metody v genomice a proteomice
proteomika
separace proteinů a peptidů
metody v genomice a proteomice
proteomika
separace proteinů a peptidů
jan havliš
: masarykova univerzita
:: středoevropský technologický institut
::: mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin
:: přírodovědecká fakulta, národní centrum pro výzkum biomolekul
::: oddělení funkční genomiky a proteomiky
jan havliš
: masarykova univerzita
:: středoevropský technologický institut
::: mendelovo centrum genomiky a proteomiky rostlin
:: přírodovědecká fakulta, národní centrum pro výzkum biomolekul
::: oddělení funkční genomiky a proteomiky
Creative Commons: Uveďte autora‐Neužívejte dílo komerčně‐Zachovejte licenci 3.0 Česko LicenseCreative Commons: Uveďte autora‐Neužívejte dílo komerčně‐Zachovejte licenci 3.0 Česko License 11
lekce 1 02‐04‐13
Příprava proteinových izolátů a frakcionace/separace proteinů a peptidů – základní metody
izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS‐PAGE, 2‐D
gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky; separační postupy pro
analýzu fosfoproteinů a glykosylovaných proteinů, vícerozměrné postupy pro analýzu
komplexních proteinových vzorků
lekce 2 a 3 09‐04‐13 a 16‐04‐13
Hmotnostní spektrometrie proteinů – základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace
(TOF, iontová past, FTMS, hybridní přístroje); metody identifikace proteinů; charakterizace
modifikací proteinů; metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace)
lekce 4 23‐04‐13
Analýza proteinových komplexů – izolace (tagy, MS analýza), charakterizace (analýza protein‐
proteinových interakcí, lokalizace), rekonstituce (funkční studie – architektura komplexů)
lekce 5 30‐04‐13
Metody makromolekulární strukturní analýzy – krystalografické techniky, NMR, cirkulárně
dichroická spektroskopie ‐ výhody a nevýhody; základní postupy proteinové krystalografie ‐
makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho
řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování
lekce 6 07‐05‐13
Příprava rekombinantních proteinů – výběr hostitelského organismu pro expresi rekombinantních
proteinů; expresní systém E. coli; struktura expresního vektoru; výběr hostitelského kmene E. coli
s ohledem na možné problémy jako toxicita proteinu, využití kodonů, stabilita proteinu; cílená
exprese proteinu; inkluzní tělíska a možnosti optimalizace exprese proteinu v rozpustné formě;
zásady pro čištění proteinů; základní typy chromatografií; sledování čistoty proteinů; fúzní
proteiny; afinitní purifikace; uchovávání čistých proteinů
lekce 1 02‐04‐13
Příprava proteinových izolátů a frakcionace/separace proteinů a peptidů – základní metody
izolace proteinů z různých typů vzorků; elektroforetické separační techniky (IEF, SDS‐PAGE, 2‐D
gelová elektroforéza, DIGE, aj.); kapalinově chromatografické techniky; separační postupy pro
analýzu fosfoproteinů a glykosylovaných proteinů, vícerozměrné postupy pro analýzu
komplexních proteinových vzorků
lekce 2 a 3 09‐04‐13 a 16‐04‐13
Hmotnostní spektrometrie proteinů – základní typy ionizace (ESI a MALDI) a MS instrumentace
(TOF, iontová past, FTMS, hybridní přístroje); metody identifikace proteinů; charakterizace
modifikací proteinů; metody kvantifikace (relativní a absolutní kvantifikace)
lekce 4 23‐04‐13
Analýza proteinových komplexů – izolace (tagy, MS analýza), charakterizace (analýza protein‐
proteinových interakcí, lokalizace), rekonstituce (funkční studie – architektura komplexů)
lekce 5 30‐04‐13
Metody makromolekulární strukturní analýzy – krystalografické techniky, NMR, cirkulárně
dichroická spektroskopie ‐ výhody a nevýhody; základní postupy proteinové krystalografie ‐
makromolekulární krystalizační techniky, difrakční experiment, fázový problém a metody jeho
řešení, mapy elektronové hustoty, strukturní model a jeho zpřesňování
lekce 6 07‐05‐13
Příprava rekombinantních proteinů – výběr hostitelského organismu pro expresi rekombinantních
proteinů; expresní systém E. coli; struktura expresního vektoru; výběr hostitelského kmene E. coli
s ohledem na možné problémy jako toxicita proteinu, využití kodonů, stabilita proteinu; cílená
exprese proteinu; inkluzní tělíska a možnosti optimalizace exprese proteinu v rozpustné formě;
zásady pro čištění proteinů; základní typy chromatografií; sledování čistoty proteinů; fúzní
proteiny; afinitní purifikace; uchovávání čistých proteinů
metody v genomice a proteomice–proteomika
sylabus
metody v genomice a proteomice–proteomika
sylabus
: elektroforetické separační techniky
: kapalinově chromatografické techniky
: afinitně chromatografické techniky
: vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorků
: základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků
: elektroforetické separační techniky
: kapalinově chromatografické techniky
: afinitně chromatografické techniky
: vícerozměrné postupy pro analýzu komplexních proteinových vzorků
: základní metody izolace proteinů z různých typů vzorků
33
sylabus
příprava proteinových izolátů
frakcionace/separace proteinů a peptidů
příprava proteinových izolátů
frakcionace/separace proteinů a peptidů
44
separace proteinů/peptidů
: jaká separace?
:: úroveň
:: technika
: jaká separace?
:: úroveň
:: technika
VII.VII.
(s e p a r a c e)(s e p a r a c e)
(s) + (e p a r a c e)(s) + (e p a r a c e)
(s e) + (p a) + (r a) + (c e)(s e) + (p a) + (r a) + (c e)
oddělení komponent(y) ze směsi látek v prostoru (a čase)oddělení komponent(y) ze směsi látek v prostoru (a čase)
původní směspůvodní směs
izolace,
purifikace,
preparace
izolace,
purifikace,
preparace
frakcionacefrakcionace
úplná separaceúplná separace(s) + (e) + (p) + (a) + (r) + (a) + (c) + (e)(s) + (e) + (p) + (a) + (r) + (a) + (c) + (e)
částečná
separace
částečná
separace
separace 
55
preparativní separace
: získání části z celku
preparativní separace
: získání části z celku
hledáme jehlu v kupce sena
: složité směsi
:: vydělení proteinů/peptidů z b. obsahu
:: vydělení žádaných proteinů/peptidů ze směsi
hledáme jehlu v kupce sena
: složité směsi
:: vydělení proteinů/peptidů z b. obsahu
:: vydělení žádaných proteinů/peptidů ze směsi
analytická separace
: separace na individua za účelem další instrumentální analýzy
:: hmotnostní spektrometrie atp.
analytická separace
: separace na individua za účelem další instrumentální analýzy
:: hmotnostní spektrometrie atp.
66
separační vlastnosti aminokyselin/peptidů
alifatickéalifatické
malémalévelmi malévelmi malé
aromatickéaromatické
nepolárnínepolární
zápornězáporně
nabiténabité
polárnípolární
kladně nabitékladně nabité
nabiténabité
77
multifunkční struktura aminokyselin/peptidů
: náboj
:: kladný – N‐konec; boční řetězce (primární amin, guanidin, imidazol)
:: záporný – C‐konec; boční řetězce (karboxyl, hydroxyl)
: stabilní dipóly
:: polární boční řetězce (Trp, Tyr, Thr...)
: indukované dipóly
:: alifatické boční řetězce (Ile, Leu, Val...)
: reaktivní skupiny
:: Cys, Met, Lys, Asp, Glu...
multifunkční struktura aminokyselin/peptidů
: náboj
:: kladný – N‐konec; boční řetězce (primární amin, guanidin, imidazol)
:: záporný – C‐konec; boční řetězce (karboxyl, hydroxyl)
: stabilní dipóly
:: polární boční řetězce (Trp, Tyr, Thr...)
: indukované dipóly
:: alifatické boční řetězce (Ile, Leu, Val...)
: reaktivní skupiny
:: Cys, Met, Lys, Asp, Glu...
faktory ovlivňující separaci
: pH
: polarita prostředí
: iontová síla
faktory ovlivňující separaci
: pH
: polarita prostředí
: iontová síla
chromatografické metody
elektromigrační metody
membránové separace
chromatografické metody
elektromigrační metody
membránové separace
88
(peak capacity)(peak capacity)
schopnost separovat
: počet dobře rozlišených (R ≥ 1.5) píků (n) po dobu separace (tR0 až tRmax)
schopnost separovat
: počet dobře rozlišených (R ≥ 1.5) píků (n) po dobu separace (tR0 až tRmax)
maximalizace kapacity separace
: delší čas separace (v jednom rozměru)
: spojováním více rozměrů či technik (hyphenation)
maximalizace kapacity separace
: delší čas separace (v jednom rozměru)
: spojováním více rozměrů či technik (hyphenation)
78 píků78 píků
64 píků64 píků
w – šířka píku při základně
j – počet píku v separaci (za čas tRmax)
w – šířka píku při základně
j – počet píku v separaci (za čas tRmax)
kapacita separace
99
efektivní pohyblivost  μeff
x molární zlomek látky
efektivní pohyblivost  μeff
x molární zlomek látky
elektroforetická pohyblivost μ
η viskozita, r poloměr, Q náboj a ν rychlost iontu
elektroforetická pohyblivost μ
η viskozita, r poloměr, Q náboj a ν rychlost iontu Joklova rovnice
A, B konstanty, M molekulová hmotnost
Q náboj
Joklova rovnice
A, B konstanty, M molekulová hmotnost
Q náboj
vztah mezi velikostí póru a pohyblivostí
K konstanta obsahující vlastnosti nosiče
μ0 pohyblivost bez nosiče, μ pohyblivost v nosiči
vztah mezi velikostí póru a pohyblivostí
K konstanta obsahující vlastnosti nosiče
μ0 pohyblivost bez nosiče, μ pohyblivost v nosiči
základní principyzákladní principy
elektroforetická metoda – separace dle náboje, tvaru atp. v elmag polielektroforetická metoda – separace dle náboje, tvaru atp. v elmag poli
elektroforetické separační techniky  elektroforetické separační techniky  
1010
: separace v gelu a elektrickém poli: separace v gelu a elektrickém poli
peroxosíran amonný
: iniciátor
tetrametyletylendiamin (TEMED)
: katalyzátor 
peroxosíran amonný
: iniciátor
tetrametyletylendiamin (TEMED)
: katalyzátor 
polyakrylamidový gelpolyakrylamidový gel
viskozita ~100 m2 s–1
průměr kavity (12%) ~ 4.4 nm
viskozita ~100 m2 s–1
průměr kavity (12%) ~ 4.4 nm
hustota gelu
(procento zesíťování;
poměr akrylamidu a bis‐akrylamidu)
 % zesíťování
 snadnější pohyb velmi hmotných molekul
12% – běžné pro 15 kDa – 60 kDa
8% – molekuly 30 kDa – 120 kDa
25% – < 15 kDa;
speciální protokol podle Schäggera‐von Jagowa
hustota gelu
(procento zesíťování;
poměr akrylamidu a bis‐akrylamidu)
 % zesíťování
 snadnější pohyb velmi hmotných molekul
12% – běžné pro 15 kDa – 60 kDa
8% – molekuly 30 kDa – 120 kDa
25% – < 15 kDa;
speciální protokol podle Schäggera‐von Jagowa
akrylamidakrylamid metylenbisakrylamidmetylenbisakrylamid
peroxosíranový anionperoxosíranový anion
volný síranový radikálvolný síranový radikál
polyakrylamidpolyakrylamid
1111
gelová elektroforéza
(GE, gel electrophoresis)
gelová elektroforéza
(GE, gel electrophoresis)
denaturující PAGEdenaturující PAGE
nedenaturující (nativní) PAGEnedenaturující (nativní) PAGE
nativní proteinnativní protein
po denaturaci SDSpo denaturaci SDS
nabité oblastinabité oblasti
hydrofobní oblastihydrofobní oblasti
dodecylsulfát
sodný
dodecylsulfát
sodný
: vzorek se před analýzou denaturuje
(+ EtSH, 95 °C, 5 min)
:: rozbití disulfidických můstků
:: sbalení do konformace náhodného klubka (random coil )
: vodící barva
:: bromfenolová modř
: vzorek se před analýzou denaturuje
(+ EtSH, 95 °C, 5 min)
:: rozbití disulfidických můstků
:: sbalení do konformace náhodného klubka (random coil )
: vodící barva
:: bromfenolová modř
separace kyselých a bazických proteinů zvlášťseparace kyselých a bazických proteinů zvlášť
: vodící barva
:: bromfenolová modř pro kyselé
:: metylenová modř pro zásadité
: vodící barva
:: bromfenolová modř pro kyselé
:: metylenová modř pro zásadité
separace kyselých a bazických proteinů dohromady
: udělení jednotkového náboje bez denaturace
separace kyselých a bazických proteinů dohromady
: udělení jednotkového náboje bez denaturace
modrá nativní PAGE (blue native; BN‐PAGE) – CBB R‐250 (~ 1 g na 1 g proteinu)modrá nativní PAGE (blue native; BN‐PAGE) – CBB R‐250 (~ 1 g na 1 g proteinu)
bezbarvá nativní PAGE (clean native; CN‐PAGE) – n‐dodecyl‐β‐maltosid a digitoninbezbarvá nativní PAGE (clean native; CN‐PAGE) – n‐dodecyl‐β‐maltosid a digitonin
(SDS, Lämmliho)
: separace dle Mw
(SDS, Lämmliho)
: separace dle Mw
(nativní)
: separace dle pI, tvaru i MW
(nativní)
: separace dle pI, tvaru i MW
1212
uspořádáníuspořádání
skleněná
kapilára
skleněná
kapilára
hřebenhřeben
koncentrační
gel
koncentrační
gel
separační
gel
separační
gel
mezerníkmezerník
kolíčekkolíček
rámrám
skla:
přední
zadní
skla:
přední
zadní
pryžová
podložka
pryžová
podložka
stojan na rámystojan na rámy
úchyty rámůúchyty rámů
1313
1. ke vzorku se přidá vzorkovací pufr
2. vzorek se nanese do jamek
3. gel se umístí mezi elektrolyty a aplikuje napětí
4. opláchne a obarví
1. ke vzorku se přidá vzorkovací pufr
2. vzorek se nanese do jamek
3. gel se umístí mezi elektrolyty a aplikuje napětí
4. opláchne a obarví
lmaxlmax
lili
retenční faktorretenční faktor
vzorekvzorek
pufrpufr
vzorkovací
jamky
vzorkovací
jamky
gelgel
pufrpufr
anodaanoda
katodakatoda
skleněné
destičky
skleněné
destičky
základní provedenízákladní provedení
aa aa
bb bb
cc cc
vizualizace
(staining)
vizualizace
(staining)
barvení pro MS
: CBB R‐250 (ne koloidní G‐250)
: stříbro (nízká koncentrace vzorku)
barvení pro MS
: CBB R‐250 (ne koloidní G‐250)
: stříbro (nízká koncentrace vzorku)
Coomassie Brilliant modř (CBB; fixování, barvení, odbarvování)
stříbro (+ Na2S2O3, + AgNO3, + formaldehyd /iniciace red./, stop – kyselina 
octová)
SYPRO rubínová – fluorescenční
Zn2+ + imidazol, + ZnSO4 ; negativní barvení (zóny neobarvené), odstranitelné
Cu2+ + CuCl2; negativní barvení (zóny neobarvené), odstranitelné
Coomassie Brilliant modř (CBB; fixování, barvení, odbarvování)
stříbro (+ Na2S2O3, + AgNO3, + formaldehyd /iniciace red./, stop – kyselina 
octová)
SYPRO rubínová – fluorescenční
Zn2+ + imidazol, + ZnSO4 ; negativní barvení (zóny neobarvené), odstranitelné
Cu2+ + CuCl2; negativní barvení (zóny neobarvené), odstranitelné
nasycení ionty Ag+nasycení ionty Ag+ jejich autokatalytická redukcejejich autokatalytická redukce
1515
využití
: separace jednodušších směsí (1D PAGE)
: separace složitých směsí (2D PAGE)
: identifikace proteinů
:: nepřímé spojení GE‐MS
:: přímé spojení CEGE‐MS
: problémy se zpracováním gelu
využití
: separace jednodušších směsí (1D PAGE)
: separace složitých směsí (2D PAGE)
: identifikace proteinů
:: nepřímé spojení GE‐MS
:: přímé spojení CEGE‐MS
: problémy se zpracováním gelu
kvalitní, ale omezená separace (MW, pI)
: extrémy pI a MW
kvalitní, ale omezená separace (MW, pI)
: extrémy pI a MW
1616
přenos analytu z gelu na membránu
: další zpracování informací
: manipulace se separovanými analyty
přenos analytu z gelu na membránu
: další zpracování informací
: manipulace se separovanými analyty
proteinyproteiny
Westernův přenos (1979)Westernův přenos (1979)
materiály membrán
: nitrocelulóza, polyvinyliden fluorid (PVDF)
materiály membrán
: nitrocelulóza, polyvinyliden fluorid (PVDF)
detekce – monoklonální protilátky
 imunoblot
detekce – monoklonální protilátky
 imunoblot
princip
: aplikace síly kolmo k rovině gelu (difúze, elektroforetická mobilita)
princip
: aplikace síly kolmo k rovině gelu (difúze, elektroforetická mobilita)
1717
přenos (otisku)
(blotting)
přenos (otisku)
(blotting)
vzorekvzorek
přenos na membránupřenos na membránu
detekční
sonda
detekční
sonda
detekční technikadetekční technika
aplikace Ab*aplikace Ab*
vizualizované zónyvizualizované zóny
gelová elfagelová elfa
1818
: technika podobná plošné GE – primárně preparativní (labilní proteiny)
:: převážně SDS‐PAGE
: vhodná pro on‐line spojení s detekčními technikami (MS)
: technika podobná plošné GE – primárně preparativní (labilní proteiny)
:: převážně SDS‐PAGE
: vhodná pro on‐line spojení s detekčními technikami (MS)
separační
pufr
separační
pufr
eluční pufreluční pufr
separační zónyseparační zóny
gelová kolonagelová kolona
eluční komoraeluční komora
sběr frakcísběr frakcí
separační pufrseparační pufr
1919
kolonová (průtoková) preparativní gelová elektroforéza
(CEGE, column nebo continuative elution gel electrophoresis)
kolonová (průtoková) preparativní gelová elektroforéza
(CEGE, column nebo continuative elution gel electrophoresis)
: separace v gradientu pH, v elektrickém poli
(a gelu)
: separace v gradientu pH, v elektrickém poli
(a gelu)
gradient pHgradient pH
44 1010
pI
μ = 0
pI
μ = 0
2020
izoelektrická fokusace
(IEF; isoelectric focusing)
izoelektrická fokusace
(IEF; isoelectric focusing)
zdroj napětízdroj napětí
rámy pro klasické IEF v gelu
stejně jako pro IPG
(immobilised pH gradient)
rámy pro klasické IEF v gelu
stejně jako pro IPG
(immobilised pH gradient)
keramické chladící desky
(Joulovo teplo)
keramické chladící desky
(Joulovo teplo)
nastavitelné zdroje napětí
(elektrody)
pro různé aplikace
nastavitelné zdroje napětí
(elektrody)
pro různé aplikace
2121
: peptidově/proteinově specifické
: spíše frakcionace než separace
: artefakty v MS
: peptidově/proteinově specifické
: spíše frakcionace než separace
: artefakty v MS
využití
: nepřímé spojení
s detekční technikou
využití
: nepřímé spojení
s detekční technikou
gelový proužek s amfolytygelový proužek s amfolyty
separační celyseparační cely
napětínapětí
elektrodaelektroda
pH gradientpH gradient
cely prostorově pokrývají různá pIcely prostorově pokrývají různá pI
proteiny s různým pI skončí v různých celáchproteiny s různým pI skončí v různých celách
2222
izoelektrická fokusace mimo gel
(IEF off gel; OFFGEL)
izoelektrická fokusace mimo gel
(IEF off gel; OFFGEL)
adsorpce na stěny separačního kanálu
: řešení CGE (fyz. i chem. gely)
malá kapacita, nástřik cca 20 nl
adsorpce na stěny separačního kanálu
: řešení CGE (fyz. i chem. gely)
malá kapacita, nástřik cca 20 nl
využití
první rozměr spojených technik
: nutný kapalinový spoj před MS
: nebo záchytová kolona
využití
první rozměr spojených technik
: nutný kapalinový spoj před MS
: nebo záchytová kolona
: separace v elektrickém poli (s využitím elektroosmózy): separace v elektrickém poli (s využitím elektroosmózy)
silikasilika
silikasilika
hydratované kationtyhydratované kationty migrační časmigrační čas
katodakatodaanodaanoda
celková migracecelková migraceelektroosmotický tokelektroosmotický tok
2323
kapilární zónová elektroforéza
(CZE, capillary zone electrophoresis)
kapilární zónová elektroforéza
(CZE, capillary zone electrophoresis)
distribuční koeficient K (poměr D)
A separovaná látka, I fáze stacionární, II fáze mobilní
distribuční koeficient K (poměr D)
A separovaná látka, I fáze stacionární, II fáze mobilní
základní principyzákladní principy
distribuce složek – separace v toku dle polarity, náboje a velikostidistribuce složek – separace v toku dle polarity, náboje a velikosti
a aktivita, c koncentracea aktivita, c koncentrace nástřiknástřik
tok MFtok MF
SFSF
kapalinově chromatografické techniky
chromatografická metoda – separace distribucí mezi dvěma fázemichromatografická metoda – separace distribucí mezi dvěma fázemi
stacionární fáze (SF) – pevná, kapalnástacionární fáze (SF) – pevná, kapalná mobilní fáze (MF) – kapalná, plynnámobilní fáze (MF) – kapalná, plynná
2424
základní provedenízákladní provedení
nástřiknástřik
kolonakolona
odpadodpadčerpadločerpadlo
MFMF
detektordetektor
záznam + vyhodnocenízáznam + vyhodnocení
filtrfiltr
předkolonkapředkolonka
detekce
: spektrofotometrická, hmotnostní spektrometrie
: fluorescence – derivatizace
detekce
: spektrofotometrická, hmotnostní spektrometrie
: fluorescence – derivatizace
kolona
: klasická – 10 až 250 mm
: mikrokolony (max 5 cm), kapilární kolony
kolona
: klasická – 10 až 250 mm
: mikrokolony (max 5 cm), kapilární kolony
SF – sférické částice, monolity
: polární (NPLC, HILIC), nepolární (RPLC, HIC)
: iontově výměnné (anex, katex; IEC)
: molekulová síta (GPC)
SF – sférické částice, monolity
: polární (NPLC, HILIC), nepolární (RPLC, HIC)
: iontově výměnné (anex, katex; IEC)
: molekulová síta (GPC)
MF
: eluční síla
:: kontrast k SF
: tok
MF
: eluční síla
:: kontrast k SF
: tok
: retenční čas
: mrtvý retenční čas
: rozlišení
: retenční čas
: mrtvý retenční čas
: rozlišení
2525
eluce
: izokratická
: gradientová (>15 látek)
eluce
: izokratická
: gradientová (>15 látek)
využití
: méně účinná separace proteinů
: první rozměr 2D‐LC‐MS
:: odsolení v druhém rozměru
: SCX při pH ≈ 3
využití
: méně účinná separace proteinů
: první rozměr 2D‐LC‐MS
:: odsolení v druhém rozměru
: SCX při pH ≈ 3
malý specifický náboj proteinu
: na rozdíl od anorganických iontů
: C a N‐konce a pět nabitých AK
:: tři kladně, dvě záporně
: zachování nativity/náboje
:: SF s mezerníky
malý specifický náboj proteinu
: na rozdíl od anorganických iontů
: C a N‐konce a pět nabitých AK
:: tři kladně, dvě záporně
: zachování nativity/náboje
:: SF s mezerníky
částice SFčástice SF
: separace nabitých látek na nabité SF: separace nabitých látek na nabité SF
tok MFtok MF
analyt A–analyt A–
iont X+iont X+
iont SF + protiiont opačné polarity
: výměna protiiontu za iont analytu
: výměna iontu analytu za iont eluční MF
: výměna iontu eluční MF
za původní protiiont
iont SF + protiiont opačné polarity
: výměna protiiontu za iont analytu
: výměna iontu analytu za iont eluční MF
: výměna iontu eluční MF
za původní protiiont
2626
iontově výměnná chromatografie
(IEC, ion‐exchange chromatography)
iontově výměnná chromatografie
(IEC, ion‐exchange chromatography)
peptidy (i proteiny)
: převážně slabě polární až nepolární
 iontově‐párovací mód
(TFA, FA, AFA)
peptidy (i proteiny)
: převážně slabě polární až nepolární
 iontově‐párovací mód
(TFA, FA, AFA)
využití
: separace peptidů (C18, C12), proteinů (C4 ‐ 6)
: druhý rozměr 2D‐LC‐MS
:: vysoké rozlišení, na monolitu rychlé
:: kompatibilní rozpouštědlově s MS
: IP‐RPLC při pH ≈ 3 nebo pH ≈ 10
využití
: separace peptidů (C18, C12), proteinů (C4 ‐ 6)
: druhý rozměr 2D‐LC‐MS
:: vysoké rozlišení, na monolitu rychlé
:: kompatibilní rozpouštědlově s MS
: IP‐RPLC při pH ≈ 3 nebo pH ≈ 10
2727
částice SFčástice SF
hydrofobní
interakce
hydrofobní
interakce
analytanalyt
: separace nepolárních látek mezi SF a MF o různé polaritě
:: MF je polárnější než SF
: separace nepolárních látek mezi SF a MF o různé polaritě
:: MF je polárnější než SF
molekuly analytů se dělí mezi SF a MF na základě své rozdílné polarity
: méně polární látky setrvávají v systému déle
: než látky polárnější
molekuly analytů se dělí mezi SF a MF na základě své rozdílné polarity
: méně polární látky setrvávají v systému déle
: než látky polárnější
chromatografie na obrácené fázi
(RP‐HPLC, RPLC, reversed phase chromatography)
chromatografie na obrácené fázi
(RP‐HPLC, RPLC, reversed phase chromatography)
využití
: separace peptidů a proteinů
: první rozměr 2D‐LC‐MS
:: polární separace s vysokým obsahem organiky
využití
: separace peptidů a proteinů
: první rozměr 2D‐LC‐MS
:: polární separace s vysokým obsahem organikyčástice 
nosiče SF
částice 
nosiče SF
vodavoda
organická MForganická MF
analytanalyt SFSF
2828
: separace polárních látek mezi SF a MF o různé polaritě
:: SF je polárnější než MF
: separace polárních látek mezi SF a MF o různé polaritě
:: SF je polárnější než MF
molekuly analytů se dělí mezi SF a MF na základě své rozdílné polarity
: polárnější látky setrvávají v systému déle
: než látky méně polární
molekuly analytů se dělí mezi SF a MF na základě své rozdílné polarity
: polárnější látky setrvávají v systému déle
: než látky méně polární
chromatografie s hydrofilními interakcemi
(HILIC, hydrophilic interaction chromatography)
chromatografie s hydrofilními interakcemi
(HILIC, hydrophilic interaction chromatography)
chaotropní
soli
chaotropní
soli
využití
: separace proteinů (C4 – 8)
využití
: separace proteinů (C4 – 8)
2929
: separace nepolárních látek mezi SF a MF o různé polaritě
:: MF je polárnější než SF
: separace nepolárních látek mezi SF a MF o různé polaritě
:: MF je polárnější než SF
molekuly analytů se dělí mezi SF a MF na základě své rozdílné polarity
: chaotropní soli odstraní solvatační obaly a exponují nepolární skupiny
:: (NH4)2SO4
: anti‐chaotropní soli je zase obnoví
:: KSCN a KClO4
molekuly analytů se dělí mezi SF a MF na základě své rozdílné polarity
: chaotropní soli odstraní solvatační obaly a exponují nepolární skupiny
:: (NH4)2SO4
: anti‐chaotropní soli je zase obnoví
:: KSCN a KClO4
chromatografie s hydrofobními interakcemi
(HIC, hydrophobic interaction chromatography)
chromatografie s hydrofobními interakcemi
(HIC, hydrophobic interaction chromatography)
velký vliv teplotyvelký vliv teploty
využití
: separace proteinů
: odsolení směsí proteinů
: frakcionace podle mol. hmotnosti
: první rozměr 2D‐LC‐MS
:: nepříliš vhodná pro LC‐MS – složení MF
využití
: separace proteinů
: odsolení směsí proteinů
: frakcionace podle mol. hmotnosti
: první rozměr 2D‐LC‐MS
:: nepříliš vhodná pro LC‐MS – složení MF
3030
: separace látek o různé velikosti pomocí sítového efektu
:: de facto nejde o chromatografii
: separace látek o různé velikosti pomocí sítového efektu
:: de facto nejde o chromatografii
molekuly analytů se dělí mezi na základě své rozdílné velikosti
: větší molekuly se nevejdou tak hluboko do pórů SF
a setrvávají v systému kratší dobu
: menší molekuly se do nich vejdou hlouběji
a setrvávají v systému delší dobu
: MF látky jen unáší
molekuly analytů se dělí mezi na základě své rozdílné velikosti
: větší molekuly se nevejdou tak hluboko do pórů SF
a setrvávají v systému kratší dobu
: menší molekuly se do nich vejdou hlouběji
a setrvávají v systému delší dobu
: MF látky jen unáší
molekulová vylučovací chromatografie
(SEC, GPC, GFP, size exclusion chromatography)
molekulová vylučovací chromatografie
(SEC, GPC, GFP, size exclusion chromatography)
retenční čas [min]retenční čas [min]
retenční čas [min]retenční čas [min]retenční čas [min]retenční čas [min]
retenční čas [min]retenční čas [min] retenční čas [min]retenční čas [min]
retenční čas [min]retenční čas [min]
IP‐RPLC C18
pH = 2.6
IP‐RPLC C18
pH = 2.6
SECSEC
SCXSCXHILICHILIC
IP‐RPLC C18
pH = 10.0
IP‐RPLC C18
pH = 10.0
IP‐RPLC PFP
pH = 3.25
IP‐RPLC PFP
pH = 3.25
tryptická směs peptidů z fosforylázy Btryptická směs peptidů z fosforylázy B
3131
retenční/migrační čas (tR/tm)
: závisí na chemickém složení; AK sekvenci
známe‐li sekvenci, odhadneme retenční čas
: větší pravděpodobnost nalezení proteinu/peptidu
retenční/migrační čas (tR/tm)
: závisí na chemickém složení; AK sekvenci
známe‐li sekvenci, odhadneme retenční čas
: větší pravděpodobnost nalezení proteinu/peptidu
komplexnost vzorku, nízká množství proteinu, ionizace
 najdeme náš protein/peptid?
komplexnost vzorku, nízká množství proteinu, ionizace
 najdeme náš protein/peptid?
jak tR/tm odhadneme?
: numerické modelování (hard modelling)
: poloaproximační modelování (semi‐hard modelling)
:: SSRCalc, LCMSWARP, ScoreRidge, SVR
: aproximační modelování (soft modelling)
:: umělé neuronové sítě (ANN)
jak tR/tm odhadneme?
: numerické modelování (hard modelling)
: poloaproximační modelování (semi‐hard modelling)
:: SSRCalc, LCMSWARP, ScoreRidge, SVR
: aproximační modelování (soft modelling)
:: umělé neuronové sítě (ANN)
3232
predikce separačních vlastností na základě sekvencepredikce separačních vlastností na základě sekvence
molekulové deskriptory (polo‐aproximační modelování)
: délka peptidu, počet AK
: molekulová hmotnost (MW)
: hydrofobicita (HydroMCalc)
: hydrofobní moment (µH; HyperChem)
: logaritmus teoreticky vypočítaného rozdělovacího koeficientu
n‐oktanol/voda (logP; Molinspiration)
: van der Waalsův objem (VvdW)
: objem molekuly dostupný rozpouštědlu (VSA)
molekulové deskriptory (polo‐aproximační modelování)
: délka peptidu, počet AK
: molekulová hmotnost (MW)
: hydrofobicita (HydroMCalc)
: hydrofobní moment (µH; HyperChem)
: logaritmus teoreticky vypočítaného rozdělovacího koeficientu
n‐oktanol/voda (logP; Molinspiration)
: van der Waalsův objem (VvdW)
: objem molekuly dostupný rozpouštědlu (VSA)
optimální deskriptory pro ANN (chyba předpovědi tR 12 %)
: struktura ANN 27‐3‐1
: aminokyselinové složení
: délka peptidu
: logP
: hydrofobicita
: zadání 1. AK z N‐ a C‐ konce (rozdělení do 7 skupin)
optimální deskriptory pro ANN (chyba předpovědi tR 12 %)
: struktura ANN 27‐3‐1
: aminokyselinové složení
: délka peptidu
: logP
: hydrofobicita
: zadání 1. AK z N‐ a C‐ konce (rozdělení do 7 skupin)
3333
: chirální separace
:: cyklodextriny, makrocyklická antibiotika
: chirální separace
:: cyklodextriny, makrocyklická antibiotika
3434
: separace látek o různé afinitě k ligandu pomocí specifické interakce
:: de facto nejde o chromatografii
: separace látek o různé afinitě k ligandu pomocí specifické interakce
:: de facto nejde o chromatografii
ligandligand
protein 1protein 1
propláchnutípropláchnutí
eluceeluce
nástřiknástřik
protein 2protein 2
: ligand – analyt
:: enzym – substrát, inhibitor, koenzym
:: antigen – protilátka
:: polysacharidy – lektin
:: vnesená značka (tag)
:: His6, myc, TAP
: ligand – analyt
:: enzym – substrát, inhibitor, koenzym
:: antigen – protilátka
:: polysacharidy – lektin
:: vnesená značka (tag)
:: His6, myc, TAP
využití
: purifikace, izolace
(: studium komplexu ligand‐biomakromolekula)
využití
: purifikace, izolace
(: studium komplexu ligand‐biomakromolekula)
afinitní chromatografie
(AF, affinity chromatography)
afinitní chromatografie
(AF, affinity chromatography)
ligand – chelatační ligand (např. iminodiacetát; IDA) + iont kovuligand – chelatační ligand (např. iminodiacetát; IDA) + iont kovu
eluce
: Δ teploty, pH, iontové síly
:: roztoky solí, kyselin, zásad
: Δ permitivity prostředí (ε)
:: organická rozpouštědla
: specifickými činidly
:: volnými ionty kovu (GaIII+, FeIII+, NiII+, CuII+)
:: nízkomolekulárním ekvivalentem funkční vazebné skupiny
eluce
: Δ teploty, pH, iontové síly
:: roztoky solí, kyselin, zásad
: Δ permitivity prostředí (ε)
:: organická rozpouštědla
: specifickými činidly
:: volnými ionty kovu (GaIII+, FeIII+, NiII+, CuII+)
:: nízkomolekulárním ekvivalentem funkční vazebné skupiny
3535
izolace analytuizolace analytu
: účinná, elegantní; selektivní separace
: z velmi složitých směsí látek bez dalších čistících postupů
: účinná, elegantní; selektivní separace
: z velmi složitých směsí látek bez dalších čistících postupů
afinitní chromatografie s vázaným iontem kovu
(IMAC, ion metal affinity chromatography)
afinitní chromatografie s vázaným iontem kovu
(IMAC, ion metal affinity chromatography)
ligand – TiO2, FeTiO3, ZrO2 nebo Al(OH)3
: lewisovské kyseliny, které interagují s lewisovskými bázemi (‐PO4
–)
ligand – TiO2, FeTiO3, ZrO2 nebo Al(OH)3
: lewisovské kyseliny, které interagují s lewisovskými bázemi (‐PO4
–)
vazba
: za nízkého pH (2 – 3); zábrana nespecifické vazby
: další aditiva – AcN (50 – 80 %), mono‐ a dikarboxylové kyseliny
vazba
: za nízkého pH (2 – 3); zábrana nespecifické vazby
: další aditiva – AcN (50 – 80 %), mono‐ a dikarboxylové kyseliny
afinitní purifikace (enrichment)
: fosfoproteinů/fosfopeptidů
afinitní purifikace (enrichment)
: fosfoproteinů/fosfopeptidů
eluce : zvýšením pH (10 – 12)
: anorganické fosforečnany
: organické báze (piperidin, pyrrolidin)
eluce : zvýšením pH (10 – 12)
: anorganické fosforečnany
: organické báze (piperidin, pyrrolidin)
3636
afinitní chromatografie s vázaným oxidem/hydroxidem kovu
(MOAC, metal oxide/hydroxide affinity chromatography)
afinitní chromatografie s vázaným oxidem/hydroxidem kovu
(MOAC, metal oxide/hydroxide affinity chromatography)
ligand : konkanvaliny (např. ConA)
: lektiny (LCA čočkový, PNA arašídový, SBA sójový, WGA pšeničný,
UEA hlodášový)
: boráty
ligand : konkanvaliny (např. ConA)
: lektiny (LCA čočkový, PNA arašídový, SBA sójový, WGA pšeničný,
UEA hlodášový)
: boráty
3737
afinitní chromatografie pro glykosylované proteinyafinitní chromatografie pro glykosylované proteiny
rychlá chromatografie proteinů
(FPLC, fast protein liquid chromatography)
rychlá chromatografie proteinů
(FPLC, fast protein liquid chromatography)
spíše obchodní název fy Pharmaciaspíše obchodní název fy Pharmacia
rozdíly oproti HPLC
: stejné SF (mol. síta, iontoměniče, polární i nepolární)
: nižší tlaky – 3‐4 MPa vs. 10‐40 MPa
rozdíly oproti HPLC
: stejné SF (mol. síta, iontoměniče, polární i nepolární)
: nižší tlaky – 3‐4 MPa vs. 10‐40 MPa
analytanalyt
+ nečistoty+ nečistoty
magnetické kuličkymagnetické kuličky
vychytání
analytu
vychytání
analytu
odstranění
nečistot
odstranění
nečistot
eluce
analytu
eluce
analytu
odebrání
analytu
odebrání
analytu
magnetické kuličky (mag. beads)magnetické kuličky (mag. beads)
špičky (tips)špičky (tips)
čipy (chips)čipy (chips)
3838
jiné než kolonové systémyjiné než kolonové systémy
: přímá (in‐line)
:: přímý vstup do 2D z 1D
: nepřímá (off‐line)
:: dávkování sesbíraných frakcí 1D
: přímá (in‐line)
:: přímý vstup do 2D z 1D
: nepřímá (off‐line)
:: dávkování sesbíraných frakcí 1D
komplementarita rozměrů
(orthogonality)
komplementarita rozměrů
(orthogonality)
3939
vícerozměrné separace
podstatné zvýšení kapacity separace
: n1 x n2
podstatné zvýšení kapacity separace
: n1 x n2
migrační čas [s]migrační čas [s]
migrační čas [s]migrační čas [s]
dvě dimenze 
: 1D – IEF
: 2D – SDS‐PAGE
dvě dimenze 
: 1D – IEF
: 2D – SDS‐PAGE
denaturující gelová elfa
: SDS není v gelu už od polymerace (jako u 1D)
:: tvořily by se micely
: jako zesíťovací činidlo se užívá
:: piperazindiakrylyl (PDA)
:: diallyltartardiamid (DATD)
:: bisakrylylcystamin (BAC)
denaturující gelová elfa
: SDS není v gelu už od polymerace (jako u 1D)
:: tvořily by se micely
: jako zesíťovací činidlo se užívá
:: piperazindiakrylyl (PDA)
:: diallyltartardiamid (DATD)
:: bisakrylylcystamin (BAC)
thiosíran sodný v gelu snižuje pozadí při barvení stříbremthiosíran sodný v gelu snižuje pozadí při barvení stříbrem
4040
2D gelová elektroforéza
první rozměr
IEF
první rozměr
IEF
druhý rozměr
SDS‐PAGE
druhý rozměr
SDS‐PAGE
nutno chladit více než 1D (na 5 – 12 °C)nutno chladit více než 1D (na 5 – 12 °C)
po obarvení
: denzitometrie
: fluorimetrie
po obarvení
: denzitometrie
: fluorimetrie
vyžívá se i hustotní gradient (9 – 16 %)
ve spojených nádobách se míchá
: roztok bez zesíťovadla (B)
: roztok s max. koncentrací zesíťovadla (A)
na výtoku se formuje rostoucí gradient zesíťovadla
: profil gradientu se určuje tvarem nádob
nově také nelineární pH gradienty v IEF
vyžívá se i hustotní gradient (9 – 16 %)
ve spojených nádobách se míchá
: roztok bez zesíťovadla (B)
: roztok s max. koncentrací zesíťovadla (A)
na výtoku se formuje rostoucí gradient zesíťovadla
: profil gradientu se určuje tvarem nádob
nově také nelineární pH gradienty v IEF
migrační vzdálenostmigrační vzdálenost
optická hustota (%)optická hustota (%)
BB AA
4141
4242
: přímá
:: smyčky (průtočné, vypařovací), záchytové kolony
:: 1D pomalý, 2D rychlý
:: paralelní měření ve více 2D
: nepřímá
:: nezáleží na průtocích v 1D a 2D
: přímá
:: smyčky (průtočné, vypařovací), záchytové kolony
:: 1D pomalý, 2D rychlý
:: paralelní měření ve více 2D
: nepřímá
:: nezáleží na průtocích v 1D a 2D
kompatibilita
: rozpouštědlová
: průtoková
kompatibilita
: rozpouštědlová
: průtoková
[s]
[min]
RPLC
SCX
[s][s]
[min][min]
RPLCRPLC
SCXSCX
4343
2D kapalinová chromatografie
odplyňovačodplyňovač
odplyňovačodplyňovač
odplyňovačodplyňovač
čerpadlačerpadla
mísič
gradientu
mísič
gradientu
nástřiknástřik SCX kolonaSCX kolona
záchytová
kolonka
záchytová
kolonkaodpadodpadodpadodpad
dvoucestný
ventil
dvoucestný
ventil
RP kolonaRP kolona
14‐ti cestný
otočný ventil
14‐ti cestný
otočný ventil
odsolovací rozpouštědloodsolovací rozpouštědlo
MF pro RP (A a B)MF pro RP (A a B)
MF pro SCX (A a B)MF pro SCX (A a B)
čerpadlačerpadla
čerpadločerpadlo
4444
matricematrice
analytanalyt
nosičnosič
záchytová
kolonka
MAYI
záchytová
kolonka
MAYI
odpudivá 
vrstva
(RP, SCX)
odpudivá 
vrstva
(RP, SCX)
4545
dvě dimenze 
: 1D – IEC (SCX), RPLC, HILIC
: 2D – RPLC, HILIC
dvě dimenze 
: 1D – IEC (SCX), RPLC, HILIC
: 2D – RPLC, HILIC
příklady praktického využití
: IP‐RP(basic)–IP‐RP(acidic)–MS
: SCX–IP‐RP–MS
: HILIC–IP‐RP–MS
příklady praktického využití
: IP‐RP(basic)–IP‐RP(acidic)–MS
: SCX–IP‐RP–MS
: HILIC–IP‐RP–MS
nepolárnínepolární polárnípolární iontovéiontové
polarita SFpolarita SF
polárnípolární
iontovéiontové
NPLC
HILIC
NPLC
HILIC
RPLCRPLC IP‐RPLCIP‐RPLC
IECIEC
polarita MFpolarita MF
nepolárnínepolární
LP‐IEF–SCX–RPLC–MS
:: frakcionace (20 frakcí)
:: frakcionace (7 frakcí z každé LP‐IEF frakce)
:: separace (každé SCX frakce)
LP‐IEF–SCX–RPLC–MS
:: frakcionace (20 frakcí)
:: frakcionace (7 frakcí z každé LP‐IEF frakce)
:: separace (každé SCX frakce)
: zvláštní rozhraní
:: např. kapalinový spoj
: zvláštní rozhraní
:: např. kapalinový spoj
kompatibilita
: principiální
: rozpouštědlová
kompatibilita
: principiální
: rozpouštědlová
komplementarita rozměrů
(orthogonality)
komplementarita rozměrů
(orthogonality)
CZECZESECSEC
4646
spojené separační techniky
(hyphenated techniques)
spojené separační techniky
(hyphenated techniques)
: příprava proteinových izolátů
: frakcionace/separace proteinů a peptidů
: příprava proteinových izolátů
: frakcionace/separace proteinů a peptidů
příprava proteinového vzorku
cíle
: zachování čistoty, aktivity a obsahu pro následné metody
: definování vlastností vzorku a jeho akceptovatelných nečistot
:: vzhledem k výběru analytické metody
cíle
: zachování čistoty, aktivity a obsahu pro následné metody
: definování vlastností vzorku a jeho akceptovatelných nečistot
:: vzhledem k výběru analytické metody
prostředky
: komplementární preparativní techniky
: minimalizace manipulačních kroků
:: akumulace chyb, ztráty materiálu
: minimalizace kontaminování vzorku prostředky preparace
prostředky
: komplementární preparativní techniky
: minimalizace manipulačních kroků
:: akumulace chyb, ztráty materiálu
: minimalizace kontaminování vzorku prostředky preparace
4747
biologický systém → izolace → charakterizacebiologický systém → izolace → charakterizace
vstupy preparace
: zdroj vzorku přirozený nebo umělý systém exprese proteinů
: hostitel (přirozený systém)
:: baktérie, kvasinky, rostliny, transgenní organizmy
: proteinový obsah, kontaminace
: procesy lýze a čeření
: subcelulární (organelová) frakcionace
: selektivní srážení
:: oddělení různých materiálů
::: nukleových kyselin
::: proteinů
: zdroj vzorku přirozený nebo umělý systém exprese proteinů
: hostitel (přirozený systém)
:: baktérie, kvasinky, rostliny, transgenní organizmy
: proteinový obsah, kontaminace
: procesy lýze a čeření
: subcelulární (organelová) frakcionace
: selektivní srážení
:: oddělení různých materiálů
::: nukleových kyselin
::: proteinů
4848
základní postup preparace
: hrubá izolace (capture)
:: rychlé odstranění hlavních nečistot (a zakoncentrování)
:: adsorpční metody (IEC, AC)
: hrubá izolace (capture)
:: rychlé odstranění hlavních nečistot (a zakoncentrování)
:: adsorpční metody (IEC, AC)
: čištění meziproduktu (intermediate purification)
:: další odstraňování nečistot a zakoncentrování
:: jiné techniky než k hrubé izolaci (AC, HIC; odsolení SEC)
: čištění meziproduktu (intermediate purification)
:: další odstraňování nečistot a zakoncentrování
:: jiné techniky než k hrubé izolaci (AC, HIC; odsolení SEC)
: dočištění izolátu (polishing)
:: finální odstranění stopových nečistot (ředí vzorek!)
:: nejčastěji SEC, následné zakoncentrování (precipitace, UF)
: dočištění izolátu (polishing)
:: finální odstranění stopových nečistot (ředí vzorek!)
:: nejčastěji SEC, následné zakoncentrování (precipitace, UF)
třífázová purifikační strategie (CIPP)třífázová purifikační strategie (CIPP)
4949
kontrola postup preparace
sledování celkového obsahu proteinusledování celkového obsahu proteinu
sledování specifické aktivity enzymůsledování specifické aktivity enzymů
: nečistoty a okolnosti v první a druhé fázi mohou aktivitu inhibovat
:: teplota, proteolýza, oxidace, agregace atp.
: měří se jako specifická aktivita na celkový obsah proteinu
: nečistoty a okolnosti v první a druhé fázi mohou aktivitu inhibovat
:: teplota, proteolýza, oxidace, agregace atp.
: měří se jako specifická aktivita na celkový obsah proteinu
: jednoduchá separace vizualizuje nečistoty
:: denaturující PAGE
: jednoduchá separace vizualizuje nečistoty
:: denaturující PAGE
výtěžek
: celkový obsah proteinu
: celková specifická aktivita na celkový obsah proteinu
výtěžek
: celkový obsah proteinu
: celková specifická aktivita na celkový obsah proteinu
5050
příklad preparace enzymu
alkalická fosfatáza (ALP)
příklad preparace enzymu
alkalická fosfatáza (ALP)
: periplazmatický protein u E. coli
: defosforylace terminálních fosfátů u ligací DNA
: termostabilní, metaloprotein (Zn)
: periplazmatický protein u E. coli
: defosforylace terminálních fosfátů u ligací DNA
: termostabilní, metaloprotein (Zn)
vstupní materiál E. coli
: fosfátová „dieta“
vstupní materiál E. coli
: fosfátová „dieta“
specifická lýze buněk E. coli
: aplikace sacharózy (snižuje turgor v membráně, plazmolýza)
: aplikace lysozymu
:: centrifugace
::: oddělení rozpustného enzymu od zbytků buněk
:: dialýza na odstranění lyzačního pufru
: aplikace DNAzy
:: snížení viskozity
specifická lýze buněk E. coli
: aplikace sacharózy (snižuje turgor v membráně, plazmolýza)
: aplikace lysozymu
:: centrifugace
::: oddělení rozpustného enzymu od zbytků buněk
:: dialýza na odstranění lyzačního pufru
: aplikace DNAzy
:: snížení viskozity
5151
alternativní lýze buněk E. coli – osmotický šok
: aplikace sacharózy
: aplikace EDTA – zvýšení permeability membrány
: přenos do pufru s nízkou osmotickou silou
:: pouze periplazmatické proteiny
::: bez lysozymu, DNAzy a s nižší koncentrací sacharózy
::: méně kroků při čištění
alternativní lýze buněk E. coli – osmotický šok
: aplikace sacharózy
: aplikace EDTA – zvýšení permeability membrány
: přenos do pufru s nízkou osmotickou silou
:: pouze periplazmatické proteiny
::: bez lysozymu, DNAzy a s nižší koncentrací sacharózy
::: méně kroků při čištění
odstranění nečistot
: tepelná precipitace termolabilních bílkovinových nečistot
:: centrifugace sraženiny
: srážení proteinu (ALP) síranem amonným
:: odstranění nebílkovinných nečistot
:: dialýza na odstranění vysolovacího činidla
: aniontově výměnná chromatografie (SF – dietylaminoetyl)
odstranění nečistot
: tepelná precipitace termolabilních bílkovinových nečistot
:: centrifugace sraženiny
: srážení proteinu (ALP) síranem amonným
:: odstranění nebílkovinných nečistot
:: dialýza na odstranění vysolovacího činidla
: aniontově výměnná chromatografie (SF – dietylaminoetyl)
5252
určení výtěžku a kontrola průběhu
: stanovení celkového obsahu proteinu
:: metoda podle Bradfordové
:: denaturující PAGE
: stanovení enzymové aktivity
:: s umělými substráty (PNPP)
:: pNPP + H2O → pNP + Pi
:: spektrofotometrie při 405 nm a pH > 8
::: metoda konstantního času
::: metoda konstantní koncentrace
určení výtěžku a kontrola průběhu
: stanovení celkového obsahu proteinu
:: metoda podle Bradfordové
:: denaturující PAGE
: stanovení enzymové aktivity
:: s umělými substráty (PNPP)
:: pNPP + H2O → pNP + Pi
:: spektrofotometrie při 405 nm a pH > 8
::: metoda konstantního času
::: metoda konstantní koncentrace
5353
stabilita (rozpustnost) roztoku proteinu
: složení roztoku
:: soli, látky s nízkou polaritou (org. rozpouštědla), tenzidy
stabilita (rozpustnost) roztoku proteinu
: složení roztoku
:: soli, látky s nízkou polaritou (org. rozpouštědla), tenzidy
: okyselení roztoku
:: posun mimo pI
: tenzidy
:: nesmí překročit cMC (kritická micelární koncentrace)
:: membránové proteiny
: protokol zmraz‐rozmraz
:: rychlé zamražení na suchém ledu (3 min)
:: okamžité zahřátí na 42 °C za intenzivního míchání
:: opakuje se až 3x
: okyselení roztoku
:: posun mimo pI
: tenzidy
:: nesmí překročit cMC (kritická micelární koncentrace)
:: membránové proteiny
: protokol zmraz‐rozmraz
:: rychlé zamražení na suchém ledu (3 min)
:: okamžité zahřátí na 42 °C za intenzivního míchání
:: opakuje se až 3x
5454
: renaturace
:: odstranění těžkých kovů – chelatony
:: odstranění chaotropních solí – odsolení
:: anti‐chaotropní látky – močovina
:: obnovení disulfidických můstků – glutathion, cystein, cysteamin
: renaturace
:: odstranění těžkých kovů – chelatony
:: odstranění chaotropních solí – odsolení
:: anti‐chaotropní látky – močovina
:: obnovení disulfidických můstků – glutathion, cystein, cysteamin
: nežádoucí srážení
:: teplo, pH, vymrazení, vysolení, těžké kovy...
: nežádoucí srážení
:: teplo, pH, vymrazení, vysolení, těžké kovy...
5555
srážení proteinů při izolacisrážení proteinů při izolaci
: SEC – ředí vzorek, mění pufr
: IEC – zvyšuje iontovou sílu roztoku a mění pH
: HIC – snižuje iontovou sílu roztoku
: SEC – ředí vzorek, mění pufr
: IEC – zvyšuje iontovou sílu roztoku a mění pH
: HIC – snižuje iontovou sílu roztoku
hrubá izolace > čištění > dočištění
: AC > 0 > SEC/RPLC
: IEC > 0 > SEC/RPLC
: IEC > HIC >SEC
pro vysoce nepolární proteiny
: extrakce s SDS > 0 > SEC
: extrakce s SDS > HIC > SEC
hrubá izolace > čištění > dočištění
: AC > 0 > SEC/RPLC
: IEC > 0 > SEC/RPLC
: IEC > HIC >SEC
pro vysoce nepolární proteiny
: extrakce s SDS > 0 > SEC
: extrakce s SDS > HIC > SEC
5656
vliv separace na izolátvliv separace na izolát
účinné kombinace separačních postupůúčinné kombinace separačních postupů
metoda afinitní prekoncentrace peptidů a proteinů s nízkým obsahem
: ekvalizér – srovnání obsahů minoritních a majoritních složek
metoda afinitní prekoncentrace peptidů a proteinů s nízkým obsahem
: ekvalizér – srovnání obsahů minoritních a majoritních složek
ligandová knihovna – částice SF s kombinatorickou knihovnou ligandůligandová knihovna – částice SF s kombinatorickou knihovnou ligandů
1) „čistá“ částice SF je modifikována prvním ligandem; X typů ligandů
2) SF první/n‐té třídy je rozdělen na X dílů
3) každý X‐podíl je modifikován druhým/(n+1)‐vým ligandem
4) jdi na 2)
počet „knih“ : XX
1) „čistá“ částice SF je modifikována prvním ligandem; X typů ligandů
2) SF první/n‐té třídy je rozdělen na X dílů
3) každý X‐podíl je modifikován druhým/(n+1)‐vým ligandem
4) jdi na 2)
počet „knih“ : XX
vhodné pro afinitní separace
: proteinů a peptidů
(ligand – aminokyselina)
: nukleových kyselin
(ligand – nukleotid)
vhodné pro afinitní separace
: proteinů a peptidů
(ligand – aminokyselina)
: nukleových kyselin
(ligand – nukleotid)
vzorekvzorek
vazba
na ligandy
vazba
na ligandy
vymytí
nadbytku
vymytí
nadbytku
ekvalizovaný
eluát
ekvalizovaný
eluátligandová
knihovna
ligandová
knihovna
proteinový ekvalizér
protein equaliser beads
proteinový ekvalizér
protein equaliser beads
5757
komerční izolační soupravy
(protein isolation kit)
GST‐Bind™ Purification Kits
His‐Bind® Purification Kits
Magnetight™ Oligo d(T) Beads
MagPrep® Streptavidin Beads
Protein A and Protein G Plus Agaroses
S‐Tag™ Purification Kits
Streptavidin Agarose
T7‐Tag™ Affinity Purification Kit
ProteoSpin™ CBED (concentration, buffer exchange and desalting) Maxi Kit
: snadné odsolení a zakoncentrování
ProteoSpin™ Detergent Clean‐up Micro Kit
: odstranění detergentů
:: SDS, Triton® X‐100, CHAPS, NP‐40 a Tween 20
GST‐Bind™ Purification Kits
His‐Bind® Purification Kits
Magnetight™ Oligo d(T) Beads
MagPrep® Streptavidin Beads
Protein A and Protein G Plus Agaroses
S‐Tag™ Purification Kits
Streptavidin Agarose
T7‐Tag™ Affinity Purification Kit
ProteoSpin™ CBED (concentration, buffer exchange and desalting) Maxi Kit
: snadné odsolení a zakoncentrování
ProteoSpin™ Detergent Clean‐up Micro Kit
: odstranění detergentů
:: SDS, Triton® X‐100, CHAPS, NP‐40 a Tween 20 5858
C8022 Separační metody B
: jarní semestr
: elektromigrační metody, plynová chromatografie, separace makro‐
molekul, membránové separace, hmotnostní spektrometrie, valida‐
ce a optimalizace
C8022 Separační metody B
: jarní semestr
: elektromigrační metody, plynová chromatografie, separace makro‐
molekul, membránové separace, hmotnostní spektrometrie, valida‐
ce a optimalizace
C7021 Separační metody A
: podzimní semestr
: teorie separace, kapalinová chromatografie, preparativní separa‐
ce,  chirální separace
C7021 Separační metody A
: podzimní semestr
: teorie separace, kapalinová chromatografie, preparativní separa‐
ce,  chirální separace
C8980 + C8980c Příprava a charakterizace proteinů I 
‐ Exprese a purifikace
: jarní semestr
C8980 + C8980c Příprava a charakterizace proteinů I 
‐ Exprese a purifikace
: jarní semestr
C6260 + C6270 Metody separace proteinů
: jarní semestr
C6260 + C6270 Metody separace proteinů
: jarní semestr
5959