Replikace nukleových kyselín • Replikace = tvorba replik (kopií) molekul nukleových kyselin zajišťující přenos genetické informace z DNA do DNA nebo RNA do RNA • (z mateřské molekuly se vytvářejí dvě identické molekuly dceřiné) i Charakteristické rysy replikace dvouřetězcové DNA 1. Probíhá semikonzervativním způsobem 2. Probíhá semidiskontinuálně Replikou = oblast nukleové kyseliny, která se replikuje z jednoho počátku replikace (ori) Tři možné způsoby replikace DNA Semikonzervativní Konzervativní Rodičovská DNA DNA po první replikaci Disperzní JL < 1 DNA po druhé generaci Semikonzervativní způsob replikace dsDNA 4 Důkaz semikonzervativní replikace DNA (Meselson a Stahl 1958) Q E.coli cells are grown on l5N for several generations. 14N Control Cells are then transferred to medium containing 14N for one generation. _1_ Generation 0 DNA is extracted and , — analyzed by CsCI density gradient centrifugation. Control Direction of zi>»-sedimentation o DNA is extracted and analyzed. Generation 1 Q For two generations. Í ) f * Generation 2 DNA is extracted , ..... and analyzed. Q For three generations. rS rS rS rS DNA is extracted and analyzed. Generation 3 14N/ 15N O 1,70 g/cm3 1,75 Zkumavka s roztokem CsCI Semidiskontinuální syntéza řetězců při replikaci New DNA Opožďující se řetězec - syntetizuje se diskontinuálně Vedoucí řetězec - syntetizuje se kontinuálně Směr pohybu replikační vidlice 3' 5' Paren la I DNA Předpoklady a požadavky pro replikaci nukleových kyselin 1. Templát (matricový řetězec) = mateřská molekula 2. Primer = krátký oligoribonukleotid s volným 3'OH koncem (volná 3'OH skupina nukleoltidu) 3. Enzymy katalyzující připojování nukleotidů (polymeráza, primáza, ligáza) 4. Nukleotidy (dNTP) 3' -ATCCGTGCTGCTTGCTTGAATACC 5UAGGCACGA-3 0H---► \ RNA-primer nově syntetizovaný řetězec Syntéza DNA při procesu replikace -koner. rete? o "0-P=0 o o. nove syntetizovaný řetězec O o - p=o I Q ,o OH 3'-konec řetězce O O -0-P-0-P-0-P-0-CH2^0. I I * I O" O" o _I difosfát HO IIIIMHIIllUIWI O CH, deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce dNTP o 0=P-cr O templátový řetězec XT CH2 i 0 1 0=P-Cr ó Íl 'O" CH2 O 0= P-O" O N—CH o Y"2 0 0=P-0" 1 o CH, O' O t o=p-o_ I o G řetězce Směr syntézy polynukleotidového řetězce r) i 0 o-p=o 1 0" 5'CH2 H^^H 0 H 0-P=0 1 0" 5'CH, ► OH H 5'" fosfátový konec Rostoucí řetězec Volný 3-hydroxylový ikonec 0 if o o *«-* II í O-P-O-P-O-P-0 61 I. o o 5'tH OH H Napojující s-e nukleozidtrifosfát 3 báze Enzymy kooperující pří replikací a jejích funkce 1. DNA-polymerázy a DNA-primáza: katalyzují polymerizace NTP 2. DNA-helikázy, DNA-topoizomerázy: odstranění helikálního vinutí dsDNA otevření DNA-helixu 3. SSB - proteiny: stabilizace jednořetězců 4. Iniciátorové proteiny: vazbou na ori katalyzují vytvoření replikační vidlice Počátek replikace = ori specifická sekvence na DNA (dnaA box) 9 TABLE 5.01 Proteins Involved in DNA Replication in E. coli Protein Gene Function DnaA ■ dnoA Initiation of chromosome division; binds to the origin replication Hel i case dnoB Unwinds the double helix DnaC dnaC Loading of DNA helicase SSB ssb Single strand binding protein Primase dnaG Synthesis of RNA primers RNase H rnhA Partial removal of RNA primers Pol 1 polA Polymerase 1; fills gaps between Okazaki fragments Polymerase III DNA polymerase III holoenzyme et dnaE strand elongation e dnaQ kinetic proof-reading e ho\E unknown; part of core enzyme ß dnaN sliding clamp T dnaX dimerization of core enzyme Y dnaX loading of sliding clamp 5 holA loading of sliding clamp w holB loading of sliding clamp X ho!C loading of sliding clamp ¥ holD loading of sliding clamp DNA Ligase k Seals nicks in lagging strand DNA Gyrase Introduces negative supercoils a gyrA Makes and seals double strand breaks in DNA ß gyrB ATP-using subunit Topoisomerase IV Decatenation A parC Makes and seals double strand breaks in DNA B parE ATP-using subunit Charakteristika aktivit DNA-polymeráz • DNA-dependentní-DNA-polymerázy 1. Polymerizace nukleotidů ve směru 5' -3' 2. Odštěpování nukleotidů a) 5'-3'exonukleázová aktivita b) 3'-5'exonukleázová aktivita Odbourávání DNA (exonukleázová aktivita) Polymerizace DNA -► b) a) ■■■■■■■■■ ■■■■■■■■■ 5' 3' AGTC TCAG 3' 5' 11 ..t' Y' e _ katalytické jádro dimer DNA-polymerázy III {Pol III*) a y-ka Y-komplex I15)'' sviracl svíraci protein protein (P-protein)(p.protein) holoenzym DNA-polymerázy I Obr. 128 Sestavovaní holoenzymu DNA-polymerázy III a-monomer, který katalyzuje poly-meraci. Monomer a se vyznačuje již slabou polymerační aktivitou o rychlosti polymerace 8 nukleotidu/s. Nemá však exonukleázovou aktivitu; e-monomer vyznačující se klMi-exo-nukleázovou aktivitou; 0-monomer, který stimuluje účinek e-exonukleáz; y-monomer váže ATP; Ô-monomer se váže na p; ô'-monomer stimuluje účinek monomeru p; %-monomer, na který se vážou proteiny SSB; ^-monomer tvoří most mezi % a y. primer strand © o o -OH- dttlbHH Wět f A A A A A A template strand rare tautomeric form of C tC*[ happens to base-pair with A and is thereby incorporated by DNA polymerase into the primer strand TTTTi PXPÄPBŕÄPÄeJLP. A A A A A-A AAA rapid tautomeric shift of C* to normal cytosine (C) destroys its base-pairing with A unpaired 3'-0H end of primer blocks further elongation of primer strand by DNA polymerase QGGOGGOG AAA A A A: A A A <3É OH- 3'-to-5' exonuclease activity attached to DNA polymerase chews back to create a base-paired 3'-OH end on the'primer strand T T T T AAA AAAAAA □ NA polymerase continues the process of adding... nucleotides to the base-paired 3'-OH end of the primer strand T T T T T tPjřPXPSP^OH 0^ Korektorská aktivita DNA-polymerázy 3'—► 5' exonukleázová aktivita počet chybně zařazených nukleotidů = 1/107 výsledný počet chybných bází = 1/109 Proč je DNA syntetizována jen ve směru 5 Makroergní vazby QQp) (g) © (p) (p) (p) (^7 hypotetický 1 růst ve směru u u n skutočný růst vesměru 5' 3' (pXEXp) (p)(p)(p)(p)(p)(p)(p)(p)( y u 1 yu u u 1u U u OPRAVA 5' -konec vytvořený 5' 31 3' -konec vytvořený po odstranění ^ 7^ j^ľ ^ ^ ^ ^ 7 po odstranění jednoho nukleotidu ^ ^ \ jednoho nukleotidu opravným pochodem Q opravným pochodem správný deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce CpXp) správny deoxyribonukleosidtrifosfát vstupující do reakce (p) (g) (p) (g) (g) (p) 0 IpTT Reakce neprobíhá, protože není k dispozici makroergní vazba, která by se štěpila Makroergní vazba je rozštěpena, čímž se získá energie pro polymeraci DNA-ligázy 5'3 W 1 DNA-ligáza (ATP) OATP + dNMPn + dNMPm = AMP + PPan +dNMPn + m DNA-ligáza (NAD+) ONAD+ + dNMPn + dNMPm = AMP + nAMN + dNMPn + m 15 Dvousměrná replikace kružnicové chromozómové dsDNA prokaryot Asymetrie replikační vidlice ori Syntéza vedoucího a opožďujícího se řetězce při replikaci bakteriálního chromozomu Struktura počátku replikace (oriC) u E. coli -245 bp SM L, M, R jsou 13 bp-sekvence GATCTNTTNTTTT 1, 2, 3, 4 jsou 9 pb-sekvence TTATNCANA AT = neopakující se sekvence GATCTNTTNTTTT TTATNCANA % opakované sekvence 4 opakované sekvence X o 13 nukleotidech o 9 nukleotidech, Ni^ místa vazby N\N iniciačního proteinu^' Minireplikon Předprimerová fáze replikace DNA v oriC u E. coli or/C _A_ opakované sekvence 13 bp opakované sekvence 9 bp / \\ // W Protein DnaAse váže na čtyři opakované sekvence 9 bp v místě or/C. protein DnaA Y %J Kooperativní vazbou dalších molekul proteinu DnaA vzniká komplex s místem oriC na svém povrchu. 19cxxxx) ■ komplex proteinu DnaA oddělení vláken začína v opakovaných sekvencích 13 bp Protein DnaB (DNA-helikáza) a DnaC se připojují k iniciačnímu komplexu a vytvářejí replíkační bublinu. protein DnaB helikáza) replikační bublina protein DnaC 19 Fungování proteinů DnaA, DnaB a DnaC při iniciaci replikace v oriC DnaA se váže na čtyři 9 bp repetice DNA se ohýbá a začíná se rozmotávat v místě tří 13 bp repeticí - zde se pak vážou DnaB a DnaC, což vede k vytěsnění DnaA a rozmotá se celá oblast bohatá na AT páry. DnaB (helikáza) vytváří dvě replikační vidlice -každou v jednom směru 20 or/C _A_ opakované sekvence 13 bp opakované sekvence 9 bp / W // W Protein DnaA se váže na čtyři opakované sekvence 9 bp v místě oriC. protein DnaA %f Kooperativní vazbou dalších molekul proteinu DnaA vzniká komplex s místem oriC na svém povrchu. POOOCG komplex proteinu DnaA oddělení vláken začína v opakovaných sekvencích 13 bp Protein DnaB (DNA-helikáza) a DnaC se připojují k iniciačnímu komplexu a vytvářejí replikační bublinu. protein DnaB (DNA-helikáza) protein DnaC 21 Iniciace replikace DNA prostřednictvím RNA-primerů 3'::: ni .RNA-primer =—3'-OH 15" templátové vlákno DNA DNA primáza T Průběh syntézy primem DNA-primázou SSB Parental DNA 4- a) PriA DISPLACES SSB protein ' ' ' 1 1 ' ■ I ' K b) Primase binds ..... .......5 c) primase makes short rna primer Prim oso me rna primer I I I I I I I s Direction of movement of primosome DNA retezec uvolnený z materské molekuly s navázanými SSB proteiny Vytesnení SSB proteinem PriA - tento protein pak navodí napojení primázy (DnaG) Vazba DNA-primázy Syntéza 11-12 nt RNA primem 23 Syntéza Okazakiho fragmentů a proces jejich spojování postupným působením enzymů: 1. DNA-polymerázy 2. Nukleázy 3. Li gázy prim á 7a kata lyžuje RNA- syntézu nových primer RNA-primerů ■ 5' 3'^H5' 5' ■^■■■■■■^ templ át pro váznoucí řetězec DNA-polymeráza přidává nukleotidy k RNA-primeru a zahajuje tvorbu dalšího DNA- fragmentu ■ DNA-polymeráza dokončuje syntézu DNIA-fragmentu starý R NA-primer je vymazán a nahrazen DNA 5* MMHHHWHHB . 3' 3' 3' DNA-ligáza ruší mezeru a připojuje nový DNA-fragment k rostoucímu řetězci Tři kroky při spojování Okazakiho fragmentu Okazaki RNA primer Okazakí fragment i fragment fragment ; iragment 8SĚS8H8ŠŠŠ8ŠŠŠŠŠŠS8S888S88S Nově nasyntetizovaný řetězec ■ tvořený Okazakiho fragmenty New DNA )ir Fol I movement nucleotides j^tKI^^ inserted Polymerase I PBBBíBáfflp^SBBBBBSSBBB., Vazba Pol I a odbourání RNA- %\ primem DNA ligase .8B8BBB888ÍBB8BBp^8B8BBB3Í" ^ • Spojení mezery v DNA-ligázou J8B888BBBŠBBBBÍfiB8BBB8BE 25 templát vedoucího řetězce nově syntetizovaný řetězec vedoucí Řetězec opožďující se řetězec RNA-primer nový Okazakího fragment / sviraci protein DNA-polymeráza na vedoucím řetězci rodičovská DNA DNA-helikáza pnmaza vazebný protein ssb pro jednoduchý řetězec templát pro opožďující se řetězec DNA-polymeráza na váznoucím řetězci (právě dokončuje syntézu Okazakiho fragmentu) Relativní poloha podjednotek DNA polymerázy replikační vidlici 1111111111111111111111 • dvě podjednotky Polili 1111111111111111111111 fungují společné Směr pohybu Polili 11111111111111 • pokud by DNA nevy-■■■■iii iiiiiii tvořila ohyb, podjednotky by se oddělily Směr syntézy DNA TT ■ ■i ■■■■■■■in Směr pohybu Polili ohyb DNA umožní podjednotkám zůstat pohromadě 27 Průběh syntézy nových řetězců DNA DNA-polymerázou templát vedoucího řetězce Okazakiho fragment 28 Syntéza vedoucího řetězce a Okazakiho fragmentů Pro zjednodušení není zakreslena 8-svorka a v-komplex 29 Úloha podjednotek gama a beta při replikaci Y -komplex Nakládá p -svorku na dvouřetězcový úsek složený z RNA-primeru a matricového DNA-řetězce a rozeznává RNA-primejryJétp sestavě. prodlužovaný vedoucí 5' OL - podjednotka DNA-polymerázy lil 3' p -svorka Stabilizuje dvouřetězcovou strukturu a hlavně zvyšuje procesivitu DNA-polymerázy III. matricový DNA-řetězec 30 Nakládání DNA polymerázy na opožďující se řetězec 3' 5'« '3' laggíng-strand DNA template 5'i '3' 5'i ß-svorka RNA primer previously synthesized DNA polymerase OkazakWragment 5'i 3' 5' y-komplex SYNTHESIS OF OKAZAKI FRAGMENT 5'i 5' STALLING OF DNA POLYMERASE TRIGGERS ITS RELEASE FROM CLAMP 5'i NEW CLAMP ASSEMBLED WITH POLYMERASE AT NEXT RNA PRIMER 3' 5' Globální pohled na průběh replikace dsDNA prodlužování vedoucího řetězce (polymerace ) Odbourávání primem z jeho 5'-konce. Přidávání nukleotidů k 3'-konci Okazakiho Spojení fragmentu. Okazakiho fragmentů. . , hotový hotovy \ RNA-primer Okazakiho fragment prodlužující se Okazakiho fragment 32 Terminace replikace bakteriálního chromozomu Ter - místa (23 bp) spolu 33 Zjednodušené schéma buněčného cyklu zdůrazňující počet molekul dsDNA v chromozomech v jeho různých fázích V M-fázi proběhne mitóza VG2- fázi se buňka připravuje k dělení. Každá molekula dsDNA se nachází v navzájem ještě neoddělených chromatidéch. Teprve v anafázi se sesterské chro-matidy oddělí v ne-závislé chromozomy. O =buňka |=2 molekuly dsDNA. Každá je v jiném chrom o-omu stejného páru. čet molekul dsDNA se v každém chromozomu zdvojnásobí. Buněčný cyklus savčí buňk> s generační dobou 16 hod. 34 Struktura chromozomu během dělení buňky telomera replikační počátek centromera on interfAze MITOZA INTERFAZE i i---1 I--- replikační bublina Chromatinová doména = replikon -»- část mitotického vřeténka i_J duplikované chromosomy v oddělených buňkách Počet počátků replikace u různých organismů Organismus Počet replikonů Velikost replikonů Rychlost pohybu vidlice (e. coli) (S. cerevisiae) (D. melanogaster) (X. laevis) (M. musculus) (V. faba) 1 500 3 500 15 000 25 000 35 000 4200 kb 40 kb 40 kb 200 kb 150 kb 300 kb ( 50 000 bp/min 3 600 bp/min 2 600 bp/min 500 bp/min 2 200 bp/min Rozdíly v rychlosti syntézy 36 Složky bakteriálního a eukaryotického replizomu Složka replizomu U bakterií U eukaryot Replikativní polymeráza Holoenzym polili* pola/primáza v komplexu s pol 5 Faktor zvyšující procesí vitu replikativní polymeráty P-svorka PCNA Faktor nakládající (3-svorku (PCNA) y-komplex RFC Primáza jen DNA-primáza (DnaG-protein) komplex pola/primáza Helikáza DnaB-protein, n-protein ? Odstranění primem DNA-polymeráza I exonukleáza MF1 Oprava opožďujícího se řetězce DNA-polymeráza I a DNA-ligáza Komplex pol &7pol e ? a DNA-ligáza DNA-topoizomeráza II (gyráza) II Proteiny vázající se na jed no řetězcové úseky DNA SSB-proteiny replikační protein A (RP-A) nebo lidský SSB (HSSB) Eukaryotícké DNA-polymerázy • a Syntéza Okazakiho fragmentů, 3 -5' exonukleáza • B Syntéza krátkých řetězců při reparaci DNA • y Syntéza mitochondriové DNA • ó Syntéza vedoucího řetězce a dokončení syntézy opožďujícího se řetězce 3 -5' exonukleáza • £ Neznámá funkce 38 Přehled vlastností a funkcí eukaryotíckých DNA-polymeráz Proliferační buněčný antigen (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) - p-svorka 'Označení u savců Označení u kvasinek Umístění ľV Počet podjedno- Ä'l^k-Ä'- Polymerá- zová aktivita I 5'-3' Exonukléá-zová áktivi- Sdrůžené faktory Procesivíta Funkce poli v jádře + mirna začátek syntézy Okazakiho fragmentů primery po!4 v jádře nízká oprava poškozené DNA polM v mito-chondriích + pol3 v jádře vysoká katalýza replikace v mito-chondriích vysoká ve sdružení s PCNA syntéza prodlužujícího se řetězce a dokončení syntézy Okazakiho fragmentů po!2 v jádře >1 vysoká neznáma 39 Struktura počátku replikace u kvasinek Soubor proteinů = ORIZOM transkripční faktory I proteiny rozeznávající transkripční počátek replikace (ori) faktory I _ i DNA ioHowiaoa sekvence potřebná k odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory sekvence, na níž se zahajuje odvíjení DNA vazebné místo pro transkripční faktory rozeznávací sekvence počátku replikace 1. Vazba inciačních proteinů na sekvenci ore (helikáza, polymeráza atp) 2. Vazba transkripčních faktorů a jejich interakce s proteiny v místě ORE 3. Iniciace replikace, rozmotání DNA v místě DUE Různé transkripční faktory aktivují různé počátky replikace Před zahájením replikace se poblíž počátku replikace naváže RLF (replication licensing factor), který je po zahájení replikace odstraněn: koordinace iniciace mnoha ori Iniciace replikace u eukaryot - rozdíly oproti bakteriím A) Primáza syntetizuje RNA-primer, poté se važe DNA polymeráza a, která nasyntetizuje i DNA (iniciátorova DNA). RFC slouží u eukaryot k nakládání PCNA podobně jako y komplex k nakládání beta-svorky u E. co li RFC nasedá na iDNA RFC napomáhá navázat DNA-polymerázu ô a PCNA protein (trimer) DNA-polymeráza ô pak prodlužuje nový řetězec DNA 41 Základní složky replizomu eukaryot replikační faktor C Schéma replikační vidlice eukaryotické jaderné DNA nové nukleozomy staré nukleozomy Staré a nové nukleozomy se na matricových a podle nich syntetizovaných komplementárních řetězcích rozdělují náhodně Na obrázku je pro jednoduchost schématického vyjádření nukleozom znázorněn jako tetramer histonů. Ve skutečnosti však jde o oktamer. dsDNA nukleozom Nukleozomy se rozpadají při replikací. ssDNA nové histony zásoba histonů rekonstituce nukíeozomů / 00 staré histony 43 Sestavování nukleozomů během replikace sestavování nukleozomů během replikace chromozomu nukleozomový sestavovací protein-1 _ rodičovské vlákno 3' iiiiiiťťágggťíagggítagggtta ~ neúplné, navě syntetizované opcždujicí se vlákno telomeráza navázaný templát RNA . j t i i i i i i l i i i i i i i 1 1 TTAGGGTTAGGG T TA G G G T TA G G G T T A a at c c c 5' i Dokončeni komplementárního vlákna DNA-polymerázou (DNA-dependentni syntéza DNA). 1 1 TTAGGGTTAGGG' 'ŤŤAOŕGGŤŤÁiÄGTTAGGGTTA a a-c c c j aa|P|aauccc 5' RNA-primer DNA-polymeráza (b) Funkce telomerázy TELOMERASE BINDS j, parental strand / 3' TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG DAACCCCv jncomp|etef newly synthesized lagging strand TELOMERASE EXTENDS 3' END (RNA-templated DNA synthesis) 3 TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG 3AACCCC Maco 5' direction of telomere synthesis telomerase with bound RNA template BTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG lAACCCC MÁCO 5' COMPLETION OF LAGGING STRAND BY DNA POLYMERASE (DNA-tem plated DNA synthesis) 3' 3TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG DAACCCC ^CCCCAACCCCAACCC^ DNA polymerase Prodlužování konců telomer telomerázou Okazakiho fragmenty 5'-TTGOGGTTGIGgGTTGIGGGTTGI 3' 3'-MCCCC 5 ^.UftcCCAAC v 3/ Internal - RNA template Telomerase 5'-3 '- DNA synthGEis Enzyme El translocation - TTGtGGGTTGIGGGTTGIGGGWaiGGGTfa 3' -AACCCC 5 1 /-AAC" CCCAAC DNA synthesis 5' 3'- - nGlGWJTG'GGGTTGllGGOTTGlGGGTrGliGGGTTGI 5' -AACCCC 5' Multiple synthesis steps x^T by telomerase 5' 3'- - TTGGGGTTGh -AACCCC 5' DNA synthesis 5'-TTGGGGTTGh 3'-AACCCCAAC h Elongation of opposite strand by DNA polymerase ct Key: I■5'GGGTTG 3' ■ 3'CCCAAC 5' 49 Sekvence telomer různých organismů • TTGGGG - T2G4 u Tetrahymena thermophila a Glaucoma chattoni • TTTTGGGG - T4G4 u Eupíotes aediculatus a Oxytricha nova • TTTAGGG - T3A^G3 u Arabidopsis thaliama • TGGG - TG3 u Saccharomyces cerevisiae • TTAGGG - T2A^ u člověka, myší, a Trypanosoma brucei 5' GGGTTA 3' - délka 10 000 bp 50 Prodlužování telomer u drosofily Mobilní elementy (retrotranspozony) Het-A, TART a Tahre (telomere associated retrotranspozon) Přednostně se transponují do koncových oblastí chromozomů a tím je prodlužují I I I —\**AIA tart (telomere associated retrotransposon) [ Gag 1 Poí [ IftAAAA Tahre The three D. melcinogaster telomere retrotransposons drawn as their putative RNA transposition intermediates. Coding regions, Gag and Pol, are labeled. Gray regions indicate 5' and 3' untranslated regions. AAAA indicates the 3' poly(A) tail on each RNA. It is the source of the (dA/T)n that joins each DNA copy to the chromosome when the element transposes. Sizes are only approximate because individual elements can differ in length of both coding and noncoding regions. HeT-A elements are~6 kb. The 5' end of TART has not been completely defined but subfamilies appear to be 10-13 kb. Tahre is~10.5 kb 51 Srovnání prodlužování telomer telomerázou a retroelementy Telom erase Chromosome end He T-A /A AAAAAAA' NNNN Chromosome end komplementární sekvence katalytická podjednotka nekomplementární sekvence 52 In Drosophila, the role of telomerase is carried out by three specialized retrotransposable elements, HeT-A, TART and Tahre. Telomeres contain long tandem head-to-tail arrays of these elements. Within each array, the three elements occur in random, but polarized, order. Some are truncated at the 5' end, giving the telomere an enriched content of the large 3' untranslated regions which distinguish these telomeric elements from other retrotransposons. Thus, Drosophila telomeres resemble other telomeres because they are long arrays of repeated sequences, albeit more irregular arrays than those produced by telomerase. The telomeric retrotransposons are reverse-transcribed directly onto the end of the chromosome, extending the end by successive transpositions. Their transposition uses exactly the same method by which telomerase extends chromosome ends—copying an RNA template. In addition to these similarities in structure and maintenance, Drosophila telomeres have strong functional similarities to other telomeres and, as variants, provide an important model for understanding general principles of telomere function and evolution 53 Telomerová opakování ~ mechanismus pro kontrolu buněčného dělení • při narození mají v somatických buňkách telomery úplnou délku • při každém dělení buňky ztrácí telomera 50-100 nt • po mnoha děleních zdědí buňky defektní chromozomy a dochází k zástavě dělení buněk = replicative cell senescence • Mechanismus zajišťuje, že nedochází k nekontrolovatelnému dělení buněk („measuring stick") O lidské fibroblast]/ ve tkáňové kultuře - po 60 děleních buněk dochází k zástavě tvorby telomerázy O po vložení genu s aktivní telomerázou se délka telomer udržuje a buňky nestárnou 54 Replikace DNA mechanismem otáčející se kružnicí Template is circular duplex DNA Initiation occurs on one strand ■■OWý\-_- Elongation of growing strand displaces old strand After 1 revolution displaced strand reaches unit length Continued elongation generates displaced ■ strand of multiple unit lengths ; I \ Gť0W|,—.^trQn N ^ Displaced Strand | 55 Replikace virových molekul otáčející se kružnicí Replikace plazmidů a virů otáčející se kružnicí cl) konkatemer komplementární (kohe^i) konce komplementární (kohe^ni) konce = í- konec = 5 - konec = štěpeni endonukleáiou - oři 57 Replikace genomu adenoviru (též některé bakteriofágy) Specifický protein pro iniciaci replikace Ostatní viry: vlastní RNA polymerázy nebo RNA-polymerázy hostitele; proteiny pro iniciaci replikace; retroviry: RT 59