu endA (kóduje DNA specif. endonukleázu - zvýšení výtěžku plasmidu a kvality izolované DNA) AMG2 http://www.biochem.arizona.edu/ ‹#› 26 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 4. Transformace bakterií rekombinantním plasmidem Chemicky kompetentní buňky AMG2 http://www.biochem.arizona.edu/ ‹#› 27 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 4. Transformace bakterií rekombinantním plasmidem Elektroporace AMG2 http://www.biochem.arizona.edu/ ‹#› 28 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR 5. Růst bakterií na miskách s agarovým médiem, selekce pozitivních klonů Ligation-3New http://www.biochem.arizona.edu/ ‹#› 29 KLONOVÁNÍ – PLASMIDOVÝ VEKTOR Plasmidy s promotory z bakteriofágů: T3, T7, SP6 přilehlé ke klonovacímu místu in vitro transkripce inzertu z linearizovaného plasmidu Plasmidové expresní vektory: silný promotor Plasmidové vektory s přímou detekcí rekombinantních klonů: bakterie s nerekombinantními plasmidy nevyrostou (plasmid nese letální gen) ‹#› 30 KLONOVACÍ KITY TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen 5 min klonování PCR produktů s Taq polymerázou (A na 3´konci) ‹#› 31 DALŠÍ VEKTORY PRO KLONOVÁNÍ Bakteriofágy: bakteriofág l, ~ 50 kb genom místa pro štěpení RE, klonování kratších fragmentů DNA Selekce rekombinantních bakteriofágů: modro-bílá selekce Cosmidy: modifikované plasmidy, nesou sekvenci pro sbalení do fágové částice Mají replikační počátek a gen pro Amp rezistenci – transformace a replikace jako plasmidy Uspořádání do fágových částic – přenos mezi buňkami (transdukce) Délka inzertů 40 – 50 kb Selekce na základě velikosti BAC (bacterial arteficial chromosome): DNA konstrukt (s replikačním počátkem) až 300 kb inzerty Human Genome Project YAC (yeast arteficial chromosome): umělá sekvence s centromerou, telomerami, autonomní replikační sekvencí (replikační počátek) 100 – 3 000 kb inzerty Mohou být využity pro expresi eukaryotických proteinů v kvasinkách Méně stabilní než BAC (chiméry) ‹#› 32 TRANSFORMACE DO EUKARYOTICKÝCH MODELŮ Kvasinky: v přítomnosti Li+, Cs+; elektroporace Rostliny: • Agrobacterium – prosté ponoření rostlin (pupenů) do suspenze • Bombardování zlatými nebo wolframovými částicemi potaženými DNA • Elektroporace • Transdukce – virová transformace • Živočišné buňky: transfekce (sc plasmidy, siRNA, protilátky) CaCl2, elektroporace, kationické lipidy, kationické polymery, optická transfekce transdukce Při stabilní transformaci – ko-transformace „markerového“ genu Fůzní konstrukty (YFP, GFP) – fluorescenční identifikace úspěšných transformantů ‹#› 33 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA Radioizotop 32P 35S 3H 14C 131I Typ záření b b b b b, g T1/2 14.3 dnů 87.4 dnů 12.26 let 5730 let 8.04 dnů b energie (Mev) 1.709 0.167 0.019 0.156 0.806 ‹#› 34 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA Značení delší (~100 pb) sondy DNA: „random priming“ ctp denaturace nasednutí náhodných hexanukleotidů + Klenow polymeráza + dNTP + dCTP-a32P ‹#› 35 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA Značení delší (~100 pb) sondy DNA: „nick translation“ http://bios-project.blogspot.cz/2009/03/nick-translation.html ‹#› 36 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA atp Značení kratší sondy DNA (oligonukleotidy): koncové značení ‹#› 37 RADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ RNA Transkripce – SP6 a T7 RNA polymerázy ‹#› 38 NERADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA • biotin – protilátka – enzym – sustrát • biotin – streptavidin – enzym – substrát • sulfonová skupina – protilátka – enzym – substrát • digoxigenin – protilátka – enzym – substrát • fluorescenční detekční systém (rhodamin, fluorescein) • Použití chromogenních, chemiluminiscenčních, fluorescenčních substrátů Enzym konjugován s protilátkou nebo streptavidinem alkalická fosfatáza, peroxidáza, glukosidáza, b-galaktosidáza ‹#› 39 NERADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA http://www.jenabioscience.com/ ‹#› 40 NERADIOAKTIVNÍ ZNAČENÍ DNA http://www.jenabioscience.com/