1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České
republiky
Bi6420
Ekotoxikologie mikroorganismů
https://is.muni.cz/el/1431/jaro2012/Bi6420/index.qwarp
Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D.
hofman@recetox.muni.cz
jaro 2012

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České
republiky
Bi6420: Ekotoxikologie mikroorganismů
Část 4: Sledované parametry mikrobiální ekotoxikologie a působení toxických látek na ně

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems
Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České
republiky
79
Aktivity mikroorganismů v ekotoxikologii

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Aktivity mikroorganismů
•Mají velmi úzký vztah k jejich funkcím v ekosystému
•Z hlediska bioindikace:
•jsou smysluplným a zcela nezbytným doplněním údajů o kvantitě mikroorganismů = nestačí jen vysoké
množství mikroorganismů, ale hlavně aby byly funkční, tedy aktivní
•co se týká aktivity, je důležitá nejen její úroveň, ale i mnohostranost, diverzita metabolických
funkcí
•bohužel, téměř vždy (s výjimkou in situ technik) dochází ke zkreslení při přenosu z reálného
ekosystému
•
•Z hlediska ekotoxicity:
•inhibice či aktivace biochemických pochodů pod vlivem látek a stresových faktorů je principem řady
standardizovaných testů
•
•Příklady často využívaných / měřených mikrobiálních aktivit:
•měření respirace; měření mineralizace dusíku;  měření fixace dusíku; měření ATP; produkce tepla;
měření nitrifikace, sulfurikace, oxidace železa apod.;  měření denitrifikace, desulfurikace; měření
enzymových aktivit; atd. atd.
Snímek 4

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
•neustálý cyklus je nejobjemnější zejména u C, O, H, N, P, S, Fe
•
•cykly C, O a H jsou velmi těsně svázány
•
•mikroorganismy hrají v těchto cyklech stěžejní
role: jsou jednak zdrojem ("poolem") těchto prvků
(viz. mikrobiální biomasa) a jednak "propadem",
tj. mají nezastupitelnou roli v dekompoziční části
cyklů
•
•aktivita mikroorganismů určuje potenciální
produktivitu celého ekosystému; vztah
k producentům
•
•někdy je účastné celé společenstvo, jindy je důležitá jen malá specializovaná populace
•
•mikroorganismy jsou specialisté např. při biodegradacích "obtížných" polymerů a substrátů (lignin,
celulóza) a při anaerobních degradacích
Snímek 5
94
Změny těchto aktivit (např. vlivem člověka) => negativní vliv na celý ekosystém
Mikrobiální aktivity vs biogeochemické cykly

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 6
103
Mikrobiální aktivity vs biogeochemické cykly
103

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Aktivity mikroorganismů
Snímek 7
Biochemický přístup: Aktivity mikroorganismů = biochemické (enzymatické) reakce – tento pohled
umožňuje modelování
obecně lze aplikovat kinetiku Michaelis - Mentenové:
přidáváme 14C-acetát a sledujeme rychlost produkce "produktu" v tomto případě suma vyrespirovaného
a inkorporovaného 14C
vmax je pak tzv. heterotrofický potenciál in situ, protože aktuální rychlost je modifikována
transportem vzorku a manipulacemi => možnost obejít komplikace s tímto zkreslením
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 8
Lze využít značených látek:
- umožňují odlišit metabolismus katabolický a anabolický; jsou ideální mírou růstu
- 14C a 15N se užívají pro mineralizace
- 14CO2 se užívá pro sledování autotrofů
- [3H]adenin se užívá jako obraz reprodukce DNA a RNA bakterií a jednobuněčných řas
- methyl[3H]thymidin se užívá jako obraz reprodukce bakteriální DNA
-[3H]leucin - inkorporace do bakteriálních proteinů
- …..
Aktivity mikroorganismů

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Procesy spojené s cyklem uhlíku
•souvisí velmi úzce s potravními sítěmi
•
Snímek 9
95

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Procesy spojené s cyklem uhlíku
•patří sem i různé "speciality" např.:
•
•Methanogenese
•striktně anaerobní
•CO2 je akceptor elektronů ===> methan
•vodík pochází z fermentačního procesu
•zdroj uhlíku je CO2 ale nemají Calvinův cyklus, využívají acetyl-CoA syntásu
•výzmam pro skleníkový efekt
•časté studie methanogenních bakterií v rýžových polích
•
•Acetogenese
•CO2 + vodík => acetát místo methanu
•méně energeticky výhodné než methanogenese
Snímek 10
Hlavní částí dekompoziční části biochemických cyklů je však mineralizace uhlíku (organických látek)

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 11
Mineralizace uhlíku
•~ RESPIRACE - reflektuje mikrobiální metabolismus organických substrátů přítomných v prostředí
•
•není jen věcí mikroorganismů - i kořeny a mezofauna v půdě respirují
•
•silná závislost na řadě faktorů prostředí - je silně limitována např. pH (např. v rašelinách,
sedimentech, histosolech) a koncentrací kyslíku (BOD) - pokud je snížena, dochází k akumulaci
organického materiálu
•
•v půdě je funkcí vlhkosti, teploty, půdní struktury, redoxpotenciálu a dostupného substrátu
•
Vztah s tvorbou humusu? = mezistupeň mezi totální mineralizací a žádnou degradací
C substrát + dusík + TEA ====> hmota buněk + CO2 + H2O
Humifikace:
immobilizace organického materiálu
Mineralizace:
zdostupnění živin pro rostliny
Mikroorganismy v půdě
CO2 do atmosféry
humus
CO2 + CH4 + glukóza pro rosliny
Procesy spojené s cyklem uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Respirace
Snímek 12
C6H12O6
2CO2 + 2CH3CH2OH + Energie
Anaerobní:
C6H12O6  + 6O2
6CO2 + 6H2O + Energie
Aerobní:
•glykolýza a kvašení (fermentace)
•výtěžek 2 mol ATP z 1 mol glukózy
•starší a primitivní reakce než aerobní fosforylace
•probíhá v cytoplazmě
•Kvašení (reakce pyruvátu): alkoholové (kvasinky), mléčné, propionové, máselné atd.
•aerobní fosforylace
•celkem z jedné molekuly glukózy 38 ATP - tj. 19× účinnější než glykolýza
•i to je ale „jen“ 50% energie skryté ve vazbách, zbytek se uvolní jako teplo
•3 propojené systémy: Krebsův cyklus, systém elektronového transportu, systém aktivující kyslík
alkoholové kvašení
26

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Glykolýza
Snímek 13
3
pyruvát
0470

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Aerobní fosforylace
Snímek 14
4 0470
Krebsův cyklus

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Respirace - typy
Snímek 15
Typ respirace
Redukční reakce
Akceptor elektronů Þ produkt
Oxidační reakce
Donor elektronů Þ produkt
Aerobic
O2 Þ H2O
CH2O Þ CO2
Denitrifikace
NO3- Þ N2
CH2O Þ CO2
Redukce Mn
Mn4+ Þ Mn2+
CH2O Þ CO2
Redukce dusičnanů
NO3- Þ NH4+
CH2O Þ CO2
Redukce síranů
SO42- Þ HS-, H2S
CH2O Þ CO2
Methanogeneze
CO2 Þ CH4
CH2O Þ CO2

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Mineralizace uhlíku
•Rozklad přirozených organických polymerů
•
•musí předcházet vlastní mineralizaci na CO2
•rozklad celulosy zastávají hlavně houby, ale i aerobní bakterie
•rozklad ligninu je mnohem složitější, podílejí se na něm houby
•
Snímek 16
Lignin
Soubor:Celuloza.jpg
Celulosa
Lignin

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 17
Existují i metody měřící přímo in situ:
Litterbag metoda
- umožňuje studium dekompozice organického materiálu přímo in situ
-sáčky z nylonu, polyesteru, polyvinylu atd. jsou naplněny opadankou a v časových intervalech jsou
analyzovány úbytky váhy, změny ve složení organického materiálu apod.
-
Bait lamina test
Mineralizace uhlíku
a16fig01 Figure of the Bait-Lamina test 2007-08-27-MicroBait Litterbag

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Bazální respirace
•jako bazální mineralizace (= bez přídavku substrátu) koreluje s obsahem organické hmoty (Corg)
•
•ISO 16072 (2002): Soil quality - Laboratory methods for determination of microbial soil
respiration
•
•Důležitý parametr pro biologickou kvalitu půdy – BR (basal respiration)
•
•Limity a nevýhody:
•
•aktuální přídavek substrátu ovlivňuje podíl aktivních mikroorganismů
•
•relativní necitlivost k malým dávkám kontaminantů
•
•nutno kombinovat s jinými parametry (např. mikrobiální biomasa) či potenciální respirace (po
přídavku substrátu)
•
•nutno interpretovat s ohledem na obsah a dostupných organických látek v půdě
•
•u terénních měření nutno stanovovat opakovaně v čase – silná sezónní závislost
Snímek 18

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 19
Maintenance energy koncept
- část energie z oxidace, která není věnována biosyntéze
- je věnována údržbě existence, zdravého a funkčního organismu
-snížení růstové rychlosti = zvýšení maintenance energy
- dá se interpretovat: zvýšení respirace, bez zvětšení biomasy (bez růstu) znamená zvýšení
maintenace energy – může indikovat stres (samozřejmě v případě, že přísun substrátu je konstantní)
Bazální respirace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 20
Respirace je zcela klasický ekotoxikologický parametr
- výstup např. jako EC50 (IC50)
Vliv stříbra na bazální
respiraci půdy
0010 [USEMAP]
Respirace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Mineralizace uhlíku
•pokud chceme limitovat růst a zachytit pouze efekt na respirační aktivitu, je potřeba použít
„slabší“ substráty typu acetát a z tohoto důvodu se také přidává jen nízká koncentrace substrátu
Snímek 21

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 22
Toxický efekt zinku na respiraci 14C-acetátu u pěti mikroorganismů a jejich teoretické směsi
(„společenstva“)
90
Mineralizace uhlíku
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 23
Toxický efekt pentachlorofenolu na respiraci 14C-acetátu u pěti mikroorganismů a jejich teoretické
směsi („společenstva“)
Mineralizace uhlíku
91 [USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Mineralizace uhlíku
•ze studie se zinkem i pentachlorfenolem vyplývá, že 10% inhibice procesu je způsobeno více než 50%
inhibicí sensitivních druhů
•
• z toho vyplývá, že absence významnějšího efektu na proces (společný pro celé společenstvo
mikroorganismů) ještě nemusí garantovat, že žádný ze zahrnutých druhů nebyl ovlivněn!
•
•Ochrana procesu (zde respirace substrátu acetátu) neznamená ochranu všech zapojených druhů
•
•è sumární parametry fungují jako BLACK BOX
Snímek 24

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Mineralizace uhlíku - respirace
•Je hlavním parametrem pro posuzování vedlejších účinků chemikálií na půdní mikroflóru (další je
mineralizace dusíku) v normovaných testech (ISO, OECD, EPPO, EPA, SETAC).
•
•Tyto testy byly původně vyvinuty pro testování přípravků na ochranu rostlin, lze je však užít na
jakékoliv prospektivní hodnocení vlivů látek na půdní mikrobiální společenstva.
•
•
•OECD (2000): Soil microorganisms: Carbon transformation test. OECD guideline for the testing of
chemicals. OECD test 217.
•EPA (1996): OPPTS 850.5100 Soil microbial community toxicity test. Ecological effects test
guidelines. United States Environmental Agency.
•EPPO (1994): Decision making scheme for the environmental risk assessment of plant protection
products. EPPO Bulletin 24, Chapter 7, Soil Microflora.
•Lynch, M.R. (1995): Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides.
SETAC, Brussels, Belgium.
Snímek 25

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Testy účinků chemikálií na mineralizaci uhlíku
Snímek 26
Soil sampling
Storage
Pre-incubation
(7 days)
START
Substance application
Negative
control
Positive
control
7th day

14th day
21st day
28th day
Produced CO2 or other microbial parameters
10 g per replicate
aerobic conditions
60% WHC; 22°C; dark

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Testy účinků chemikálií na mineralizaci uhlíku
•standardizovány v podobě laboratorní inkubace definovaného vzorku půdy s paralelním měřením
různých parametrů v různých časech od počátku pokusu
•
•parametry užívané v normách jsou hlavně mineralizace uhlíku (produkce CO2) a též mineralizace
dusíku (ISO 14238, 1997; OECD 216, 2000), lze ovšem měřit i jiné parametry (Cbio, Nbio, potenciální
respiraci a potenciální mineralizaci dusíku ....)
•
•půda použitá pro test = musí to být přirozená půda, která je vybrána tak, aby byla citlivá vůči
kontaminaci a splňovala tzv. "nejhorší scénář", tj. maximální expozici mikroorganismů polutantu v
této půdě:
•více než 70% písku
•pH 5,5 - 7,0
•Corg 0,5 - 1,5%
•Cbio/Corg více než 1%
•kationtová výměnná kapacita vyšší než 70 mmol/kg
•
•tato reálná půda by měla být v historicky známé době nekontaminovaná, alespoň testovanou látkou
•
•Alternativy:
•vzhledem k možnosti přítomnosti resistentních mikroorganismů v reálném společenstvu existují
postupy, kdy je do sterilizované přirozené půdy inokulována specifická kultura mikroorganismů
(Pseudomonas putida, Bacillus cereus) è plynulý přechod k "solid phase testům (SPT)“ toxicity s
prokaryoty
Snímek 27

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Potenciální respirace
•po přídavku lehce využitelného substrátu není již respirace limitována substrátem a dostáváme
obraz potenciální respirace - PR - která odráží skutečné energetické potřeby a mineralizační
aktivitu mikrobiálního společenstva
•
•měření např. jako produkce
CO2 v metodě SIR
Snímek 28
61

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Potenciální vs. bazální respirace
Snímek 29
64
80%
]
]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Toxicita kadmia po 28 dnech
Snímek 30
CdCl2.2,5 H2O  ve formě vodného roztoku se současným ovlhčením půdy na 60% WHC koncentrace: 0,01;
0,1; 1; 10; 100; 1 000 a 10 000 mg Cd/g suš
[USEMAP]
NOEC byl pro BR 10 mg/kg a pro SIR 1 mg/kg
EC50 byla pro BR 7100 mg/kg a pro SIR 650 mg/kg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Test toxicity chlorovaného parafinu
Snímek 31
ØStimulace mineralizace dodekanem
Ødůvod: růst biomasy
ØC12:64 parafin – nevyužitelný jako dodekan!!!
Ønavíc C12:64 významně inhiboval SIR při 10 000 mg /gsuš
Øorganické chemikálie mohou být naopak substrát v mineralizaci !!!!
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Mineralizace / respirace / využití C substrátů
Snímek 32
•Respiraci lze vyjádřit jako vyrespirované množství C ze substrátu ...
•Rozdělení využití přidaného substrátu mezi respiraci (= zisk energie) a růst (= tvorbu biomasy)
může být chápáno jako obraz energetického statutu mikroorganismů a odráží působení stresu
0012 [USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Spotřeba kyslíku – BOD / BSK
•měření aktivity mikroorganismů ve vodě jako biochemical oxygen demand (BOD / BSK), např. BOD5
•
•BOD je mírou aerobních aktivit a růstu v kalech, sedimentech a vodních systémech, neboť kyslík je
v nich limitujícím nutrientem aerobních mikroorganismů
•
•lze měřit stav jednorázový, či změnu v čase, např. po přidání kalu k biodegradovatelné látce apod.
•
•čisté vody BOD5 cca 1 mg/L, znečištěné 2 – 8 mg/L, vyčištěná odpadní voda cca 20 mg/L a nečištěná
odpadní voda 200 – 600 mg/L
Snímek 33

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 34
několik možností; buď jako produkce oxidu uhličitého či spotřeba kyslíku
1) Měření respirace spotřebou O2:
systém, kde je ubývající kyslík nahrazován elektrochemicky
78
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 35
1) Měření respirace spotřebou O2:
- manometrické měření úbytku kyslíku
- Wartburgův respirometr
82 82
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 36
1) Měření respirace spotřebou O2:
- manometrické měření úbytku kyslíku
- OxiTop
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
OxiTop
Snímek 37
Pokles tlaku je přímo úměrný spotřebě kyslíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
OxiTop
Snímek 38
•Degradace hexadekanu v přítomnosti a nepřítomnosti polutantu
[USEMAP]
Šum
Kumulativní spotřeba O2 na ose Y
Čas

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 39
84
1) Měření respirace spotřebou O2:
- elektrochemické stanovení, využití např. v mikroelektrodách a respirometrech
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 40
40
1) Měření respirace spotřebou O2:
- kyslíková próba - elektroda s plynově permeabilní membránou
81 81
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 41
74
2) Měření produkcí CO2:
v uzavřených láhvích (statický systém)
- změna konduktivity roztoku NaOH
- titrací CO2 sorbovaného v roztoku NaOH
73
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 42
2) Měření produkcí CO2:
v uzavřených láhvích (statický systém)
- titrací CO2 sorbovaného v roztoku NaOH - princip biometru (viz. obr)
79
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 43
76
2) Měření produkcí CO2:
v uzavřených láhvích (statický systém)
- plynovou chromatografií jako headspace analýza
- nebo ve speciální injekční stříkačce
77
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 44
2) Měření produkcí CO2:
v průtočném systému (respirometry)
- detektor IRGA (infrared gas analysis) či plynová chromatografie (např. detektor TCD)
75
Metody měření mineralizace uhlíku
LI-610

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 45
Lze měřit i výměnu plynů in situ
Respirační koeficient
RQ = CO2 uvolněné /
O2 spotřebované
83
Metody měření mineralizace uhlíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 46
Mineralizace uhlíku - respirometrie
- systémy kontinuálně měřící respiraci, přesněji spotřebu kyslíku či produkci oxidu uhličitého
- různé metody detekce, různý design přístrojů
Využití pro aerobní i anaerobní aplikace, pro studium biodegradací, kinetiku růstu sledovanou
pomocí produkce produktu atd.
85
Metody měření mineralizace uhlíku
oxymaxBGM Respicond%201w Australia%203web

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 47
Mineralizace uhlíku - respirometrie - využití v mikrobiální ekotoxikologii
- měření BOD (biochemical oxygen demand) pro odpadní vody
- měření kinetiky respirace po přidání různých substrátů
- měření biodegradačních pochodů
- testování toxicity
- testování stability kompostu
- testování aktivních kalů
Metody měření mineralizace uhlíku
aer200sgrey

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Inhibice respirace aktivovaného kalu
•stanovení efektu toxické látky na respirací bakterií
• komplexní (nedefinované) společenstvo
• zdroj – laboratorní kultivace, čistírny odpadních vod (biologické čištění)
• kultivace bakterií (Erlenmayerovy nádoby)
• vyhodnocení – stanovení spotřeby kyslíku (oxymetr, DO – dissolved oxygen) •modifikace – stanovení
dalších parametrů – nitrifikace ....
•
48
1

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Růstová kinetika měřená respirací - Nordgren
Snímek 49
Kinetika
Microbial growth – associated product formation

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ISO 17155
Snímek 50
50
ISO 17155 (2002): Soil quality - Determination of abundance and activity of soil microflora using
respiration curves
- metoda stanovení "kontaminace" půdy (tzv. ecotoxic potential) a efektu kontaminace v
laboratorních studiích
92
Důležité parametry:
- lag time - čas od přídavku substrátu do počátku exponenciálního růstu - reflektuje vitalitu
"growers"
- růstová rychlost µ
- aktivační koeficient respirace
 QR = RB/RS
- čas k dosažení píku
Znečištěná půda:
QR >0,3
lag > 20h
tpeakmax > 50h
Resp. rychlost na ose Y v LOG ! è µ je směrnice přímky

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 51
Vliv chemikálií:
- endpointy jsou lag time, µ a CR, což je kumulativní produkce CO2 od přidání substrátu do píku
- vynesením hodnot CR oproti logaritmickým  koncentracím testované látky dostáváme klasickou křivku
dávka-odpověď S tvaru, z níž lze vypočítat EC
93
Kinetika SIR

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Většinou na datech RR, ne kumulativních
Snímek 52

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 53
0020 0020
Kinetika SIR
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 54
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 55
[USEMAP]
spíše stimulace
hypotéza: pesticidy jsou buď substrát či zabijí citlivou složku společenstva, která je potom jako
lehce dostupný substrát pro rezistentní druhy

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Microbial growth – associated product formation
Snímek 56
2 píky !
Závislost na podmínkách např. dostupnosti živin pro růst (N a P)
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Microbial growth – associated product formation
Snímek 57
2 píky !
Dva píky pozorovány u půd uměle kontaminovaných vysokou dávkou toxikantu – resistentní část
společenstva

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 58
Kvantifikace přírůstků produktu (CO2) díky r-stratégům (growers) a K-stratégům (nongrowers)
dp/dt ... rychlost formace produktu
X ... aktivní mikroorganismy
µ … specifická růstová rychlost
q … specifická aktivita
rovnice platná pro čisté kultury a pro reálné environmentální vzorky
přídavek substrátu
odpověď r-stratégů = růst
odpověď K-stratégů = pouze zvýšení rychlosti respirace
Krátkodobá kinetika SIR
integrace
K = konstantní RR non-growers
r = počáteční RR growers (=q.X0)
v čase t = 0 je SIR = r + K

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 59
- prodloužené měření respirace po přidání glukózy (+ amoných iontů a fosfátů jako nezbytných živin)
- před přidáním glukózy je zaznamenána bazální respirace
- v čase t=0 narůstá respirace díky respiraci r + K stratégů (r - growers; K - nongrowers)
- během další doby je příspěvek K stratégů konstantní a nárůst je díky exponenciálnímů nárůstu
populace r stratégů (dle r.eµ.t) (growth associated product formation)
63
přídavek glukózy
Kinetika SIR

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 60
65
Kinetika SIR
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 61
61
Kinetics of Substrate - induced Respiration (SIR) and Denitrification: Applications to a Soil
Amended with Silver
•S tímto přístupem bylo možno studovat růst a aktivitu odděleně
•Parametry odvozené z tohoto přístupu se ukázaly citlivější než samotné BR, zejména K a µ
•Tento přístup se ukázal jako vhodný pro objasnění mechanismů toxicity na mikroorganismy
0011 0011
Kinetika SIR
[USEMAP]
Ag přidáno 10 dní před glukosou
Ag přidáno s glukosou
Ag přidáno 10 dní před glukosou
Ag přidáno s glukosou

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 62
Mineralizace uhlíku - biodegradační pokusy
- mineralizace různých substrátů se využívá pro hodnocení biodegradability látek
- měření jako úbytku látek (UV spektrofotometrií, fluorimetrií - PAHs, HPLC, GC, MS ...)
- existuje celá věda kolem biodegradací a řada standardních norem:
 Půda
ISO 15473 Soil quality -- Guidance on laboratory testing for biodegradation of organic chemicals in
soil under anaerobic conditions
ISO 14239:1997 Soil quality -- Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of
organic chemicals in soil under aerobic conditions
Voda
ISO 8192:1986 Water quality -- Test for inhibition of oxygen consumption by activated sludge
ISO 9408:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds
in aqueous medium by determination of oxygen demand in a closed respirometer
ISO 9439:1999 Water quality -- Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds
in aqueous medium -- Carbon dioxide evolution test
---------------------------------------------------------------------------------------------------
-------------------------------------
ČSN EN ISO 9408 Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek
ve vodním prostředí stanovením spotřeby kyslíku v uzavřeném respirometru
ČSN EN ISO 9439 Jakost vod - Hodnocení úplné aerobní biologické rozložitelnosti organických látek
ve vodním prostředí - Metoda stanovení uvolněného oxidu uhličitého
Mineralizace uhlíku – biodegradační pokusy

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Procesy spojené s cyklem dusíku
Snímek 63
99
hlavní zásobárna je atmosféra, fixace N2 je pomalá, oproti tomu neustálý cyklus různých jiných
forem N v půdě je intenzivní
mikroorganismy jsou stěžejní, neboť katalyzují zásadní přeměny dusíkatých látek
dusík existuje v řadě podob od -3 v amoniaku do +5 v dusičnanech
na rozdíl od uhlíku jde spíše o minerální cykly
jde o naprosto esenciální prvek pro rostliny a mikroorganismy
většinou jej potřebují v jiných formách než N2
vstup antropogenní představuje asi 1/5 biologické fixace!!
135 Mt/rok
40 Mt/rok
30 Mt/rok
140 Mt/rok
70 Mt/rok

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 64
010
Hlavní roli hraje půda
Procesy spojené s cyklem dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 65
005
mikroorganismy
rostliny
Procesy spojené s cyklem dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 66
Mikroorganismy jsou naprosto stěžejní:
1) kromě sinic a symbiotických bakterií nedovedou organismy poutat N2
2) zpětné uvolňování dusíku do atmosféry
3) transformace forem dusíkatých sloučenin
100
Procesy spojené s cyklem dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Fixace dusíku
Snímek 67
•N2 je fixován do NH3 : N2 + 6e- à 2NH3 (+630 kJ/mol)
•
•sinice (hlavně ve vodách - Aphanizomenon, Nostoc, Anabaena); symbiotické bakterie
(Rhizobacteriacae - luštěniny); kolem 100 druhů volně žijících bakterií aerobních i anaerobních
(Azotobacter, Azospirileum, Beijernickia, Clostridium)
•
•systémy se liší v množství poutaného dusíku; nejvíce fixují symbiotické asociace, neboť v okolí
kořenů je přísun živin
0033 005
•jde o proces spotřebovávající energii; probíhá jen v dobrých podmínkách; je tedy citlivý endpoint
ke stresu
•
•inhibující vliv má obecně amoniak a pro volně žijící fixátory vysoké koncentrace kyslíku; některé
ale mají systém chránící nitrogenázu před působením kyslíku
Pozn.: organismy kterým stačí N2 jako jediný zdroj dusíku se nazývají diazotrofní

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 68
•ústředím této schopnosti je enzymový NITROGENÁZOVÝ KOMPLEX: (di)nitrogenáza-reduktáza (Fe protein)
má funkci při redukci (di)nitrogenázy (Mo-Fe proteinu), která redukuje N2 na NH3
•nitrogenáza je kódována tzv. nif geny
006
!
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 69
•proces je velmi pomalý (jedna molekula cca 1,25 sec) a fixující bakterie mají vysoký obsah těchto
proteinů
•
•enzym také dokáže redukovat jiné molekuly: kyanid, N2O, CO, C2H2 (poslední je principem hojně
užívané metody Acetylene Reduction Assay)
006
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 70
•spolupráce mikroorganismů a rostlin mají povahu symbiózy, kdy mikroorganismus dodává dusík a
využívá dostupné zdroje substrátu v okolí či uvnitř rostlinných kořenů
•
•kauzální či asociační symbióza - nevyžaduje morfologické změny mikroorganismu ani rostliny, ani
genetické interakce; je záležitostí volně žijících fixátorů, kteří se asociují s některými
rostlinami v jejich rhizosféře (cukrová třtina, rýže, žito ..) či dokonce uvnitř tkání kořenů
•v lesních ekosystémech je významná symbióza dřevin s aktinomycetou Frankia
alder
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 71
71
•symbióza luštěniny-Rhizobium - vzniknou fyziologické změny obou organismů - vznikají kořenové
hlízky (nodule)
•bakterie se mění v tzv. bakteroid a dochází ke genetické interakci mezi rostlinou a bakterií
•proces je složitý, ale poměrně dobře popsán: zapojují se regulační faktory od rostliny
(flavonoidy) à bakterie produkuje signální molekuly = nod faktory (např. lipochitooligo-sacharid -
LCO), které interagují s rostlinou a iniciují tvorbu nodulí
•
•1 - 2 týdny po infekci jsou viditelné hlízky
•fixovaný dusík je exportován do kořenové tkáně jako asparagin či purin
•nitrogenáza je chráněna tzv. leghaemoglobinem, který produkují rostliny
007
Fixace dusíku
240px-Lotus_japonicus Agrobacterium-tumefaciens

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 72
009 clover Frankia1
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 73
Nods on beans LR
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 74
Měření:
Acetylene reduction assay (ARA)
-
- využívá větší afinity nitrogenázy pro acetylen
- systém s půdou, případně i s rostlinami, je vzduchotěsný
- prostor nad půdou se z 10% nasytí acetylénem či směsí acetylen-kyslík a po několika hodinách se
měří ethylen
- redukovaný ethylen se stanovuje GC s FID detektorem
- užívá se faktor 3 molů ethylenu na 1 mol fixovaného N2
- je velmi citlivou, levnou a jednoduchou metodou
-
-
-
-alternativou je měření fixace 15N - nutná drahá instrumentace (IRMS)

- může se také sledovat rychlost růstu organismů na médiu bez dusíku
- často se sleduje také přítomnost hlízek u cílových rostlin
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 75
75
V půdách kontrolovaného pokusu byly sledovány buňky Rhizobium leguminosarum schopné tvořit hlízky u
jetele po ošetření různým množstvím čistírenského kalu s obsahem těžkých kovů a dusičnanů. Půdy se
také lišily v pH. Byl pozorován zřejmý vliv pH, typu kalu a obsahu těžkých kovů na velikost
populace rizobijních bakterií i na fixaci dusíku.
0002 0002 [USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 76
0018
[USEMAP]
Fixace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Asimilace a imobilizace dusíku
Snímek 77
011

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Asimilace a imobilizace dusíku
Snímek 78
78
•dusík je uvolňován jako NH3 z organické hmoty - AMONIFIKACE
•NH3 je asimilován z půdy do živých organismů, velmi dobře jako NH3 v této formě hlavní zdroj
dusíku pro rostliny a mikroorganismy
•kromě toho i asimilační redukce dusičnanů
•
005
001 001
ASIMILACE
•
•ve většině případů energii spotřebovávající proces asimilace
•
•
•v případě vysokých koncentrací (> 0,5ppm) dochází k katalytické vazbě do glutamátu

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Amonifikace
Snímek 79
•proces kdy se NH3 uvolňuje z glutamátu (uvnitř buněk)
•
•či proces kdy enzymem ureázou se štěpí močovina
•
•nebo extracelulární degradace proteázami, lysozymy, nukleázami
001 001
Mechanismy:
•hydrolytická deaminace: R-NH2 + H2O à R-OH + NH3
•oxidativní deaminace: R-CHNH2-COOH + H2O à R-CO-COOH + 2H+ + NH3
•reduktivní deaminace: R-CHNH2-COOH + 2H+ à R-CH2-COOH + NH3
•desaturativní deaminace: R-CH2-CHNH2-COOH à R-CH=CH-COOH
Závislost na množství N v prostředí:
• při poměru C:N < 20 převládá amonifikace
• při C:N > 20 asimilace
•
Metodicky lze rozlišit amonifikaci jako bazální úroveň mineralizace N - obdoba bazální respirace v
cyklu C; a potenciální amonifikaci po přídavku substrátu (argininu) - obdoba potenciální respirace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 80
AMONIFIKACE JE SOUČÁSTÍ ŠIRŠÍHO POJMU: MINERALIZACE DUSÍKU
NEBOŤ ČÁST NH3 SE DÁLE OXIDUJE PŘI NITRIFIKACI
- metodicky nelze obě fáze příliš dobře oddělit!!!
- pokud chceme znát skutečnou (ne potenciální) amonifikaci je jedinou možností měření se značeným
dusíkem 15NH4+ či vytvořit anaerobní prostředí zatopením vzorků
- mineralizace N je funkcí teploty, vlhkosti, provzdušnění, typu dusíkatých organických látek v
prostředí a také pH
-při procesech vnikají produkty se zcela jinými environmentálními osudy:
NH4+ je stabilní, v půdě se váže na částice koloidů
NO3- se z půdy rychle vymývá do podpovrchových i povrchových vod; je toxický (methemoglobinémie a
nitrosaminy) a způsobuje eutrofizaci a degradaci vodních ekosystémů
Kvůli mobilitě a vyplavování dusičnanů z půd se v zemědělství můžeme setkat s cílenou inhibicí
nitrifikačních aktivit !!!
Toto hrozí zejména při hnojení hnojivy obsahující amonné ionty či přímo dusičnany.
Mineralizace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 81
012
Mineralizace dusíku

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 82
Měření:
Amonifikace - AMO (postup UKZUZ)
-
- vzorek zatopený vodou je inkubován týden při 40°C
 stanovení amonných iontů se provádí po extrakci 1M KCl (1:5) spektrofotometricky (ISO 14256): při
630 nm se sleduje zabarvení vzniklé reakcí s NaOCl a phenolátem sodným (salicylanem sodným),
katalýza nitroprusidem sodným (Berthelotova reakce)
 jinou možností je stanovení iontově selektivní plynovou elektrodou (ISE): amonné ionty se převedou
na amoniak při pH 11-13 přídavkem 10M NaOH; potenciál se měří elektrodou, přičemž ke kalibraci se
užije roztoků síranu amonného
- vyjadřuje se jako µg NH4+-N . gsuš.-1 . d-1
-
Alternativou je měření se značeným dusíkem 15NH4+
Amonifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 83
Měření:
Potenciální amonifikace (PAMO) - test s argininem
-
- přídavek substrátu (argininu) a stanovení amonných kationtů po 3h inkubace půdy při 30°C
-
- stanovení amonných iontů se provádí po extrakci 2M KCl (1:4) spektrofotometricky (ISO 14256): při
630 nm se sleduje zabarvení vzniklé reakcí s NaOCl a phenolátem sodným (salicylanem sodným),
katalýza nitroprusidem sodným (Berthelotova reakce)
-
- jinou možností je stanovení iontově selektivní plynovou elektrodou (ISE): amonné ionty se
převedou na amoniak při pH 11-13 přídavkem 10M NaOH; potenciál se měří elektrodou, přičemž ke
kalibraci se užije roztoků síranu amonného
-
-
Metoda dává falešné výsledky v kyselých
půdách a v půdách po aktuálním
přídavku organické hmoty
PAMO není selektivně inhibována
cycloheximidem či streptomycinem a proto
nelze odděleně měřit amonifikaci bakterií a hub
102
Amonifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 84
Měření:
Potenciální amonifikace (PAMO) - test s argininem
Amonifikace
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Amonifikace
Snímek 85
Měření:
Potenciální amonifikace (PAMO) - test s argininem
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 86
[USEMAP]
Amonifikace
Měření:
Potenciální amonifikace (PAMO) - test s argininem
è  EC55 = 50 mg/kg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 87
[USEMAP]
Měření:
Potenciální amonifikace (PAMO) - test s argininem

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 88
- významný, umožňuje mobilitu dusíku v půdě (plus i mínus)
Dva kroky:
I. HN4+ + O2 + 2H+ à NH2OH + H2O à NO2- + 5H+
DG = -66 kcal
II. NO2- + 0,5O2 à NO3-
DG = -18 kcal
- oba kroky jsou striktně aerobní
-zastává jej jen několik rodů, v půdě první krok např rod Nitrosomonas, Nitrococcus a druhý krok
např. rod Nitrobacter
- zdrojem uhlíku je pak CO2
- enzym pro první krok je amoniak monooxygenáza (AMO), která má širokou substrátovou specifitu a
může kometabolicky oxidovat i některé polutanty např. TCE či alkany až do C8 – využití při
bioremediacích !!!
005
002
Nitrifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 89
Velmi dobrý indikátor stresu, je silně inhibována polutanty - důvody:
1)celý systém zisku energie je velmi náročný: 1. krok potřebuje oxidaci 34 molů amoniaku k fixaci
jednoho molu CO2, druhý krok dokonce oxidaci 100 molů NO2- !!
2)
2)dva kroky s přičiněním různých populací, druhý krok je méně energeticky výtěžný (jen 70 kJ/mol!)
pokud kroky navazují, nedochází k negativní kumulaci dusitanů (snižuje pH prostředí, toxický ..)
dusitany inhibují první krok !!!
1)
3)obecně už tak dost citlivý proces k environmentálním podmínkám: pH optimum je 6,6 - 8,0; při pH <
4,5 se zastaví
4)
4)
4)
Pozn: exitují i mikroorganismy heterotrofní, které provádí nitrifikaci a není známo proč
představují minoritní význam ve srovnání s autotrofní nitrifikací
Nitrifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
•Jelikož se nitrifikace skládá ze dvou nezávislých kroků, je možné teoreticky očekávat některou
z následujících možností účinku polutantu na tento proces:
•
•a) Látka může toxicky působit na obě fáze procesu, nebo pouze na první krok (jehož produkt je
zároveň hlavním zdrojem substrátu pro 2. krok). Tyto případy se projeví úbytkem koncentrace jak
dusitanů, tak dusičnanů ve sledované půdě.
•
•b) Polutant inhibuje pouze 2. krok nitrifikace. To vede k prodloužení doby zpoždění (lag fázi)
produkce dusičnanů a k akumulaci dusitanů v prostředí. Jelikož nadměrné koncentrace dusitanů mohou
působit toxicky na obě fáze procesu, konečným důsledkem může být také inhibice nitrifikace jako
takové.
•
•c) Vzácněji může docházet k stimulaci nitrifikace. Možným vysvětlením je působení toxické látky na
jinou složku mikrobiálního společenstva, jehož následkem je odumření většího počtu buněk. Ty jsou
pak k dispozici jako substrát umožňující růst nezasaženým organizmům a stimulaci nitrifikace
zvýšenou dostupností amoniaku.
Snímek 90
Nitrifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 91
102
Obě fáze nitrifikace lze metodicky oddělit pomocí inhibitorů
Nitrifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 92
Měření:
- krátkodobá (SNA) či dlouhodobá (LNA)
- většinou preferována SNA, neboť po delší době nastávají změny ve společenstvu
Potenciální nitrifikace (SNA) (NEA - nitrifier enzyme activity)
(potential amonium oxidation - PAO)
- testování vlivu chemických látek a indikační parametr pro půdu
- protože čas metody je krátký, nemůže dojít k růstu populace nitrifikátorů a je tedy též odhadem
velikosti populace oxidátorů amoniaku
-
ISO 15685 (2004): Soil quality - Determination of potential nitrification - Rapid test by ammonium
oxidation
- jde o velmi rychlý test vlivu chemikálií na první stupeň nitrifikace
SOIL SLURRIES
•půda je inkubována v pufrované suspenzi s roztokem chlorečnanu sodného (inhibuje oxidaci dusitanů
na dusičnany) s přídavkem saturujícího množství síranu amonného (substrát pro oxidaci amoniaku na
dusitany)
•po 6 hod či déle, eventuálně každé 2 hodiny se měří koncentrace NO2-
•koncentrace dusitanů se měří po extrakci KCl spektrofotometricky reakcí s sulfanilamid a
Griess-Ilosvay činidlem = N-(1–naftyl)ethylen-diamin dihydrochlorid
•jako referenční látku lze užít nitrapyrin
Nitrifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 93
Měření:
- krátkodobá (SNA) či dlouhodobá (LNA)
- většinou preferována SNA, neboť po delší době nastávají změny ve společenstvu
Nitrifikace (LNA)
Delší inkubace se příliš nedoporučují, neboť mohou probíhat změny společenstva.
ISO 14238 - Determination of nitrogen mineralization and nitrification in soils and the influence
of chemicals on these processes
- půda inkubována po přídavku 1% síranu amonného; po 1-3 týdnech stanovení zbylého NH4+ či
vzniklého NO3-
• jak pro stanovení jako parametru kvality půdy
• tak pro testování toxicity látek na N mineralizaci
Test toxicity:
• půda pro test toxicity musí být s Corg 0,5 - 1,5% a nízkým obsahem jílu
• přidává se organický zdroj dusíku - vojtěška (C:N = 16)
• testovaná látka se přidá v cca 5 koncentracích a po 28 denní inkubaci se měří NO3-
• výsledkem je procentuální inhibice
Nitrifikace

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 94
94
0018
Používají se jako cílené inhibitory nitrifikace v zemědělství proti ztrátám dusíku z půdy
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 95
Při stanovení mineralizace dusíku se často spojují oba procesy (amonifikace a nitrifikace) v tzv. N
mineralization potential
- je to vyprodukovaná suma NH4+ + (NO2-)+ NO3- v půdě na konci inkubace (extrakce  roztokem KCl)
-pokud testujeme vliv chemické látky, dostáváme klasický vztah dávka odpověď s IDs
-
-
Stanovení koncentrace dusičnanových a dusitanových aniontů v půdách:
Dusitany
dle ISO 14256 spektrofotometricky - reakcí s Griess-Ilosvayovým činidlem (sulfanilamid a N-1-naftyl
etylendiamin chlorid) tvoří azobarvivo (543 nm)
Dusičnany
nejprve nutno redukovat na dusitany (reduktor z kadmia – Devardova slitina) a pak stejné stanovení
nebo UV spektrofotometrií při 210 nm
nebo iontově selektivní elektrodou ISE
v dnešní době existují automatické analyzátory: FIA - flow injection analyzator
N mineralizační potenciál

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 96
Měření
N mineralization potential
101
N mineralizační potenciál

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 97
0019
N mineralizační potenciál

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 98
[USEMAP]
PAO

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 99
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Denitrifikace
Snímek 100
- v anaerobních podmínkách, dusitany a dusičnany slouží jako TEA
Dva typy:
I. dusičnany se redukují na dusitany a dále na amonné ionty- fakultativmě anaerobní bakterie
(Escherichia ....)
II. NO3- --> NO2- --> NO --> N2O --> N2 - bakterie (pseudomonády ...)
N2O – skleníkový plyn !!!
Měření: kolorimetrickými technikami, iontově selektivními elektrodami, metodou "acetylene block"
(zablokuje N2O reduktázu a N2O je měřen GC)
005

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 101
101
•The acute toxicity effects of 54 pesticides on denitrification and nitrification in soil were
studied in the laboratory.
•
•Potential denitrification activity (PDA) was assayed with an acetylene inhibition method, during
which the specific growth rate constant of denitrifiers (µPDA) could also be determined.
•
•Potential ammonium oxidation activity (PAO) was assayed with the chlorate inhibition method.
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 102
0006
0006
! logaritmicky znázorněné koncentrace testované látky !
! relativní hodnoty !
• In a subsequent dose-response test NOEC, EC50 and EC90 were determined for mancozeb (PDA and PAO)
and 2,4-DB, ioxynil, maneb, zineb and nitrapyrin (PAO).
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 103
0007
Conclusion: All three parameters are suitable for inclusion in a test system for assessing effects
on the soil environment.
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 104
0013 [USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Procesy spojené s dalšími biochemickými cykly
Snímek 105
105
- nemají žádné speciální využití v mikrobiální ekotoxikologii
- mohou sloužit jako endpoint v polních studiích i laboratorních pokusech, mikrobiální
ekotoxikologie jim však věnuje velmi malou pozornost
105

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Enzymatické aktivity
•enzymy jsou jak v buňkách (cytoplazma, periplazma, vnější povrch...), tak v mrtvých,
polorozložených buňkách i v extracelulárních komplexech s jíly či huminovými koloidy (v této podobě
jsou odolnější proti proteolýze) ====> opatrnost při interpretacích enzymových aktivit
•
•etracelulární enzymovou aktivitu lze odlišit např. po ozáření gama paprsky (inaktivují buňky)
•
•enzymy v půdě podléhají změnám, které jsou při odběru ==> snaha udržet podobné podmínky jako in
situ, hlavně teplotu, vlhkost, redox potenciál
•
•jsou využívány spíše v krátkodobých studiích, aby nedošlo ke změně velikosti společenstva
Snímek 106
159

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 107
Enzymové reakce
- nemění se energetika reakce (ΔG je konstantní pro danou reakci)
- mění se pouze aktivační energie (snížení)
- nemění se ani rovnováha reakce (ALE rovnováha nemůže konat práci)
- živé organismy neustále vytváří nerovnováhy a ty konají práci (nutné, aby byly otevřené systémy)
3
Enzymatické aktivity

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 108
Enzymová kinetika
Michaelis - Mentenová:
- popisuje reakční kinetiku vzniku enzym-substrát komplexu
- vyplývají z toho důležité parametry enzymu,
důležité například při biodegradacích
Km (Michaelisova konstanta)
- parametr substrátu (koncentrace při níž je dosaženo poloviční Vmax (polovičního nasycení enzymu)
- vysoká značí nízkou afinitu pro daný substrát (průměrně kolem 10-2 - 10-5 mol/litr)
- výpočet z experimentů a pak z rovnice:
či Lineweaver - Burkeho transformace:
33 34
Enzymatické aktivity

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 109
Sledování enzymatických aktivit - enzymy v půdě
-obecný princip spočívá v přídavku nadbytku substrátu a sledování jeho úbytku či produkce produktu
za současné inhibice růstu mikroorganismů
-měří se enzymatický potenciál či kinetické parametry Vmax
Nejčastěji sledovány:
 dehydrogenázy
 proteázy - inkubace s kaseinátem sodným
 ureázy - inkubace s močovinou
 amidázy
 fosfatázy
 celulázy
 β - galaktozidázy
Enzymatické aktivity

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 110
68
Enzymatické aktivity

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 111
Particle-size fractionation of a heavy metal polluted soil was performed to study the influence of
environmental pollution on microbial community structure, microbial biomass, microbial residues and
enzyme activities in microhabitats of a Calcaric Phaeocem.
In 1987, the soil was experimentally  contaminated with four heavy metal loads: (1) uncontaminated
controls; (2) light (300 ppm Zn, 100 ppm Cu, 50 ppm Ni, 50 ppm V and 3 ppm Cd); (3) medium; and (4)
heavy pollution (two- and threefold the light load, respectively).
[USEMAP] pdf-preview
After 10 years of exposure, the fractions also differed with respect to substrate utilization:
Urease was located mainly in the <2 mm fraction, alkaline phosphatase and arylsulfatase in the 2–63
µm fraction, and xylanase activity was equally distributed in all fractions.
Soil enzyme activity was reduced significantly in all fractions subjected to heavy metal pollution
in the order arylsulfatase > phosphatase > urease > xylanase.

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 112
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 113
[USEMAP]
Fluorescein diacetate hydrolysis (FDA) assays can be used to measure enzyme activity produced by
microbes in a sample.
A bright yellow glow is produced and is strongest when enzymatic activity is greatest. This can be
quantified using a spectrophotometer.
It is often used to measure activity in soil and compost samples, however may not give an accurate
reading if microbes with lower activity phases such as esterases cleave the fluorescein first.
0060

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Dehydrogenázová aktivita
Snímek 114
- enzym, který z ekotoxikologického hlediska vysoce převažuje všechny ostatní
- oxidace org. substrátu v aerobních podmínkách je spojena s transportem elektronů na membráně a
finální ekceptací na O2 (tento proces spojen se syntézou ATP); zůčastněné NADPH + H+ a
FADH2 vznikají pomocí dehydrogenáz (flavoprotein-NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase,
acyl-CoA dehydrogenase)
- dehydrogenázová aktivita je tedy mírou celkové mikrobiální aktivity

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 115
Barviva:
TTC (triphenyl-tetrazolium chlorid) ---> TPF (triphenyl formazan)
5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC)
INT (Iodonitrotetrazolium chloride) ---> INF
resazurin ---> resorufin
Resazurin
lmax = 601,2nm
modrofialová barva
Resorufin
λmax = 571,4nm
růžová barva
167
Dehydrogenázová aktivita
146-68-9

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 116
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 117
Dehydrogenázová aktivita

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 118
Dehydrogenázová aktivita

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 119
Dehydrogenázová aktivita

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Dehydrogenázová aktivita
Snímek 120

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Dehydrogenázová aktivita
Snímek 121

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Dehydrogenázová aktivita
Snímek 122

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ß - galaktozidáza
Snímek 123

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
•Substráty pro stanovení beta-galaktozidázy:
•ONPG BEZBARVÁ - ŽLUTÁ
•CPRG NAŽLOUTLÁ - ČERVENÁ
•Chlorophenol red-beta-D-galactopyranoside,monosodium salt
•4-methylumbelliferyl β-d-galactosipyranoside è 4-methylumbelliferone – fluorescence
•X-GAL ŽLUTÁ - MODRÁ
•5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranoside, crystals
Snímek 124
prwfig25 ONPG_tubes
ß - galaktozidáza

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 125
ß - galaktozidáza

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 126
ß - galaktozidáza

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ß - galaktozidáza
Snímek 127

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 128
ß - galaktozidáza
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 129
= biologická produkce viditelného světla
Vyskytuje se přirozeně např. u ryb, světlušek, bakterií Vibrio fisheri
Ideální modelový systém pro testování toxických vlivů
Jde o proces silně exergonický, kdy je vyzářeno asi 0,1 světelných kvant na 1 molekulu
spotřebovaného substrátu. U světla o vlnové délce 500 nm jde o energii 210 kJ/mol fotonů, což
odpovídá 6 molekulám ATP na jeden foton. Při kvantovém výtěžku 0,1 jde o spotřebu 60 molekul ATP na
jeden vyzářený foton!!!
Plně svítící bakterie vyzáří mezi 103 - 105 fotonů za sekundu, což představuje výraznou
energetickou zátěž (většina energie se věnuje svícení).
Už tak jsou tedy tyto bakterie dosti zatížené, proto jsou velmi citlivým systémem na jakýkoliv
další stres.
Bioluminiscence
firefly-glowwyrm gallery5_1 180px-Sepiola_atlantica

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 130
Geny u bakterií související s bioluminiscencí kóduje Lux operon
Proces spojený s oxidoredukčními pochody, kdy je chemická energie molekuly transformována v energii
světelného kvanta
Bakteriální luciferáza - membránový enzym, katalyzuje rakci, kdy kyslík oxiduje víceuhlíkatý
alifatický aldehyd RCHO a redukovaný flavin mononukleotid v průběhu procesu molekulárním kyslíkem
FMNH2 + RCHO + O2 è FMN + RCOOH + H2O + hv(490nm)
•
V podstatě jde o boční větev toku elektronů ve flavoproteinové části aerobního respiračního retězce
Luciferázový systém má větší afinitu ke kyslíku než respirační systém è Při nedostatku O2 poklesne
respirační aktivita až na 10 % normálu, aniž by se pozastavila biolumuniscence; při intenzívním
růstu (nedostatek ATP, NADH2) intenzita luminiscence klesá nebo dokonce mizí
Bioluminiscence
File:Reduced Flavin mononucleotide FMNH2.svg

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Bioluminescence response-
directly assesses contaminant toxicity
Snímek 131
Bioluminiscence

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 132
Měření bioluminiscence u prokaryot - MICROTOX test
ISO 11348-1:1998 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the
light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 1: Method using freshly
prepared bacteria
ISO 11348-2:1998 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the
light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 2: Method using liquid-dried
bacteria
ISO 11348-3:1998 Water quality -- Determination of the inhibitory effect of water samples on the
light emission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) -- Part 3: Method using freeze-dried
bacteria
ČSN EN ISO 11348-(1) Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio
fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 1: Metoda s čerstvě připravenými bakteriemi
(leden 2000)
ČSN EN ISO 11348-2 Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio
fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 2: Metoda se sušenými bakteriemi
ČSN EN ISO 11348-3  Jakost vod - Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio
fischeri (Zkouška na luminiscenčních bakteriích) - Část 3: Metoda s lyofilizovanými bakteriemi
Bioluminiscence

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 133
Využití - MICROTOX test:
-nejpoužívanější bakteriální test toxicity
- komerční „kitová“ verze testu v Vibrio fisheri
- "svítící" bakterie Vibrio fisheri je velmi citlivá zejména vůči akutně toxickým látkám
- dobře reprodukovatelný test (koeficient variance 3 -15%)
Bioluminiscence
art06-2 microtox2

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Test akutní toxicity - MICROTOX
•mořská luminiscenční bakteri Vibrio fisheri
• krátkodobá expozice testované látce (5-30 min)
• sledování změn přirozené luminiscence – odpovídá toxicitě
•
• uspořádání:
kyvety (zkumavky), stanovení v luminometru
•
134
figure4 1

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Test akutní toxicity - MICROTOX
•Zkušebním kritériem je snížení luminiscence po expozici 15 a 30 min nebo volitelně po 5 min
•Inhibice vzorkem je vyjádřena jako ředění vyvolávající 20% a 50% inhibici emise světla v porovnání
s kontrolou
•Rušivé vlivy
–Nerozpustné, málo rozpustné, těkavé látky, látky reagující s ředící vodou, zkušební suspenzí,
měnící své složení v průběhu zkoušky
–Silně zbarvené nebo zakalené vzorky
–Vzorky s vysokou spotřebou kyslíku
–Znečištění vzorku organickými dobře biologicky rozložitelnými živinami
–Koncentrace solí přesahující 30 g/l
135

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Test akutní toxicity - MICROTOX
Snímek 136

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Test akutní toxicity - MICROTOX
•Příprava zásobní suspenze
–K lyofilizované kultuře bakterií je do temperovaných zkumavek přidána destilovaná voda è
rehydratovaná suspenze
•Příprava zkušební suspenze (50:1)
–A) Zkušební zkumavky – do vytemperovaných zkumavek je k médiu přidána zásobní suspenze
–B) Enlenmayerova baňka – k médiu je přidána zásobní suspenze a ve stejném časovém intervalu
pozdějšího měření intenzity je do temperovaných zkumavek odměřeno 500 μl zkušební suspenze
•Postup zkoušky
–Vzorky z postupně celé ředící řady se vloží do luminometru (adaptace nejméně 15 minut) a měří se
intenzita luminiscence jednotlivých vzorků a to ve stejných časových intervalech (doporučeno 20 s)
–Znovu se intenzita luminiscence měří po 15 a 30 min, popř. volitelně po 5 min
•Vyhodnocení
–Výpočet průměrného inhibičního účinku Ht v procentech (vzorce uvedené v normě), stanovení hodnot
EC (nejčastěji EC20 a EC50)
137

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Test akutní toxicity - MICROTOX
•Validita testu
–Hodnota fkt pro 30 min inkubaci je v rozsahu 0,6 – 1,8
–Paralelní stanovení se neodchylují od svých průměrů o více jak 3 %.
–Tři srovnávací látky způsobují při 30 min expozici inhibici 20 – 80 % v následujících
koncentracích:
•3,4 mg/l - 3,5-dichlofenolu
•2,2 mg/l - Zn2+ (jako heptahydrát síranu zinečnatého)
•18,7 mg/l - Cr6+ (jako dichroman draselný)
138

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 139
Test akutní toxicity - MICROTOX

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif magic
Flash test
•Vibrio fischerii
• - testováni zakalených a barevných vzorků, bez potřeby referenčního materiálu
•
• design:
•  - akutní
•  - inhibice bioluminscence
•  - mikrodestička
•  - luminometr s dispensorem
•  - nutné vzorek protřepat (během měření) •  - krátká doba měření – Hodnota píku Smax (0-2s) v
porovnání s píkem S30s (po 30s měření)

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ATP
Snímek 141
Analýza ATP - integrující ukazatel
fyziologické aktivity
Tento ukazatel je ve velice úzkém vztahu k intenzitě
metabolické obměny (tzv. metabolický „turnover"):
Obměna bílkovin: degradace a resyntéza: nitrobuněčné proteázy
- aktivní v nerostoucích buňkách - obměna 3 - 7% za hodinu
Obměna RNA: není vyvážená, převažuje degradace, degradace rRNA souvisí s úbytkem ribozómů
Obměna peptidoglykanu: vmezeřování podjednotek u rostoucích buněk, v klidových buňkách se zastavuje
Důležité je také to, že v mrtvých buňkách je ATP rychle degradováno ===> může sloužit jako míra
biomasy
Degradační a syntetické pochody jsou vzájemně různě vyvážené podle toho, zda buňka roste, je v
klidovém stavu nebo je stresována vnějším faktorem.
Pro klidovou a nerostoucí buňku je též charakteristický pokles vnitrobuněčné koncentrace ATP, ADP a
AMP (tzv. „energy charge")
image002

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ATP
Snímek 142
Metodika stanovení
Po extrakci princip spočívá v použití luciferázy, enzymu katalyzujícího aktivaci D-luciferinu
adenosintrifosfátem a následující oxidaci na excitovaný oxyluciferin
Excitovaný oxyluciferin při návratu vyzáří světelná kvanta (luminometr, vytvoření kalibrační
přímky)
Velmi citlivá metoda (10-11 M koncentrace ATP)
                                      luciferáza
luciferin + ATP + O2 ==========> oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + světlo (~562 nm)
                        Mg2+

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ATP
•Problémy:
–kvantitativní extrakce ATP (např. z půdy)
–musí být inaktivovány ATPázy a kinázy
–ATP se sorbuje na koloidy
–různé ionty v extraktu inhibují luciferázu
–ATP se vyextrahuje i z rostlinných a živočišných buněk
–možná inhibice luciferázy extrakčním činidlem - nutné ředění (TCA) nebo neutralizace (benzethonium
chloridem, H2SO4)
•
•Existuje řada extrakčních metod s výhodami i nevýhodami
–1) trichloroctovou kyselinou (TCA-phosphate-paraquat system)
–2) tris-EDTA-NaN3(TEA)+NRB (nucleotid releasing agent for bacteria = komerční detergent)
–3) H2SO4 + NaHPO4.H2O
–4) H3PO4 + EDTA + adenosin + DMSO + močovina
Snímek 143

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ATP
Snímek 144

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
ATP
Snímek 145
Adenylate energy charge
EC = (ATP +1/2 ADP) / (ATP + ADP + AMP)
- míra energie skladované v adeninové energetické zásobě buněk
- indikátor metabolického statutu buněk
- rozsah 0 - 1; rostoucí buňka: 0,85; nerostoucí buňka: 0,5
- EC pod 0,4 je téměř irreverzibilní situace u vymírající populace; kolem 0,5 je klidový stav s
neschopností biosyntéz
- existuje hodně studií AEC na in vitro kulturách a méně studií in situ
- AEC pro čerstvou půdu TTP 0,85, po vysušení pokles na 0,45 a po opětovném ovlhčení stouplo na
0,76
- těžké kovy snižují obsah ATP, ADP a AMP na polovinu, ale AEC zůstává stejné s kontrolní lokalitou
===> AEC není ideální indikátor stresu pod vlivem např. kovů, spíše indikátor stresu jako vysychání
apod.

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 146
Adenylate energy charge - metodika
- ultrazvuk rozruší buňky a následuje extrakce
- měření ATP použitím luciferázového systému, poté AMP a ADP konvertovány na ATP a opět měření
luciferin-luciferázovým systémem (alternativou je měření na HPLC)
- výsledek závisí na použitém extrakčním činidle TCA, NaHCO3, H2SO4 ...
ATP

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Snímek 147
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Anaerobní aktivity
Snímek 148
- náročné způsoby manipulace  se vzorky
- používané roztoky musí být bez kyslíku
Lze pak měřit zejména:
• anaerobní amonifikaci
• denitrifikaci (až na N2)
• redukci železitanových iontů
• desulfurikaci
• atd.
70 71 71

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Redukce železa
Snímek 149
[USEMAP]

1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif
Další aktivity mikroorganismů
Snímek 150
0014
Inkorporace methyl[3H]thymidinu
indikátor mikrobiální aktivity
napravo využit pro stanovení "bacterial community tolerance" v půdě kontaminované kadmiem