‹#› Metody genomiky a proteomiky, Lekce 4 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE ‹#› 2 POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE Rychlé namnožení úseku DNA na principu in vitro replikace DNA. http://schoolworkhelper.net/pcr-uses-steps-purpose/ 1983 – Karry Mullis (Cetus Corporation) 1993 – Nobelova cena za chemii ‹#› 3 SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI • Termostabilní DNA polymeráza (1 – 2 U/ reakci; tolerance 0.5 – 5 U/reakci) enzym 5´ 3´ 3´ 5´ Taq ano ne Tth ano ne Pfu ne ano Hot start polymerázy – DNA polymeráza vázaná na protilátku, zabránění polymeraci při RT – 70 °C, nutná počáteční denaturace (2 – 10 minut / 95 °C) vyšší specifita reakce ‹#› 4 • Oligonukleotidové primery koncentrace v reakční směsi 0.1 – 1.0 mM (optimalizace – qPCR) 20 – 30 nukleotidů, CG ~ 40 - 60%, podobná Tm primery by neměly být vzájemně komplementární, hlavně na 3´konci 5´ 5´ 3´ 3´ SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI primer dimer ‹#› 5 • Oligonukleotidové primery tvorba nežádoucích sekundárních struktur (vlásenky), hlavně CG bohaté Programy na návrh PCR primerů: Integrated Gene Technologies Gene Script Primer Design VizPrimer, CODEHOP, GeneFisher, Primer3, ...... BioMath (kalkulace Tm) Komerční sety primerů pro modelové organismy: Roche SABiosciences (Qiagen) SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI ‹#› 6 • dNTP (dTTP, dATP, dCTP, dGTP), ~ 200 mM každý (50 – 500 mM) • dUTP místo dTTP – jedna z metod prevence kontaminace DNA s dUTP – degradace uracil-N-glykosylázou přidána před zahájením reakce, inaktivace během prvního cyklu nelze použít s polymerázami s „proofreading“ aktivitou (Pfu) • Templátová DNA Nemusí být známa kompletní sekvence, ale aspoň úseky pro návrh primerů 1 – 10 ng bakteriální DNA 0.1 – 1 ng plasmidové DNA 1 – 200 ng genomové DNA 2 ml cDNA / 50 ml • SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI ‹#› 7 SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI Mg2+ - nezbytné pro aktivitu polymeráz, zvyšují Tm koncentrace pro Taq polymerázy 1.5 mM (200 mM dNTPs) nutno optimalizovat (1 – 10 mM) nebo použít komerční pufr Reakční pufr složka koncentrace úloha síran amonný 5–30 mM usnadňuje rozvolnění DNA BSA 50-500 ng / 50 ml vazba inhibitorů (ze vzorku) DMSO 2-10% (v/v) snižuje Tm, usnadňuje annealing DMF < 10% (v/v) snižuje Tm, usnadňuje annealing formamid 1.25-10% (v/v) snižuje Tm, vyšší specifita stabilizace polymerázy glycerol 0.01-0.1% (v/v) stabilizace polymerázy PEG6000 5-15% (v/v) stabilizace polymerázy SDS < 0.01% zabraňuje agregaci polymerázy spermidin redukce nespecif. vazby polymerázy Triton X-100 0.01% (v/v) zabraňuje agregaci polymerázy močovina 1-1.5 M snižuje Tm, usnadňuje annealing ‹#› 8 REAKČNÍ PODMÍNKY • Denaturace 95 °C (92 – 98 °C), 15 s pro krátké fragmenty (do ~1 kb) 30 – 60 s pro dlouhé fragmenty delší časy – aktivace polymerázy, inaktivace glykosylázy Denaturace dvouvláknové DNA • Nasedání (hybridizace) primerů 50 - 55 °C (podle Tm duplexu DNA:primer) OPTIMALIZACE! 20 - 30 s • Syntéza DNA 72 °C (70 – 74 °C) doba závislá na délce fragmentu (do 1 kb 30 – 60 s 6 – 10 kb až 10 min) Počet cyklů: 25 – 35, vždy negativní kontrolu!!! faktor zmnožení 2n Cyklery ‹#› 9 OPTIMALIZACE TEPLOTY NASEDÁNÍ PRIMERŮ Gradientová PCR – sada PCR s postupně se zvyšující teplotou nasedání primerů Gradientové cyklery Kontrola všech parametrů PCR – qPCR – kalibrační křivka - účinnost reakce Tm Tm ‹#› 10 TYPY PCR „Nested“ PCR: Amplifikace, templát – genomová DNA. Reamplifikace – templátem je produkt první reakce. Analýza heteroduplexů: Asymetrická PCR: preferenční syntéza jednoho vlákna (jeden z primerů v nadbytku). Vzniká ssDNA – sekvenování. https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/heteroduplex-analysis ‹#› 11 TYPY PCR Multiplexová PCR: testování více delecí / bodových mutací v jedné reakci komplikovaná optimalizace (návrh primerů) hlavně v kvantitativním uspořádání s různými fluorescenčními barvami Diagnostika delecí v genu pro dystrofin: 11 exonů na 3´konci v jedné reakci 7 exonů na 5´konci v jedné reakci ‹#› 12 TYPY PCR Alelově specifická PCR: využití alelově specifických primerů detekce bodových mutací a krátkých delecí http://www.lf2.cuni.cz/projekty/prusa-dna/newlook/defa6.htm n – „normální“ primer m - „mutantní“ primer s – společný primer ‹#› 13 TYPY PCR Metylačně specifická PCR – konverze nemetylovaných cytosinů bisulfitem ‹#› 14 Metylačně specifická PCR – konverze nemetylovaných cytosinů bisulfitem každé vlákno po konverzi se amplifikuje zvlášť TYPY PCR ‹#› 15 Metylačně NEspecifická PCR DNA po reakci s bisulfitem metylačně nespecifické primery TYPY PCR Sekvenování (analýza metylovaných cytosinů) analýza HRM (high resolution melting) analýza RE s C v rozpoznávací sekvenci SSCP ‹#› 16 RT - PCR oligo(dT)12-20 random hexa - nonamery specifický primer(y) KVALITA RNA!!! sekvenčně-specifické primery ‹#› 17 REVERZNÍ TRANSKRIPTÁZY enzym délka (kb) teplotní optimum citlivost “difficult templates” RNaseH modif. nucleotidy Transcriptor (Roche) 14 42-65 +++ +++ A A Expand (Roche) 14 42-50 ++ + N A AMV 12 42 (až 60) ++ + A A M-MuLV 10 37 + +(+) A A C. therm. 3 60-70 ++ +++ N A Tth 1 55-70 + + N A ‹#› 18 PRIMERY PRO RT NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTTT oligo(dT)18 plnodélková cDNA chyby – templáty s oligo(a) NVTTTTTTTTTTTTTTTTTT ukotvené oligo(dT)18 plnodélková cDNA zabraňují nasedání na vnitřní části polyA mRNA mRNA (m)RNA (m)RNA genově specifické primery vysoká specifita vhodné pro one-step RT-PCR NNNNNN NNNNNN NNNNNN náhodné hexamery proporcionální přepis všech templátů vysoká koncentrace – pro krátké templáty se sekundárními strukturami ‹#› 19 NÁVRH PRIMERŮ PRO RT-PCR Primery ze sousedních exonů ex1 in1 ex2 genomová DNA RNA ex1 ex2 ‹#› 20 NÁVRH PRIMERŮ PRO RT-PCR Primery zasahují do sousedních exonů ex1 in1 ex2 in2 ex3 genomová DNA ex1 ex2 ex3 X RNA ‹#› 21 KVALITA TEMPLÁTU (RNA) Analýza transkripce genů – izolace mRNA (smír 0.5 – 800 kb, většina 1.5 – 2 kb) Celková RNA – bandy 18S, 28S rRNA > rostlinná RNA (A. thaliana) ‹#› 22 KVALITA TEMPLÁTU (RNA) Bioanalyzér (Agilent) - elektroforetická separace na mikročipech RIN (RNA Integrity Number) ‹#› 23 JEDNOKROKOVÁ RT-PCR Reverzní transkripce a PCR v jedné reakci Vysoce kvalitní RNA, množství do reakce musí být stanoveno empiricky (dle množství transkriptu a použitého enzymu) Sekvenčně specifické primery • RT při 50 – 60 °C • počáteční denaturace • PCR ‹#› 24 ALTERNATIVNÍ SESTŘIH A JEHO ANALÝZA Z jednoho genu vzniká více (izo)forem proteinů Při sestřihu - odstřižení exonů, ponechání intronů Sýkorová and Fajkus, 2009 Fojtová et al., 2011 RT-PCR qRT-PCR microarray analýzy ‹#› 25 KVANTITATIVNÍ RT-PCR Současná amplifikace a detekce produktu v přítomnosti fluorescenční látky • rychlejší (bez elfo) • spolehlivé výsledky, citlivá detekce Exponenciální fáze: Nn = N0 × (Econst)n End-point fáze: Nn = N0 × (Evar)n http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.bio-equip.cn/ http://www.bio-equip.cn/ ‹#› 26 SEKVENČNĚ NESPECIFICKÁ ANALÝZA Van der Velden et al., Leukemia 2003 SYBR Green I • fluorescence výrazně roste po vazbě na dsDNA • signál při 530 nm, detekce na konci každého cyklu • relativně snadný návrh primerů a optimalizace PCR • pozor na nespecifické produkty (dimery primerů)!!! - vždy na konci melting analýza - detekce fluorescence za vyšší teploty • RT s oligo-dT nebo random nonamery, analýza více genů z jedné cDNA • • hand-made mixy s hot start polymerázou (náročné na přesnost pipetování – reproducibilita) • komerční mixy – přidávají se pouze primery a templát • reakce v multiplikátech (nejméně triplikáty), biologické repliky • ‹#› 27 SEKVENČNĚ SPECIFICKÁ ANALÝZA Hydrolytické próby • reportérový fluorochrom v blízkosti zhášeče • během amplifikace – hydrolýza próby - oddělení fluorochromu a zhášeče - detekce fluorescence • během PCR exponenciálně roste množství volných fluorochromů Využití oligonukleotidových sond komplementárních k PCR produktu Vysoce specifická analýza TaqMan próby: Firemní knihovny Validované sety (primery + próba) pro kvantifikaci transkripce v modelových organismech (člověk, myš, krysa, primáti, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis) ‹#› 28 SEKVENČNĚ SPECIFICKÁ ANALÝZA Hybridizační próby • dvě próby, jedna značená (3´) donorovým fluorochromem (fluorescein), druhá (5´) akceptorovým fluorochromem, homologní k vnitřní části amplifikovaného úseku • po hybridizaci – próby v těsné blízkosti • fluorescein je excitován modrým světllem – emise zeleného světla – emitované světlo excituje akceptorivý fluorochrom – detekce • amplifikace – může hybridizovat více prób - vyšší signál detekované fluorescence FRET – fluorescence resonance energy transfer Výhoda: próby jsou během PCR stabilní ‹#› 29 ANALÝZA „MELTING CURVE“ SYBR Green I analýza – specifita produktu PCR • pomalé zahřívání PCR produktu na 95 °C • prudký pokles fluorescence při teplotě kolem Tm C:\DOCUME~1\User\LOCALS~1\Temp\TYPO705\gr1.jpg Pokud jsou přítomny nespecifické produkty – další píky ‹#› 30 ANALÝZA „MELTING CURVE“ Analýza s hybridizačními a „single“ próbami – detekce SNP a genotypování • 220px-Melting_Curve_Analysis_Graphs • derivační pík při vyšší teplotě pro wt alelu (plně komplementární k hybridizační próbě) • derivační pík při nižší teplotě pro mutantní alelu • oba typy píků pro heterozygotní vzorky pomalé snižování teploty (0.1 – 0.2 °C / s) kontinuální měření fluorescence ‹#› 31 METODY KVANTIFIKACE Ct (CP) – cyklus, ve kterém fluorescence stoupne nad detekční limit přístroje závisí na počáteční koncentraci templátu: nižší koncentrace templátu – vyšší Ct vyšší koncentrace templátu – nižší Ct http://www.bio-equip.cn/ ‹#› 32 ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE Koncentrace templátu je vyjádřena v absolutních číslech (kopie, mg/ml) KALIBRAČNÍ KŘIVKA – vzorky standardů o známé koncentraci C:\DOCUME~1\ADMINI~1\LOCALS~1\Temp\TYPO533\gr1.jpg ‹#› 33 C:\DOCUME~1\ADMINI~1\LOCALS~1\Temp\TYPO533\gr3.jpg KALIBRAČNÍ KŘIVKA – vzorky standardů o známé koncentraci R – korelační koeficient (% dat v souladu se statistickou hypotézou) B – „intercept“, teoretické množství kopií detekovatelné v 1. cyklu M – sklon (směrnice) přímky, zásadní pro výpočet efektivity reakce Optimální parametry: M = -3.332 E = 1 (E = (10-1/M) – 1) amplifikace 2 ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE ‹#› 34 KALIBRAČNÍ KŘIVKA - OPTIMALIZACE PCR Kalibrační křivka s parametry blížícími se optimu – optimální podmínky PCR návrh primerů teplota nasedání primerů časy koncentrace primerů Reaction efficiency (*) 0,96336 (* = 10^(-1/m) - 1) M -3,41298 B 24,42021 R Value 0,99963 R^2 Value 0,99926 ‹#› 35 Reaction efficiency (*) 1,00413 (* = 10^(-1/m) - 1) M -3,31208 B 22,34521 R Value 0,99991 R^2 Value 0,99981 ‹#› 36 C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol1.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol3.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol4.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol5.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol6.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol20.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol21.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol23.bmp C:\Documents and Settings\Owner\Plocha\Mila\Administrator\Local Settings\Temp\TYPO533\samcol24.bmp • vlastní analýzu je nutno provádět za stejných podmínek jako kalibrační křivku • • koncentrace analyzovaných vzorků by měly ležet mezi mezními body kalibrační křivky • efektivita amplifikace standardů a analyzovaných vzorků musí být stejná!!!! ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE ‹#› 37 Srovnání množství transkriptu mezi více vzorky relativně k transkripci referenčního genu REFERENČNÍ GEN – konstantní množství ve všech analyzovaných vzorcích amplifikován v separátní reakci nebo současně (multiplex PCR) Bez korekce na efektivitu reakce: R = 2-DDCt DDCt = DCt (vzorek) – DCt (kontrola, kalibrátor) DCt (vzorek) = Ct(analyzovaný gen) – Ct(referenční gen) DCt (kontrola) = Ct(analyzovaný gen) – Ct(referenční gen) Korekce na efektivitu reakce: R = (Egen)DCt(gen) / (Eref.gen)DCt(ref.gen) Ct(kontrola) – Ct(vzorek) Ct(kontrola) – Ct(vzorek) RELATIVNÍ KVANTIFIKACE ‹#› 38 Příklad výpočtu ubq AtTERT DCt DDCt 2-DDCt seedl. 16.32 25.94 9.62 0 1 0.p. 13.79 21.68 7.89 -1.73 3.32 1.p. 14.55 22.80 8.25 -1.37 2.58 3.p. 20.53 29.31 8.78 -0.84 1.79 5.p. 17.29 26.77 9.48 -0.14 1.11 old 18.49 27.88 9.39 -0.23 1.17 RELATIVNÍ KVANTIFIKACE ‹#› 39 MULTIPLEX qPCR VIC yellow (530nm excitation and 555nm emission) Cy5 green (470nm excitation and 510 emission) FAM red (625nm excitation and 660 nm emission) Bass et al., Acta Tropica 2008 ‹#› 40 cDNA MICROARRAYS http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM ‹#› 41 cDNA MICROARRAYS Going and Gusterson, Eur. J. Cancer 1999 ‹#› 42 cDNA MICROARRAYS Going and Gusterson, Eur. J. Cancer 1999