Transkripce přepis genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA. Reakci katalyzuje RNA-polymeráza (transkriptáza) Zpětná transkripce (RT) - přepis genetické informace z RNA do DNA. Reakci katalyzuje zpětná (reverzní) transkriptáza Transkripce DNA do RNA DNA 3'-TACC AACGCGAATTC • • • • AUGG 5 RNA 3'-TACCCAACGCGAATTC • •• •• •• • AUGGGUUG 5' 3' Značení řetězců DNA podle jejich funkce dsDNA 5' 3' kódující (pozitivní) [nepřepisující se] ■3'* 5 3 antikódující (negativní) (-DNA) [přepisující se] 5' transkripce i m RNA 3'* 5' GATC 3' 3' CTAG 5' 5' GAUČ 3' Směr syntézy mRNA pří transkripci, směr translace mRNA a směr syntézy polypeptidů Syntéta polypeptidů N-konec.....C-konec 4 Transkripce u prokaryot je spřažena s translací, u eukaryot jsou tyto procesy odděleny Prokaryota Eukaryota J RNA polymerase ^ Polycistronic mRNA mRNA is translated while it is still being transcribed (5') I (5') Monocistronic mRNA Poly(A) Addition (5') AAAAAA{3' Tail mRNA must exit from the nucleus before it can be translated AAAAAA (3') 5 Srovnání prokaryotické a eukaryotické mRNA Prokaryotní mRNA kódující sekvence \ PXPXP 1 nekódující sekvence \ 1 I 3' Polygen ní mRNA protein a protein ß protein y Eukaryotní mRNA 5' -čepička kódující sekvence \ I nekódující sekvence 3' "Iaaaaa Monogen ní mRNA (A} protein 6 Srovnání prokaryotických (jednoduchých) strukturních genů s eukaryotickými (složenými) geny kódující oblast dna I__ bakteriální gen kódující oblasti nekódující oblasti (exony) {introny} eukaryontní gen Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je na daném úseku DNA využíván obvykle jen jeden z řetězců DNA z chromosomu E. coli RNA-transkripty gen d gen e Mi. MMHNMMMMHHI ■HMMNMHBMMM USB MHHMMNMMMNI HHiaMManBmMMNM - v Énr mm gen c anti-sense RNA 3' i 1 5' ge^vf gen g 5000 nukleotidových párů 8 Typy RNA vznikající při transkripci u různých typů organismů Total RNA Codin, 4% ol l RNA total Pre-nr (hnR iRNA NA) Noncoding RNA 96% of total Pre-rRNA Pre-tRNA snRNA snoRNA scRNA mi tmRNA and various other types mRNA rRNA tRNA KEY All organisms Eukaryotes only Bacteria only Molekulární druhy molekul RNA vytvářené transkripcí u eukaryot Transkripce a úpravy RNA probíhají v Jádře, Translace probíhá v cytoptamé. Enzymy katalyzující transkripci A. DNA-dependentní RNA-polymeráza (RNA-polymeráza, transkriptáza) matricí je řetězec DNA (prokaryota, eukaryota, DNA-viry) B. RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná/reverzní transkriptáza) matricí je řetězec RNA (retroviry, retrotranspozony, retroelementy) Primární transkripty tvořené na řetězci DNA O přepisy strukturních genů (mRNA, pre-mRNA/hnRNA) O přepisy genů pro funkční typy RNA • pre-rRNA • pre-tRNA • malé RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, miRNA, ...) 11 Funkce podjednotek RNA-polymerázy u E. coli podmiňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu udržuje stabilitu molekuly podmiňuje vazbu RNA-polymerázy k promotoru podmiňuje spojení RNA-polymerázy s matricovým řetězcem 12 Struktura RNA-polymerázy newty synthesized short region of RNA transcript DNA/RNA helix 13 Strukturní gen prokaryot s vyznačením signálů pro transkripci a translaci transkripčné regulačné signály translačné regulačné signály -*-1,-,-*- oblasť -35 PRIBNOWOV BOX iniciácia -10 transkripcie SD iniciačný kodón rozpoznávacia sekvencia vazbové miesto pre RNA-polymerázu pre RNA-polymerázu + 1 DNA TGTTGACA 12 13 ± 2 4-9 m RNA vazbové miesto pre ribozóm TATAATG ... A TAAGGAG 3-9 2 - 11 18-129 í tga h_ oblasť kódujúca terminučný terminátor polypeptidový kodón transkripcie reťazec protein Transkripce strukturních genů Schéma bakteriální mRNA a transkripční jednotky obsahující strukturní geny -transkripční jednotka (vyjádřená v negativním DNA-řetězci) startovací nukleotid ■r ^ promotor TCCT vedoucí sekvence TAC AGGA AUG ATC UAG TAC ATC AUG UAG TAC ATC terminátor AUG UAG -Na ribozomu se překládá jen tento úsek- koncová sekvence 3' mRNA Úseky obsazené geny A, B, C jsou mnohonásobně delší než ostatní! Schéma upozorňuje jen na složení transkripční jednotky a mRNA. Neupozorňuje na délku jednotlivých úseků. Shineova-Dalgarnova sekvence mRNA je multigenní Slouží bezprostředně jako matrice pro syntézu proteinů velmi rychle se rozkládá ribonukleázou (1-2 min) 15 Funkční elementy bakteriálního promotoru -35 -10 + KA.G) I TTGACAT 16-18b promotor < silný slabý TATAAT P * Pribnowův startovací box nukleotid box = krátká sekvence o stejné funkci sekvence -10 templátové vlákno sekvence -35 A 5-9 nebo transkripce - AACTGT TŤGÄČÁ 16-19 bp 3- netemplátové vlákno ■*— sekvence proti směru transkripce nebo AAT 4*- sekvence po směru transkripce lokální rozvíjení Sekvence přirozených a hybridních promotorů -35 Region -10 Region 1 23456789 1011121314151617 consensus • • • T TG AGA.................T A T A A T • • lac G G CT TTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTA TA T T G T trp CT GTTG ACAATT A A TC AT CGA AC T AGTTAACT AG XPL G T G T T G A C AT AA AT AC C A C T G G C G G T G AT ACTG A recA CA CT TG AT AC T G T A T G A A G C A T A C A G T A T A AT TG rad tacll C TG T T GACAAT T AATCAT CGGCTCGTAT AATG T CTGT TGACAAT T AATCAT CGAACTAGT T T A A TGT 15-18 bp 5-9 bp + 1 r Hybridní promotory tac = lac x trp 17 Základní schéma typů transkripčních jednotek bakteriálního genomu Neoperonová transkripční jednotka a operony 4.1" NEOPERONOVÁ TRANSKRIPČNÍ JEDNOTKA startovací nukleotid t promotor operátor _.1 J strukturní gen strukturní gen termjnátor OPERONY strukturní gen strukturní gen +1 1 strukturní gen strukturní gen 1 t operátor překrývající se s promotorem 18 Transkripce bakteriálního genu RNA-polymerázou 1. iniciace 2. elongace 3. terminace 5'l 3'l 51 3'l sigma-faktor rostoucí řetězec RNA /... terminace a uvolnění polymerázy a hotového řetězce RNA 3!] DNA i 3' i5' znovunavazam sigma-faktoru 19 Vytváření molekul mRNA na prokaryotické transkripční jednotce a spřažení transkripce a translace u prokaryot transkripty (RNA) genů podléhají translaci na mnoha ribozomech současně směr transkripce 20 Výměna podjednotek vázajících se na RNA-polymerázu v průběhu transkripce sigma-faktor ILfcRNA-polymeráza a- faktor rozeznává sekvenci -35 na promotoruA Po skončení této funkce se z RNA-polymerázy I uvolňuje. RNA-polymeráza katalyzuje transkripci i bez sigma-faktoru, který je v průběhu elongace nahrazen NusA-proteinem i Term i nace RNA-polymeráza se z terminátoru uvolní a NusA-protein je opět nahrazen sigma-faktorem. Obr. 148 Vzájemné výměny sigma-faktoru a NusA-proteinu na RNA-polymeráze Terminace transkripce nezávislá na Ró-faktoru Zastavení pohybu RNA-polymerázy Uvolnění hotové RNA Uvolnění RNA-polymerázy z DNA 21 Vazba prokaryotické RNA-polymerázy na promotor RNA-polymeráza (holoenzym) -50 -40 -30 + -20 RNA-polymeráza změní tvar i velikost ■ po rozpoznání promotoru sigma-faktorem. uzavřený binární komplex Obr. 144a Iniciace transkripce -50 -40 (351 -30 -20 +20 bp ^^(+^ +10 +20 bp a - stabilita holoenzym u P - vazba rNTP na polymerázu P'- spojení s matricovým řetězcem a - vazba k promotoru otevřený binární komplex Obr. 144b Iniciace transkripce 22 Iniciace transkripce Sgma-faktor se uvolňuje z RNA-polymerázy. Iniciační fáze transkripce u prokaryot Rozpoznání sekvence a -35 sigma faktorem i-1 negativní (templátový) 24 Typy terminátorů transkripce u prokaryot a) i i i i i i U A A C A vlásenka se smyčkou b) r T U U u u u u UACCAU C A A U C A A terminátor nezávislý na ró—faktoru terminátor závislý na ró—faktom Strukturní rozdíly mezi dvěma typy prokaryotických terminátorů (jejich transkriptů) 25 Struktura terminátorů nezávislých na ró-faktoru a jejich přepis do mRNA jedinečná sekvence 26 Struktura transkripčnftio terminátoru nezávislého na rho faktoru DNA 5'- CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA -3' 3'- GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT -5' transkripce templátovévlákno DNA RNA-transkript 5' CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU OH-3' rychlé skládání RNA složená RNA u c c 5'- C C C A C Složený řetězec RNA napomáha terminaci řetězce. U U U U OH-3' 27 Terminace transkripce mRNA mRNA DNA vlásenka I. Recognition IV. Termination DNA Sigma displaces NusA Výměna sigma faktoru a NusA proteinu na RNA-polymeráze - Sigma faktor: iniciace - NusA protein - terminace Terminace transkripce za účasti Rho faktoru RNA polymerase Elongační fáze transkripce Připojení Rho-faktoru a jeho pohyb po mRNA Připojení Rho-faktoru k sekvenci terminátoru Rho faktor rozmotává hybridní DNA-RNA Uvolnění Rho-faktoru, RNA-polymerázy a mRNA Terminace transkripce závislá na Rho-faktoru Elongační fáze Rho-faktor se pohybuje za RNA-polymerázou Rho-faktor je rozeznáván NusA-proteinem, který je přechodnou součástí RNA-polymerázy. Rho-faktor katalyzuje po vazbě na tento protein odvíjení mRNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy. K tomu je zapotřebí ATP, který je hydrolyzován Rho-faktorem vyznačujícím se aktivitou ATPázy. Jakmile se RNA-polymeráza zastaví na terminátorové vlásence, Rho-faktor ji dostihne a oddělí RNA od DNA (Rho = helikáza) Transkripce transkripční jednotky pro rRNA DNA geny tRNA FěŠ-rŘŇA | tRNA | 23s-rRNA |5s-rRNAÍ I tRNAl promotory pre-rRNA transkripce terminátory 1 posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) s"\ 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA 5S-rRNA tRNA 32 Transkripce transkripční jednotky pro tRNA promotor DNA pre-tRNA geny tRNA tRNA transkripce posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) I I tRNA tRNA 4« tRNA tRNA mRNA 3' 33 Transkripce a úprava genů pro rRNA u bakterií a savců Bakterie Savci gen pro rRNA dna WAWAyAYAyA^AWWWX transkripce prekruzor , rRNA30S | prekurzor 4S 16S rRNA tRNA i i I-1 (a) 16S 4S rRNA tRNA 1 štěpení endoribonukleázami prekurzor 23S rRNA prekurzor 5S rRNA H C druhotné štěpení endoribonukleázou a zkrácení exoribonukleázami 23S rRNA 5S rRNA gen rjro rRNA dna \YAWA/AWAyAYAWAVAWAYAm primární transkript - prekurzor rRNA45S 5' PPP transkripce 13 000 nukleotidů I i I lvi rozložené oblasti primárního transkriptu 1874 nukleotidů 5' 160 nukleotidů 3' 5' 3' 5' úpravy RNA 4718 nukleotidů (b) 18S rRNA 5,8S rRNA 28S rRNA J OH 3' 34 Úprava pre-tRNA u E. coli * probíhá působením enzymů xonu kleáza RNase P !► enaonukleáza -03' >I50 nudeotides RNase E/F endonukleáza o — (i (i — ii O tRNA-nukleotidyltransferáza dodatečné připojení ACC 35 Eukaryota rriRNA ^■■■■■■AAAA jTRANSLACE protein i- i Eukaryotícké DNA-dependentní RNA-polymerázy Matricí pro syntézu RNA je u všech těchto polymeráz negativní DNA-řetězec. Existují tři druhy těchto RNA-polymeráz: • RNA-polymeráza I, která katalyzuje syntézu pre-rRNA. Nachází se v ja-dérku a není citlivá k a-amanitinu Geny I. třídy • RNA-polymeráza II, která katalyzuje syntézu hnRNA a některých malých rRNA. Je citlivá k a-amanitinu. Vyskytuje se v karyoplazmě. Sestává přibližně z 10 protomerů, z nichž tři největší jsou homotogické s protomery a, 6 a 6'prokaryotické RNA-poíymerázy. Protomer 6 váže volné ribonukleotidy, 6' se váže k DNA a a spojuje protomery navzájem. Ostatní protomery se neliší od protomerů polymeráz I a III. Geny II. třídy • RNA-polymeráza III, která katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA. Citlivost k a-amanitinu je druhově specifická. Vyskytuje se v karyoplazmě. Geny III. třídy Každá z uvedených tří RNA-polymeráz vyžaduje svůj specifický promotor, na který se váže. To je rozdíl proti prokaryotům, která mají jen jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru Struktura promotoru RNA-polymerázy II obecné trans kripční faktory SP1 bazálni trans kripční startovací faktor nukleotid TFIJD ATTTGCAT - GG G C GG—G GC C AATCT—T AT AA AA PyAPyPyPyPyPy -100 •90 ■75 30 Inr-element konvenční sekvence elementů eukaryotického promotoru (iniciátor) Promotory různých genů se liší počtem, umístěním a kombinací těchto elementů. Všechny promotory však musí obsahovat jeden nebo více elementů, aby mohly zahájit bazální transkripci Provozní geny mají jen fnr-efement bez TATA-boxu (Hognessův box). Poznámka Promotory RNA-polymerázy // u některých genů nemají ani TATA-box ani Inr-element Transkripce těchto genů může začít z různých míst seřazených za sebou. 38 Elementy eukaryotíckého promotoru (Pol II) +1 (startovací nukleotid + Inr-element) - iniciátor TATA-box (Hognessův b.) -34 až -26 - TATA-box CAAT-box -75 až -80 Elementy proti směru GC-box -90 > transkripce Oktamer ATTTGCAT (upstream elements) oktamerový box počátek transkripce / ATTTGCAT konzervativní sekvence GGGCGG GGCCAATCT konzervativní konzervativní sekvence sekvence -20 / \ / \ GGGCGG TATAAAA konzervativní konzervativní sekvence sekvence +1 39 Vazebná místa eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II Initiator c i mém ní 11 fjJŮĚĚĚĚĚkí . element box box enC I_Promoter_I 0 Start of transcription Iniciace transkripce eukaryotních genů RNA-polymerázou II za účasti obecných transkripčních faktorů začátek transkripce TATAbox _I HUTP, ATP CTP, GTP TRANSKRIPCE ZAČÍNÁ pro zahájení transkripce je nutné navázáni TF na TATA-box a na RNA-polymerázu RNA-polymeráza je fosforylována TFIIH (+ATP), mění konformaci a zahajuje transkripci 41 Posttranskrípční úpravy hnRNA Úpravy konců • 5'-konec: připojení čepičky (cap) • 3'-konec: polyadenylace Úpravy vnitřní sekvence • Metylace • Sestřih • Editace (redakční úprava) 42 Posttranskripční úprava transkriptů strukturních genů eukaryot intron transkripce pre-mRNA ____-N. Vr""V'" 0 0 0 II II II CH, -O-P-O-P-O-P-0 —CH /OH HO\j 2 I I o- O A No 7-metylcjuanazin 0 O-CH, 1 3 K 5'-konci se připojuje 7-MG čepička. 1. Připojení čepičky 5'-čepička 5'-čepička 5'-čepíčka mRNA 5'-čepička! Připojuje se úsek poly(A). Intron se vyštěpí. -AAAAA(A^190 AAAAOH úsek 3'-poly{A} úsek 3'-poiy(A) úsek 3'-poly(A) 2. Připojení (poly)A konce 3. Sestřih 43 Struktura čepičky ľ "\H H/ OH 01 Hlť ťyi OH ( >_o_|p. OH L O—C H 2 BAZE H OH m7G5 ppp5 -mRNA BAZE mRNA°-CH3 Rané stadium transkripce genu RNA-polymerázou II. RNA-polymeráza II 5' 3' pre-mRNA 5' 7-MG (a) 5'-čepička :í CH3-GpppNpNp CH, t 2'-0-metyltransferáza CH3-GpppNpNp <=> T guanin-7-metyttransferaza GpppNpNp □ 5'- konec primárního PP. + P. guanylyltransferáza GTP pppNpNp Iranskriptu (b) Biosyntetická dráha 7-MG čepičky. 44 Schéma polyadenylace 3'-konce hnRNA Přepis polyadenylačního signálu část proti směru transkripce část po směru transkripce hnRNA /U^/VH ostatní proteiny komplexu faktor roípeznávací přepis polyadenylačního signálu poly (A) ■ polymeráza étě|ení^^p Ta to část se rozloží cxonukleázou Iniciační fáze polyadenylace elongační fáze polyadenylace 1 terminaee St 100 Připojení sekvence poly (A) k 3'konci mRNA transkripční jednotka 5'- čepička Q Štěpení endonukleázou. 5'- čepička ,*jgj2f Přidání úseku poly(A) " poly(A)-polymerázou. RNA-polymeráza MUAAA ^bohatá na GU endonukleolytické štěpení AAUAM 5'- čepička1 MUAAA ■ AAAAA{A}195 3' úsek poly(A) 46 Proces vytváření poly A konce na mRNA RNA polymerase Signály na DNA pro uvolnení mRNA a připojení polyA konce Připojení dalších faktorů, uvolnění mRNA Připojení dalších proteinů vázajících se na polyA CstF - cleavage stimulation factor F CPSF - celavage and polyadenylation specificity factor Hotový 3- konec mRNA 47 Transport hotové eukaryotické mRNA z jádra do cytoplazmy TRANSLATION Některé z proteinů zůstávají v jádře, jiné jsou transportovány spolu s mRNA do cytoplazmy a zajišťují její stabilitu a iniciaci translace 48 Sestřih (splicing) - proces, při němž jsou odstraňovány introny Objev: 1977: v genu adenovirů 1978: P-globin, imunoglobulin, ovalbumin, tRNA and rRNA. Známé typy intronů Intron type Where found GU-AG introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA AU-AC introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA Group 1 Eukaryotic nuclear pre-rRN A, organelle RNAs, few bacterial RNAs Group lí Organelle RNAst some prokaryotic RNAs Group III Organelle RNAs Twintrons Organelle RNAs Pre-tRNA introns Eukaryotic nuclear pre-tRNA Archael introns Various RNAs 49 Důkaz přítomnosti intronů v genu pro ovalbumin Splicing diversity (a) Electron micrograph of ovalbumin DNA-mRNA heteroduplex. RNA Schéma intronu s vyznačením konzervativních sekvencí sekvence potřebné pro vyštěpení intronu část primárního transkriptu exon 1 exon 2 52 Schéma struktury intronu v hnRNA «- 5' 3' 5' exon 1 AAG.GUAAGU t S'-místo sestřihu R = purinový nukleotid Y = pyrimidinový nukleotid N = jakýkoliv nukleotid A r* = A nebo C intron- 31 •YNCUFSC-(Y)nN>HJ CUAAC {Y)nNCAGAG místo větvení Nukleotid poskytující skupinu 2-OH. pyrimidinový úsek Oblast bohatá na pyrimidinové nukleotidy. t 3'-místo sestřihu Sekvence a nukleotidy zakreslené do šedého rámečku jsou vysoce konzervativní (četnost 100 %). Ostatní sekvence se vyskytují v četnosti 70 - 95 %. Sekvence uvedené pod schématem intronu a exonu jsou sekvence, které byly zjištěny u savců. 53 Schéma transesterifikace při sestřihu hnRNA lasovitá intronexonová RNA 5' exoti 1 —O lasovitá intronová RNA První transesterifikace (první přenos OH-skupíny). Druhá transesterifikace (druhý přenos OH-skupiny). Tran seste rif i kace = přeměna jednoho fosfátového esteru v jiný probíhající přenosem OH-skupiny bez hydrolýzy a za nepřítomnosti ATP n. GTP 5' exon 1 ©xon 2 3' 54 5' O O OH I o= P—O o 2,5- fosfodiesterová vazba - o vyšte pená intronová sekvence v lasovité formě 5' -konec intronové sekvence O" rT | O O^— P - o= P —o o I On O 0 OH 1 o= P—o 0 OH I o=p—o 1 o^ o u On i 3' 3" -konec intronové sekvence 0 OH 1 0= P —O" I 13' Průběh sestřihu strukturního genu - účast U snRNP místo 5' -sestřihu Ul snRNP axon 1 J2 snRNP místo 3'-sestřihu / cxon 2 ■ UE snRNP tvorba „lasa" a štepení místa 5' -sestřihu štěpení místa 3' -sestřihu a spojení obou exonů , část primárního 3' transkriptu axon 1 A intron A exori2 A I I! GU A II AG I_ I l i 5'- seslřlhové mlsto vetvení 3'- sestřitiové m isto mlsto 5' r- snRNP U1 se váže na 5'- seslňhové misto a snRNP U2 se váže na místo větveni. Hl Částice snRNP Small nuclear ribonucleoproteins Proteiny snRNP + U snRNA + specifické proteiny □ 3' Q Sestavuje se úplný spliceozom a štěpi transkíipt v 5'- sestřihovém místě. slepené 5 - sestřitiové místo O 5 - k°nec intronu se připojuje k A v místě větveni za viníku Sasovité struktury, uvolňují se U1 a 114. vystepena intronova sekvence ve formě lasa bude degradována v jádře mRNA Stepi se 3'- sestňhové misto a 5'- konec exonu 2 se připojuje k 3'- konci exonu 1. Intron se uvolňuje ve tvaru lasa spolu s snRNP U2, U5 a U6. 5' C exon 1 / exon 2 i □ 3' sestřižená mRNA Rozeznávání 5' -místa sestřihu a místa větvení malými jadernými U1-snRNA a U2-snRNA U1-snRNA exon 1 5' GLJCCAUU 3UAAGU 5' U1-iU2-snRNAj$ou komponenty částic U1- a U2-snRNP. Jsou tedy v komplexu s proteiny, které se uplatňuji katalyticky při sestřihu a plni též strukturální funkci. místo větvení" intron- CAGl pyrimi- 3 dínový úsek (u savců) exon 2 3' Všechny uvedené sekvence nukleotidů jsou vysoce konzervativní u S. cerevisiae a vyskytují se též u jiných organizmů s výjimkou trypanozom, které nemají sekvenci GUGUA v U2-snRNA, $. cerevisiae nemá pyrimidinový úsek. 57 Průběh sestřihu ve spliceosomu během úpravy pre-mRNA A. Před první transesterifikací je U1 snRNP zaměněna za U6 snRNP exonl ^CAUUCA' 1 MIM 5'l |GUAUGUj- 3' exon 1 rearrangement GUAUGUf 3' B. A je rozpoznán BBP a pak U2 G A-GACA. UG , t * i %j Ä Si IKK íi. Si, 'u BBP (branchpoint bridging protein) exon 2 5'tUACUA AC C. Změna tvaru U5 přiblíží konce exonů rearrangement 5' + UACUAC I I I I I I Účast PRP-proteinů (upravujících prekurzorovou RNA) j_ \ exon 2 U2 UACUACA ri i i i i i UGAUGU rearrangement Účast SR proteinů při rozpoznání míst sestřihu („exon definition hypothesis") intron exon -200 intron 10-105 nucleotides nucleotides 10-105 nucleotides I ir—--------ff — l Proteiny SR (bohaté na serin a arginin) se během transkripce průběžně vážou na hranice exonů a pomáhají tak navádět částice snRNP do míst sestřihu Způsoby alternativního sestřihu hnRNA i 5 3' Jeden potenciální exon sousedící se dvěma konstitutivními Jeden potenciální exon s vice Z'-mistysestřihu a s jedním S'-m!stem Jeden potenciální exon s více 5'-místy sestřihu a s jedním 3'-místem Přeskakování jednoho potenciálního exonu konstitutivní exon potenciální exon intron ■ A, Přeskakováni více potenciálních exonů j/\v s/Xs- ! W I I ~1 Navzájem se \ylučující potenciální exony 60 Příklady alternativního sestřihu sestřihu molekul hnRNA vzniklých transkripcí překrývajících se transkripčních jednotek Alternativní terminace transkripce Transkripční jednotky nesoucí gen pro kalcitonin +1 ( T) anskrípiní jednotky nesoucí gen pro O- amylázu u myší 1 hnRNA v buňkách slinných žláz hnRNA štítné žlázy hnRNA v neuronech V hnRNA v bu ňkách jater mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se překládá do primární struktury alfa - amylázy. V V mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se překládá do primární struktury kalcitoninu v buňkách štítné žlázy. mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se v neuronech překládá do primární struktury CGRP (produkt podobný kalcitoninu). Alternativní začátek transkripce = potenciální exon, E^KI - konstitutivní exon, +1 = startovací nukleotid, T = poly(A). 61 Alternativní sestřih genu pro alfa-tropomyozin u krysy (regulace kontrakce svalových buněk) 5' 3' gen a-tropomyosinu —■-— exony introrty - _i DNA i i i Alternativní zakončení transkripce TRANSKRIPCE A SESTŘIH m RNA z příčně pruhovaného svalu 3' mRNA z hladkého svalu 3' mRNAzfibroblastů 3' mRNAzfibroblastů mRNA z mozku Faktory sestřihu - specifické proteiny aktivní jen v daném typu buňky 62 Sestřih kombinačních exonů hnRNA obsahující přepis genu kódujícího troponin T hnRNA 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415 1617 18 konstitutivní kombinační konstitutivní exony exony exony Vystepují se cto mRNA v těchto kombinacích: vzájemně se vylučující exony Molekuly mRNA s kombinacemi kombinačních exonů: 1 2 3 4-5-6-7-8 5-6-7-8 4 6-7-8 6-7-8 4-5 7-8 4 7-8 5 7-8 4-5-6 7"f 4 6 8 5-6 8 6 8 4-5 5 5-6-7 4-5-6-7 4 6-7 6-7 4-5 7 4 7 5 7 44'5 7! 5 8 8 4-5-6 4 6 5-6 4 0 6 9 1011121314 15 1617 18 hH-M-H-HHhl- Celkem se vytvoří 32 molekul mRNA, které se liší v části kódované kombinačními exony. Tyto kombinace jsou však ve vazbě vždy s jedním z dvojice vzájemně se vylučujících exonů. Proto celkově je možných 64 molekul mRNA lišících se v primární struktuře. Každá z nich se překládá do jedné izoformy troponinu T. Troponiny jsou strukturní bílkoviny buněk příčně pruhovaného svalstva, jejich odlišné izoformy jsou u fetálních buněk a v buňkách dospělců 63 Negativní a pozitivní regulace alternativního sestřihu (A) NEGATIVE CONTROL primary transcript I r splicing mRNA repressor ■ ■ no splicing mRr Represor se váže na RNA a brání v sestřihu (B) POSITIVE CONTROL primary transcript no splicing mRNA activator splicing mRNA Sestřih probíhá jen po vazbě aktivátoru na RNA 64 Samosestřih 1982: T. R. Cech (26S rRNA Tetrahymena, S. Altmann (tRNA E. coli)- 1989 Nobelova cena Autokatalytický proces sestřihu nevyžadující proteiny (in vitro) RNA schopná samosestřih u = ribozym • introny první skupiny v genech přepisovaných do mRNA, tRNA a rRNA (mitochodnrie, chloroplasty, nDNA eukaryot, bakteriofágy) vyžadují externí G, in vivo nutná účast proteinů (maturáza) • introny druhé skupiny v genech mitochondrií hub a v chloroplastech nevyžadují externí G (ale interní A), in vivo nutná účast proteinů, podobnost se sestřihem hnRNA Mechanismus samosestřihu prekurzoru rRNA externí G \ G-OH prekurzor rRNA 5' p Q Fosfoesterová vazba se přenese ze spojeni exon 1 - intron na G-OH, vazba mezí exonem 1 a intronem se rozštěpí. *£3+ 9 Fosfoesterová vazba se přenese ze spojeni intron-exon 2 na 3'-konec exonu 1, exony 1 a 2 se spojí exon 1 sestřižená rRNA 5'P • exon 2 OH 3' OH 3' exon 2 KOH3' vyštěpený intron O Intron se cirkularizuje přenosem vnitřní fosfoesterové vazby. Průběh samosestřihu u intronů první skupiny Exon 1 Intron Exon 2 GTP cofactoi binds to 3 395 nt Cut#l G is transferred to 5' end of intron sekv. specif, endoribonukleáza nukleotidyltransferáza RNA-ligáza exter.matricí fosfatáza 395 nt linear minus 19 intervening sequence 67 Reakce probíhající pří samosestříhu íntronů I a II Introny skupiny I Introny skupiny II 68 Srovnání samosestřihu intronů skupiny I a II Skupina I Skupina II Bimolekulární sestřih (trans-splicing) mRNA u trypanozom Primární transkript genu 1 způsob sestřihu Primární transkript genu 2 TransJílicing Exon Z Další příklady: nematoda, chloroplasty 70 Twintron = intron uvnitř jiného intronu • objeveny v chloroplastové DNA eugleny, později u kryptomonád, drosofily aj. • vystřihování probíhá sekvenčně (nejdřív vnitřní pak vnější intron) • v jednom intronu může být více twintronů 71 Původ intronů. „Exon theory of genes4' Multidomain, single subunit protein Single discontinuous gene Biologický význam intronů 1. Regulace genové exprese (přítomnost dlouhých intronů zpomaluje transkripci a snižuje množství výsledného transkriptu). 2. Pozůstatek evoluce (různé exony v genu kódují různé funkční domény produktu - geny vznikaly fúzí exonů). 3. Zvýšení rychlosti rekombinace kódujících úseků různých genů -zrychlení procesu evoluce (proteiny / domény). 4. Alternativní sestřih: z jednoho genu více produktů. Některé eukaryoňcké geny neobsahují introny, tj. introny nejsou nezbytné pro normální genovou expresi (klonování cDNA) Editace RNA Editace RNA je jedna z posttranskripčních úprav, která byla zjištěna • V mitochondriích trypanozom, • V mitochondriích Physarum polycephalum • V mitochondriích strunatců, • V mitochondriích vyšších rostlin • U genu pro apolipoprotein u savců 74 Editace RNA u různých organizmů Organizmy Organe ly Způsob editace Typ RNA Trypanosoma Leischmania Crithidia mitochondrie inzerce U, delece U m RNA Rostliny mitochondrie chloroplasty substituce C za U, U za C substituce C za U m RNA, rRNA Savci jádro substituce C za U, A za G m RNA 75 Substituční způsob editace hnRNA genu pro apolipoprotein The sequence of the apo-B gene is the same in intestine and liver, but the sequence of the mRNA is modified by a base change that creates a termination cod on in intestine. Apolipoprotein B gene hos 29 exons n I Codon 2153 codes for glutamine C je deaminován na U změna funkce produktu ztrátou C-domény u kratšího proteinu cytidindeamináza Spliced mRNA in liver codes for protein of 4563 residues Uvolňování cholesterolu UAA STOP Intestine mRNA has UAA codon that terminates synthesis of 2153 76 Editace mRNA genu pro apolipoprotein B ve střevě savců DNA needitovaná mRNA 5"= CA A transkripce \ střevo a vyšíěpeni intronových sekvencí 3' editování mRNA 5' apolipoprotein dlouhý 4563 aminokyselin deamináza vázající se na RNA editováni RNA: oxidativní deaminace cytozinu I translace COOH H2N -J]^ COOH apolipoprotein dlouhý 2153 aminokyselin 77 Příklady editace (redakčních úprav) mRNA - adice U a delece T (přítomen v DNA) UAU4U3UUUl^UUGUUUAUUAUGLk3AUUA^GUUULBUUUUUUAUUGGUÁUUUUUUAGÁUUUA UUUÁáUUUGUUGAUááAWCáUUU^ mGGUUUUUUUGUuJuU