Ochranářská genetika Význam genetické variability pro efektivní druhovou ochranu DNA Msat paternita - barvy CRW_0001 kopie 2 DSCN4561 foto Jan Roleček MODULARIZACE VÝUKY EVOLUČNÍ A EKOLOGICKÉ BIOLOGIE CZ.1.07/2.2.00/15.0204 Ochranářská genetika („conservation genetics“) n nVyužití genetických metod v ekologii = molekulární ekologie nstudium genetické variability přírodních populací a faktorů, které ji ovlivňují nVyužití genetických metod v ochranářské biologii = ochranářská genetika nPCR (90. léta) – počátek skutečné ochranářské genetiky (neinvazivní metody - již není potřeba destruktivního vzorkování) nod r. 2000 - Conservation Genetics nrecentní review a knihy n ConsGenfig congen_kniha primer ConGen Frankham Úmluva o biologické rozmanitosti (CBD), Rio de Janeiro 1992 → ochrana biodiverzity na úrovni genů, druhů a ekosystémů Genetická diverzita je důležitou složkou biodiverzity Genetická rozmanitost – politicky důležitá (měla by být) q„Biological diversity is comprised of genetic differences within species, the diversity of species and the variety of ecosystems „ (The Convention on Biological Diversity, CBD) q q qTři úrovně biodiverzity: nGenetic diversity: between individuals and populations nSpecies diversity nEcosystem diversity q n The Convention on Biological Diversity (CBD) is founded on the principle that biological diversity is comprised of ―genetic differences within species, the diversity of species and the variety of ecosystems. In other words, genetic diversity is seen as one of the three levels that make up biodiversity, the other levels being diversity between species and ecosystems. 24 dostupných národních strategií genetická diverzita (GD) má být chráněna: 16 států (67 %) GD má být monitorována: 22 států (90 %) potřeba nástrojů pro monitoring GD: 5 států (21 %) (Laikre Concerv Genet 2010) Genetická rozmanitost: nejvíce přehlížená součást managementu ochrany biodiverzity PROČ JE VŮBEC GENETICKÁ VARIABILITA DŮLEŽITÁ ? Genetická variabilita jako ukazatel efektivní velikosti populace nneutrální genetická teorie: He=4Neµ/[4Neµ+1] n nmutation-drift equilibrium n nsrovnání různých populací a jejich Ne br05f01 Úvod Ne – effective population size nvelikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace novlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou inbreedingu atd. n nvývoj genetické variability v malých populacích závisí na Ne více než na N n nNe/N » 0.11 (Frankham 1995), ale velká variabilita n Důsledky poklesu Ne He=4Neµ/[4Neµ+1] Snížení pozorované variability (He) – nejčastěji neutrální markery (mtDNA, mikrosatelity atd.) Pokles adaptivní variability – snížení adaptivního potenciálu (tj. schopnosti přizpůsobovat se změně prostředí) Ne » 500-1000 = zajištění adaptivního potenciálu „Budoucnost je v genech ...“ •Změny prostředí (např. klima, patogeny, aj.) → přizpůsob se nebo zmiz! •Vysoká genetická variabilita znamená, že je zde více genetických variant, z nichž některé mohou být vhodné pro nové podmínky nPopulace s vyšší genetickou variabilitou mají „více losů v loterii“ (= adaptivní potenciál) n • • • • • • Dryas octopetala v Alpách, Německo. Photo: Steve Smith Low genetic diversity is also a problem for the future, because genetic variation can help populations adapt to new conditions. Currently, climate change is forcing species to adapt to new conditions, or else move away. Higher genetic diversity means there are more genetic alternatives that might be suited to the new conditions. In a way, possessing higher genetic diversity provides a population with more 'tickets in the lottery’ so that by chance, one of the gene variants will be suited to the new conditions. KTERÉ EVOLUČNÍ PROCESY VEDOU KE SNÍŽENÍ EFEKTIVNÍ VELIKOSTI POPULACE? Genetický (náhodný) drift Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA AA AA AA AA AA aa aa aa aa aa aa aa aa aa aa Bariéra toku genů, např. fragmentace biotopů AA AA AA AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA Aa Aa Aa Aa Aa Aa AA aa aa Snížení He a Ne Intenzita driftu závisí na velikosti populace 25 jedinců 100 jedinců POČÍTAČOVÉ SIMULACE VELMI VÝZNAMNÝ VLIV V MALÝCH POPULACÍCH !!! Odhady Ne nFST = 1/(4Ne.m +1) nrecentní přístup: coalescent theory methods nTMVP (Beaumont 2003) nCoNe (Anderson 2005) nMLNE (Wang and Whitlock 2003) nMSVAR (Beaumont 1999) nejméně 2 časové vzorky populace stačí 1 vzorek TMVP NA – ancestral Ne N0 – recent Ne - testuje i rozdíly NA a N0 - přesnější odhady pokud je více časových vzorků, ale stačí jen dva MLNE - zároveň s Ne odhaduje i m MSVAR - stačí jeden vzorek mikrosatelitových dat NA vs N0 Metodické přístupy n n 1) Populační genetika – efektivní velikost populace, tok genů, „bottleneck“, příbuznost, atd. ... neutrální variabilita (např. mikrosatelity) 2) Fylogeografie – historický původ populací a jejich fylogenetické vztahy, ESU ... většinou neutrální variabilita 3) Speciální přístupy – neinvazivní genetické metody, vztah genetické diverzity a životaschopnosti populací, experimentální „conservation genetics“, selektované znaky (adaptivní i škodlivé) 1) Populační genetika nstudium struktury populací nnejčastěji neutrální znaky - mikrosatelity nefektivní velikost populace Ne ntok genů (sex-specific) n„past bottleneck“ npůvod jedinců („assignement tests“) npříbuzenské křížení (inbreeding), atd. n„founder contribution“ n nBayesiánské analýzy (např. program nSTRUCTURE, GENELAND aj.) n- identifikace subpopulací („management units“), n- identifikace hybridů n- identifikace geografických bariér toku genů n A B C D Rhinolophus ferumequinum Stanovení ESU („evolutionary significant units“) a MU („management units“) Supplementary Fig2_100809.jpg K = 3 2) Fylogeografie npoužití fylogenetických metod na úrovni populací (nejčastěji sekvence mtDNA, jaderné markery jsou málo polymorfní) npůvod populací, jejich stáří a historické vazby ndetekce ESU („evolutionary significant units“) – lokální adaptace (mohou, ale nemusí) ndůležité pro reintrodukce br07f07 Př. Směry šíření z glaciálních refugií Clade A Clade B1b Clade B1a Clade B2 Clade C TANZANIA KENYA ZAMBIA MOZAMBIQUE MALAWI 1 4 2 5 7 8 10 9 6 12 11 13 14 15 16 18 17 20 19 29 21 22 23 24 30 28 27 26 25 3 Praomys delectorum - zřetelná severojižní struktura 18114 http://www.fmnh.org/tanzania/species_images/Results_P_delectorum_562_a.jpg 3) Speciální přístupy nškodlivá (detrimental) variabilita – detekce inbrední deprese nidentifikace adaptivní variability – lokální adaptace nexperimentální ochranářská genetika (zejména hmyz a rostliny) nneinvazivní genetické metody Inbreeding a fitness Stanovení výskytu příbuzenského křížení a jeho vliv na individuální fitness Příbuzenské křížení - inbreeding (Left) Absence of inbreeding: horizontal lines connect mates, vertical lines connect parents with … [Credits : Encyclopædia Britannica, Inc.] „outbreeding“ „inbreeding“ What does „inbreeding“ mean? nF – coefficients of inbreeding n nInbreeding because of population subdivision (FST) nInbreeding as nonrandom mating (FIS) nPedigree inbreeding (F) n n What does „inbreeding“ mean? nInbreeding because of population subdivision nnáhodné páření uvnitř subpopulací nodpovídá Wright´s Fst – měří inbreeding vzhledem k předpokládanému stavu, kdy by populace nebyla rozdělena increase of inbreeding because of population subdivision What does „inbreeding“ mean? nInbreeding as nonrandom mating njedinec je považován za inbredního pokud jeho rodiče byli více příbuzní než dva náhodně vybrají jedinci nFis = 1-Ho/He (odchylky z HWE) nmalé populace – i náhodné párování je mezi příbuznými ni jedna generace náhodného páření vrátí Fis na nulu What does „inbreeding“ mean? nPedigree inbreeding nF = pravděpodobnost že dva homologní geny jednoho jedince jsou „identical by descent“ n npokles heterozygotnosti v důsledku "identity by descent" n A1 A2 A1 A2 A1 A2 A2 A1 A1 A1 A1 A1 autozygous homozygous A2 A2 allozygous homozygous A2 A2 allozygous heterozygous A1 A2 shodné alely v původní populaci jsou "identical by state", ale ne "identical by descent" A1 Výpočet koeficientu inbreedingu z rodokmenu B D G A C E F = (1/2)N(1 + FCA) FG = (1/2)3(1 + 0) = 0.125 1)Jedinec G je identický svým původem (identical-by-descent) na 12.5 % genomu 2) 2) Očekávaná heterozygotnost jedince G je snížena v důsledku inbreedingu o 12.5 % N = počet jedinců ve smyčce FCA = inbrední koeficient společného předka Výpočet koeficientu inbreedingu z rodokmenu B D G I K A C E J F H F = (1/2)N(1 + FCA) FG = (1/2)3(1 + 0) = 0.125 FK = (1/2)3(1 + FG) FK = (1/2)3(1 + 0.125) = 0.141 Příbuzenské křížení - inbreeding nNárůst proporce homozygotů je výrazný v malých populacích - samooplození - bratr a sestra - bratranec a sestřenice A: zdravá forma genu a: forma genu způsobující nemoc Možné genotypy: AA Aa aa Outbreeding (= HWE): AA Aa Aa aa Inbreeding: AA AA aa aa nNárůst proporce homozygotů (odchylky od HWE) - efekt škodlivých recesivních alel n např. self-fertilization Potomstvo Aa = 1 AA + 2 Aa + 1 aa 50% ztráta heterozygotnosti během jedné generace Inbrední deprese nInbrední jedinci by měli mít nižší fitness (reprodukční úspěch nebo schopnost přežívat) n nEfekt škodlivých recesivních alel (nárůst homozygotnosti) nebo pokles adaptivní variability (pokles heterozygotnosti, např. MHC) n nZnámo většinou jen z laboratorního křížení (extrémní příklady) n nStudium v přírodě je obtížné n INBREDNÍ DEPRESE OCHRANÁŘSKÁ GENETIKA Stanovení intenzity inbreedingu a inbrední deprese v přírodních populacích Florida panther – fixace škodlivých alel ncryptochordismus, poruchy vývoje ocasních obratlů, srsti a spermií – téměř fixovány genetickým driftem npozitivní i negativní dopady introdukce teoreticky testovány (Hedrick 1995) nintrodukce osmi pum z Texasu („genetic rescue“) – v následující generaci bylo 20 % genetické informace z Texasu nocas – 7 % vs. 88 % nsrst – 24 % vs. 93 % ncryptochordism – 0 % vs. 68 % n nHybrid superiority (heterosis) – rychlé šíření introdukovaných alel Floridapanther Puma concolor coryi Puma concolor couguar Genetická záchrana http://rstb.royalsocietypublishing.org/content/368/1610/20120090/F3.large.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/dc/Benny_Trapp_Vipera_berus.jpg Vander Wal et al. 2012 http://www.bighorn.org/images/Suzan3.jpg http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/de/Mountain_lion.jpg „Purging“ nDruhy s výrazným snížením genetické variability - prošly „hrdlem lahve“ ngepardi - snížení genetické variability o více než 90 % npřesto se počty výrazně zvedly n„purging“ – odstranění škodlivých alel v důsledku zvýšené selekce na homozygoty Mirounga angustirostris Acinonyx jubatus 1. Inbreeding: AA AA aa aa 2. Selekce: AA AA aa aa 3. „Purging“: AA AA Extrémně výjimečné případy Genotyp a fitness jedince nPomocí analýzy paternity známe reprodukční úspěch jedinců (= fitness) n nLze tento úspěch vztáhnout k míře inbreedingu? n nJsou více inbrední jedinci málo úspěšní? n nJak určit stupeň inbreedingu? Nejlépe pomocí mikrosatelitů Stanovení inbrední deprese nproporční redukce fitness inbredního a outbredního potomstva fitness in "selfed" progeny fitness in "outcrossed" progeny Př.: Srovnání inbredních (F = 0.25) a outbredních domácích myší - inbrední mají 11% redukci velikosti vrhu, ale přežívání do dospělosti je v laboratoři je srovnatelné - ve venkovních oplocenkách je nicméně sníženo přežívání inbredních myší o 81% u samců a 22% u samic redukce velikosti vrhu redukce venkovního přežívání Inbreeding o intenzitě F=0.25 způsobuje 57% snížení fitness Jak měřit nakolik je jedinec postižen inbreedingem? Tedy jak příbuzní byli rodiče. nRodokmeny – z rodokmenů se usoudí, zda se kříží příbuzní n n nHeterozygotnost („heterozygosity-fitness correlations“) (průměrná heterozygotnost přes více lokusů) n Hedrick et al. Evolution 2001 Hitchings and Beebee J. Evol. Biol. 1998 Jak měřit nakolik je jedinec postižen inbreedingem? Tedy jak příbuzní byli rodiče. n n nSH - standardizovaná heterozygotnost vážení přes průměrnou heterozygotnost na lokusu n AA AA AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AB BB AA AB AB BC BC BC AC AC AC AC CD CD CD DD AD AD AD AD CC AA AA AA AA AB AB Lokus 1 HO 0.15 Lokus 2 HO 0.85 Korekce přes frekvenci heterozygotů na lokusu → standardizovaná (vážená) heterozygotnost Jak měřit nakolik je jedinec postižen inbreedingem? Tedy jak příbuzní byli rodiče. nRodokmeny – z rodokmenů se usoudí, zda se kříží příbuzní n nHeterozygotnost (průměrná heterozygotnost přes více lokusů) n nSH - standardizovaná heterozygotnost vážení přes průměrnou heterozygotnost na lokusu n nd2 rozdíl velikosti alel lze opět vážit (standardizovat) přes průměrné rozdíly Velikost alel a evoluce mikrosatelitů nidentita alel (stejné x různé) vs. rozdíl délek alel (počtu opakování) n nIndikují podobně dlouhé alely na jednom lokusu bližšího společného předka než alely rozdílných délek? n n n n n n n n n TCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT Rodiče nepříbuzní Rodiče příbuzní Teoretické mutační modely Dva extrémy nIAM – infinitive allele model (Při mutaci ztráta nebo získání libovolného počtu opakování. Vždy vzniká nová alela, která doposud v populaci nebyla) n n n n nSMM – stepwise mutation model (Mutace způsobeny pouze ztrátou nebo získáním jediného opakování motivu. Mutací může vzniknout alela, která je již v populaci přítomna) CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT d2 - Jak to měřit? n ia a ib jsou délky alel na lokusu i (v počtu repeatů) n lokusů Větší rozdíl v délce alel svědčí o menší příbuznosti předků jedince. n n Standardizace vydělením nejvyšší hodnotou (→ hodnoty 0 až 1) n mean Mean d2 nLze použít jen pokud platí stepwise mutation model (alely se liší jen počtem opakování motivu, např. u tetranukleotidového mikrosatelitu vždy přesně jen o násobky 4) n nNelze tedy u složených mikrosatelitů! Např. (CA)n(CAA)n n nNelze při výskytu „indels“ ve „flanking regions“ (delece a inserce v oblastech ohraničujících mikrosatelitový lokus) Jak měřit nakolik je jedinec postižen inbreedingem? Tedy jak příbuzní byli rodiče. nRodokmeny – z rodokmenů se usoudí, zda se kříží příbuzní n nHeterozygotnost (průměrná heterozygotnost přes více lokusů) n nSH - standardizovaná heterozygotnost vážení přes průměrnou heterozygotnost na lokusu n nd2 rozdíl velikosti alel lze opět vážit (standardizovat) přes průměrné rozdíly nIR internal relatedness („příbuznost“ dle alel na daném lokusu = shoda alel vážená přes frekvenci alely) nStejné alely na lokusu n n2 příčiny: n nIdentity by state IBS (stejný stav) nIdentity by descent IBD (stejný původ) n qPozoruji vždy identity by state q qZjištuji pravděpodobnost pro IBD q qJde o recentní IBD! Všechny alely mají společný původ, byť třeba hodně dávný. q qVzácnější alely od obou rodičů → IBD AC BD AB AD AA AD BE AB AE AA CF AA CA CA Identity by state Identity by descent AA AA AA AA AA AA AA AA AA AB AA AA AA AB BB AA AA AA AA Frekvence B 0,1 Frekvence A 0,9 Stejná alela na lokusu - korekce přes frekvenci alel na lokusu AA Sdílení alely A může být jen náhoda Sdílení alely B → větší pravděpodobnost, že si rodiče byli příbuzní IR internal relatedness nSdílení alely na lokusu n nVáženo přes frekvenci alely n nVzácnější alely mají větší váhu n n n n nH počet homozygotních lokusů N počet lokusů fi frekvence i-té alely n nProgram RELATEDNESS – Mac nMakro v Excelu (Amos et al. 2001) n Další měřítka individuální heterozygotnosti nHomozygosity by loci index (HL) (Aparicio et al. 2006) – vhodný při vyšších hodnotách heterozygotnosti (např. mikrosatelity) SH, IR a d2 navzájem korelovány Amos et al. 2001 nDataset: Tuleňi, kulohlavci, 3 druhy albatrosů n IR a SH Halichoerus grypus Diomedea exulans Thalassarche chrysostoma Thalassarche melanophrys Globicephala melas Parus caeruleus Foester et al 2003 n2452 mláďat, 5-7 mikrosatelitových lokusů, SH, IR, d2 n nSH a IR korelovány, d2 slabé korelace a nic nevysvětluje n nSH koreluje se zbarvením samců n nMimopároví otci qSousedi – větší a starší než podvedení samci qCizinci – zvýšení heterozygotnosti n Acrocephalus arundinaceus Hansson et al. 2001 nSilná filopatrie nJižní Švédsko, populace založena v roce 1978 n5 mikrosatelitových lokusů nd2, srovnání návratnosti sourozenců (největší úmrtnost v prvním roce) n nVrací se jedinci s vyšším d2 Rana temporaria ve Skandinávii Lesbarreres et al. 2005 n8 mikrosatelitových lokusů n nPřežívání mláďat pozitivně korelováno s heterozygotností n nStejný vztah ve 4 populacích n nHeterozygosity-fitness correlations („HFC“) skokan Emberiza schoeniclus Kleven & Lifjeld 2005 n9 mikrosatelitových lokusů n nSH a d2 n nSamci úspěšní v mimopárových kopulacích x podvedení samci n nMláďata z mimopárových kopulací x párová mláďata n nŽádný rozdíl v heterozygotnosti a d2 ES SH a inbreeding Slate et al. 2004, Pemberton 2004 nJak dobře heterozygotnost měří inbreeding? n n101 mikrosatelitových lokusů u 590 ovcí n nVztah existuje, ale je překvapivě slabý n nPokud možno → použít raději rodokmeny Simulace a lidé Balloux et al. 2004 nKorelace silné až při ~200 lokusech n nSlabá korelace mezi heterozygotností na různých lokusech (400 markerů v různých lidských populacích, 1000 jedinců z 52 populací) n nPozitivní výsledky znamenají pravděpodobněji: n qvazbu na konkrétní lokusy pod selekcí q qExtrémní případy – např. silná polygamie, výrazná strukturovanost populace n Problémy nPublikační zkreslení (publication bias) Negativní výsledky se většinou nepublikují. nDostatečná data (počet lokusů a jedinců) n nOdhad celkové heterozygotnosti n qCelková heterozygotnost („general effect“) q qVazba na konkrétní lokusy („local effect“) q qPři použití alozymů i přímý efekt studovaného lokusu q nNejednoznačný vztah genetické variability a fitness q n n Závěry nHeterozygotnost jako odhad inbreedingu může fungovat hlavně v extrémních případech n nJinak hrozí, že i stovky lokusů neukážou skoro nic n nJe třeba odlišit vliv celkové heterozygotnosti od vlivu jednotlivých genů n nNejvhodnější mírou se zdá být IR nebo HL n Adaptivní variabilita nrozdílná prostředí → diverzifikující selekce → lokální adaptace (např. obrana proti lokálním patogenům, potravní vztahy, klimatické podmínky atd.), nOutbrední deprese a)Intrinsic – genetická inkompatibilita (Dobzhansky-Muller incompatibility – epistatické interakce mezi alelami více lokusů) b)Extrinsic – narušení lokálních adaptací n NEMÍCHAT HODNĚ VZDÁLENÉ POPULACE !!! Příklad outbrední deprese – kozorožec alpský (Capra ibex ibex) n1922 – záchrana kozorožců v Gran Paradiso NP a pokus o vytvoření záložní populace v Tatrách nv tomto programu použity i zvířata ze Sinaje (Capra ibex nubiana) a z Egypta (Capra aegagrus) – snadná produkce F1 hybridů nhybridi měli říji na podzim (ne v zimě), mláďata se rodila v únoru a celá populace brzy vymřela n http://3.bp.blogspot.com/-vaZUthXHbm0/T13pXBB4tHI/AAAAAAAAADk/lS4gfKQak2g/s400/Capra+ibex_1.jpg Experimentální ochranářská genetika nrekonstrukce historických procesů v laboratoři ntestování hypotéz nztráta genetické diverzity v malých populacích nsíla selekce a genetického driftu v malých populacích nvýznam environmentálního stresu na expresi funkčních genů nefekt inbreedingu na přežívání napod. n nmodelové organismy – převážně hmyz a rostliny Př.: Vztah inbreedingu a teploty Vermeulen and Bijlsma, Heredity 2004 Drosophila melanogaster Experimentální ochránářská genetika METODY ZÍSKÁVÁNÍ DAT Non-invasive genetic methods in conservation genetics nby definition „conservation of rare and endangered animals“ – not possible to kill or even disturb them nneed of methods allowing collection of genetic data without direct contact Ønon-invasive genetic methods medvedí trus otter_orezana Msat paternita - barvy Tři metody získávání vzorků pro DNA analýzy 1. Destruktivní – zvíře je zabito pro získání vzorku tkání pro genetickou analýzu • • 2. Nedestruktivní (invazivní) – zvíře je odchyceno, invazivně odebrán vzorek tkáně (prst) nebo krve n n 3. Neinvazivní – zdroj DNA je ponechán za zvířetem a může být sbírán bez nutnosti odchytit nebo ho jinak rušit Orig. V. Bartuška Použití neinvazivních metod nskrytě žijící zvířata – jednoduše získatelné vzorky (trus, chlupy, ...) nvzácné, ohrožené a chráněné druhy – trus, moč – žádné restrikce např. CITES nminimální vliv na chování zvířat – použitelné při studiu chování (prostorová aktivita atd.) Zdroje DNA - trus Sběr vzorků Třeboňsko 15 medvedí trus trus (buňky střevní sliznice) → „molecular scatology“ papio tursiops ursusarctos Dugong vlk vydra1 vydry kamzíci IMG_6028 Zdroje DNA – chlupy svišť medvěd rys srnec nvlasový folikul („kořínek“) nspeciální lepidlové pasti, ostnatý drát nahled-medved-hnedy-20016 srnec-obecny-5220 rys-ostrovid-3168 Zdroje DNA – peří tetřev (Tetrao urogallus) - opět folikul – „kořínek“ jednotlivého pera - lepší vytržené pero (= pasti) než vypelichané pero (často velmi staré) tetrivek Aquila orel královský (Aquila heliaca) tetřívek (Tetrao tetrix) tetrev-hlusec-3178 Zdroje DNA - ostatní nmoč – vzácně (Hausknecht et al. 2006 and references therein) nvíce materiálu než trus (frekvence močení je 6 x vyšší než defekace) nvlci – 33 vzorků s měřitelnou DNA koncentrací – 14 (42%) shodných výsledků pro všechny analyzované znaky vlk nsvlečená kůže – plazi nptačí skořápky nbuňky bukální sliznice u vývržků potravy n svlecka1 ... umělá „bug-eggs“ - krevsající ploštice Triatominae (Heteroptera) - hodnocení úrovně stresu - použitelná jako „méně invazivní“ metoda v ochranářské genetice Becker et al. 2006 Postup analýzy DNA, např. ze vzorků trusu vzorkování čerstvého (≤ 18 hod.) materiálu (96% etanol, SilicaGel aj.) ê izolace DNA (komerční kity pro vzácnou DNA) ê PCR (vysoce kvalitní enzymy) - stačí jedna buňka s DNA analýza variability syntetizovaného úseku ê zber vzoriek2 cycler Msat Lutra 1 sekvence Nevýhody a jejich řešení -nízká kvalita/kvantita DNA - nízká úspěšnost zjištění správného genotypu a vysoké riziko kontaminací n Øvyloučení genotypizačních chyb a snížení rizika kontaminace Ø Ø Ø Ø Ø Øidentifikace faktorů pro úspěšnou analýzu Ø biohazard spicka Increase of genotyping success rate nmulti-samples, multi-extracts (Goosens et al. 2000) nPCR - multiple-tubes approach (Taberlet et al. 1996) ncost and time-consuming npilot studies are reasonable Dolphins - tissues vs. fresh faeces 100% probability of obtaining at least two correct genotypes when analysing 8 samples (Parsons 2001) Genotyping errors I. nallelic drop-out nvery low concentration of DNA in samples - only one allele in heterozygotes is amplified n Heterozygote 100/104 (8 different PCRs) nmultiple tube approach n nstatistical correction n Genotyping errors II. nfalse alleles nPCR artefacts – rarely replicated when using „multiple-tubes“ approach x gorilla Clostridium nco-amplification of microbial DNA from faeces (Bradley & Vigilant 2002) – confusions with „real“ alleles Homozygote 100/100 (8 different PCRs) Zvýšení koncentrace DNA npre-amplifikace (Bellemain & Taberlet 2004) n nqPCR (Morin et al. 2000, Zemanová et al., submitted) n Log DNA concentration (pg) Positivní PCR Allelic dropout Genotypizace pouze „dobrých“ vzorků Multiplex preamplifikace všech lokusů – zvýšení koncentrace mikrosatelitové DNA CACACA CACACA Semi-nested PCR pro 1-3 lokusy Effect of locus Degraded DNA → amplification of short fragments is preferred Median allele size (bp) (Buchan et al. 2005) papio chimpanzee elephant Influence of diet on faecal DNA amplification npoorly known nMurphy et al. 2003 – brown bears nsalmons in the diet – significant decrease of amplification success nherbivores – better results than carnivores bear eating fish Vliv typu vzorku a teploty nvydry – masožravci specializovaní na ryby nvliv typu vzorku: výlučky análních žláz (82%) vs. trus (34%) u zmraženého trusu nvýrazný vliv teploty - velmi rychlá degradace DNA v teplém prostředí n výlučky análních žláz trus vydra_vyvalena Effect of PCR inhibitors (faeces) nmany inhibitors in faeces (products of digestion, chemicals in plants) – addition of special reagents (BSA), hot-start etc., dilution of template etc. DNA from faeces → no PCR DNA from tissues → PCR is OK Mix both extracts PCR is OK → problem with DNA quality or quantity no PCR → problem with inhibitors High contamination risk navoiding of „laboratory“ contamination (tips with filters, separated pre- and post-PCR laboratories, UV sterilisation, etc.) n„mixed samples“ – problems in social species (communal latrines, marking in fixed sites) or in sampling at broad intervals („hair traps“) – usually identified by 3 or more alleles/sample; problem in species with low genetic variability nprimates – contamination with human DNA biohazard spicka Tracking of the endangered Pyrenean brown bear population nhair and faeces n24 microsatellite loci none yearling, three adult males, one adult female nspatial activity nsuggestions for conservation management bear2 Taberlet et al. 1997, Molecular Ecology Příklady: IDENTIFIKACE DRUHŮ (DNA barcoding) n cytochrom b (mt DNA – mnoho kopií v jedné buňce) – 189 bp PCR produkt (100% úspěšnost amplifikace ze vzorků trusu n n štěpení restrikčními enzymy: n vydra 80 a 189 bp n norek 101 a 189 bp n tchoř 127 a 189 bp portrét norka P1050829upr Image:Ilder.jpg Identifikace druhů – „DNA barcoding“ Forenzní analýzy nnelegální lov a obchod nrostoucí obchod s vydřími kožešinami v Asii (Kambodža, Indie, Čína, Nepál, Rusko; Kruuk 2006, Yoxon 2007, IOSF) otter3 Hairy-Nosed Otter skin and traps suppled by the middleman trader to a hunter in Tonle Sap, Cambodia Five hairy-nosed otter skins, one young smooth-coated otter (top left) and an Asian small-clawed otter (top) Lhasa_otter_skins Jezevčí chlupy v luxusních holicích štětkách n4 štětky z 8 pocházely z jezevce lesního n3 z nich z Holandska, kde je ilegální "držet, prodávat, transportovat nebo používat ke komerčním účelům mrtvé jezevce lesní nebo produkty z nich odvozené" arctonix_collaris badger Jezevec lesní (Meles meles) Jezevec bělohrdlý (Arctonyx collaris) x nDomingo-Roura et al., Biological Conservation (2006) Identifikace druhů tiger0011.jpg 5d traditional Chinese medicine DSC01868 tbw nidentifikace chráněných druhů v různých produktech (např. tygři vs. asijská medicína) nanalýzy mtDNA – velrybí maso legálně prodávané v J Korei a Japonsku – i chráněné druhy velryb, delfíni, sviňuchy, ale i ovčí a koňské maso (Baker et al. 1996, 2006) In this image made from video released by Karl Amman, a wildlife photographer and investigator into the illegal trade in animals, poachers skin a forest elephant for its meat and tusks in the Bungui forest, in the Central African Republic Thursday, May 3, 2007. Most people believe international demand for ivory is the biggest threat to elephants. But while wildlife experts are meeting in the Netherlands through June 16 to discuss the ban on the ivory trade, forest elephants, perhaps the most endangered elephant species in the world, are being hunted to extinction not only for their tusks, but for their meat. From AP Photo by Karl Amman. UK to grant China ivory trade license 0002 tusks-721423 Ivory_trade_seized%40large nmonitoring ilegálního obchodu se slonovinou (Comstock et al. 2003, Wasser et al. 2004), identifikace „bush-meat“ – nelegální lov velkých savců v Afrike (Malisa et al. 2006) Příklady: IDENTIFIKACE POPULACÍ A JEJICH VZÁJEMNÝCH VZTAHŮ Vydra říční ve střední Evropě n nsilný pokles početnosti v minulém století nfragmentace populací nCíle: nodhad populační početnosti ze vzorků trusu npopulačně-genetická analýza – stanovení bariér toku genů, Ne, "bottlenecks" atd. n vydraVasek2_orezana_zelena vydra3 mapaCS_modraKev2004 kopie stable rare Czech Republic Austria Slovakia Hungary Poland 1. BARIÉRA MEZI ČESKOU A SLOVENSKOU POPULACÍ Hájková et al. 2007, J. Zool. Vydra říční ve střední Evropě n nsilný pokles početnosti v minulém století nfragmentace populací nCíle: nodhad populační početnosti ze vzorků trusu npopulačně-genetická analýza – stanovení bariér toku genů, Ne, "bottlenecks" atd. n vydraVasek2_orezana_zelena vydra3 mapaCS_modraKev2004 kopie stable rare Czech Republic Austria Slovakia Hungary Poland 2. VÝRAZNÉ SNÍŽENÍ Ne ZHRUBA PŘED TŘICETI LETY (od té doby nárůst české populace) Hájková et al. 2007, J. Zool. Vydra říční ve střední Evropě nsilný pokles početnosti v minulém století nfragmentace populací nCíle: nodhad populační početnosti ze vzorků trusu npopulačně-genetická analýza – stanovení bariér toku genů, Ne, "bottlenecks" atd. n vydraVasek2_orezana_zelena vydra3 mapaCS_modraKev2004 kopie stable rare Czech Republic Austria Slovakia Hungary Poland 3. INTRODUKOVANÍ JEDINCI NA SEVERNÍ MORAVĚ NEPOCHÁZEJÍ Z ČESKÉ ANI SLOVENSKÉ POPULACE Hájková et al. 2007, J. Zool. Hybridizace – sekundární kontakt dvou populací Zemanová et al., submitted Tatry IMG_6038 © J. Ksiažek convert convert convert R. r. tatrica R. r. rupicapra Tatry Nízké Tatry Vel. Fatra Slovenský ráj Structure, K = 2 Structure, K = 3 BAPS, K = 3 Hybridizace – sekundární kontakt dvou populací Zemanová et al., submitted Příklady: IDENTIFIKACE POHLAVÍ Identification of sex nsexual structure of population ngenetically determined sex nmarkers: mammals – SRY, amelogenin; birds – CHD nspecies-specific markers must be used (otherwise cross-amplification with species in the diet) gorila4 bear3 odocoileus x Murphy et al. 2003 Příklady: IDENTIFIKACE JEDINCŮ Identification of individuals nmultilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P(ID)) (Waits et al. 2001) n Number of loci (H=0.6) Random Sibs npilot studies with tissue samples are required to identify P(ID) in a studied population Identifikace jedinců nprostorová aktivita n vydra_snezna Identifikovaní jedinci - Hornád, NP Slovenský Raj mapa_komplet_orezana SR 1 SR 2 SR 3 SR 4 SR 5 SR 6 SR 7 SR 8 SR 9 SR 10 1 km vydra1 vysek02 kopie_orezana Ind. SR 3 otter_otocena_hneda 5. 4. 2003 4. 11. 2003 10. 11. 2003 11. 11. 2003 30. 12. 2003 500 m Hornad Prostorová aktivita v horském prostředí Non-invasive CMR studies nVelikost populace n„Capture-Mark-Recapture“ (review in Lukacs & Burnham 2005) nOpakované vzorkování stejného zvířete nPřežívání, populační dynamika atd. nClosed population models, open population models, Robust design models nKorekce na genotypizační chyby nTrus – analýza individuální variability v potravě (př. kojoti - Fedriani & Kohn 2001) n kojot Populační dynamika kojotů (Prugh et al. 2005) Brown bears (Ursus arctos) in Scandinavia (Hakon Solberg et al. 2006, Biological Conservation) grizzly nobservations – underestimate numbers nnon-invasive CMR is cheaper and more precise than helicoptere census CMR CMR Diet of the extinct Ground Sloth (Nothrotheriops shastensis) nPoinar et al. (1998) – Science n20 000 years ago nchemical modification of DNA in ancient faeces before PCR nidentification of species and phylogeny to modern mammals ncpDNA – diet of the Ground Sloth BUDOUCNOST OCHRANÁŘSKÉ GENETIKY Praktické problémy ochranářské genetiky nmladé odvětví = mnoho problémů n nvýznam genetické variability pro životaschopnost populací => experimentální ochranářská genetika n nextrémní neznalost adaptivní variability u volně žijících druhů (rychle se mění v souvislosti s technologickým vývojem) vydra face taurotragus_1 Next Generation Sequencing Genome Transcriptome Proteome DNA mRNA Proteins Transcription Translation Genomics Transcriptomics Proteomics GP_FA7TYN03040706_inv 3 billion bases 20-30,000 genes ~100,000 proteins Functional Genomics nExprese jednotlivých genů – quantitative real-time PCR n - známý kandidátní gen (modelové druhy) n nExprese mnoha genů najednou (genomic scale) - microarray n - identifikace kandidátních genů – detekce jejich exprese může podat důležitou informaci o jeho funkci (různá v odlišném prostředí, vývojovém stadiu, stresu atd.) Transkriptomika , and it basically consists of a small glass slide containing samples of many genes arranged in a regular pattern Praktické problémy ochranářské genetiky nmladé odvětví = mnoho problémů n nvýznam genetické variability pro životaschopnost populací => experimentální ochranářská genetika n nextrémní neznalost adaptivní variability u volně žijících druhů n nidentifikace ochranářských jednotek na základě genetických dat → praktická ochrana n vydra face taurotragus_1 CONGRESS (2010-2013) Conservation Genetic Resources for Effective Species Survival Conservation Genetic Resources for Effective Species Survival Conservation Genetic Resources for Effective Species Survival FP7-ENV-2009-1, Coordination and support action