1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bi6420 Ekotoxikologie mikroorganismů https://is.muni.cz/el/1431/jaro2012/Bi6420/index.qwarp Doc. RNDr. Jakub Hofman, Ph.D. hofman@recetox.muni.cz jaro 2012 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Bi6420: Ekotoxikologie mikroorganismů Část 4: Sledované parametry mikrobiální ekotoxikologie a působení toxických látek na ně 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky 124 Diverzita mikroorganismů v ekotoxikologii 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Společenstva mikroorganismů Snímek 4 Společenstva mikroorganismů = složitý systém vazeb mezi sebou i s okolním prostředím Hlavní mechanismy mezi- a vnitrodruhových procesů: • kooperace (u mikroorganismů nějčastěji substrátová) • kompetice (antibiotika) • symbiózy s rostlinami (jsou často sledovány jako eko(toxiko)logický endpoint) Phy012 vam4 mycorrhizalfungi 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Společenstva mikroorganismů charakteristika bakterie aktinomycety houby populace nejčetnější středně početné nejméně početné biomasa bakterie a aktinomycety mají stejnou biomasu nejvyšší biomasa buněčná stěna murein, teikoové kyseliny, lipopolysacharidy murein, teikoové kyseliny, lipopolysacharidy chitin nebo celulóza kompetitivita pro jednoduché org.slouč. nejkompetivnější nejméně kompetivní středně kompetivní tolerance k vlhkosti nejméně tolerantní středně tolerantní nejvíce tolerantní optimální pH 6-8 6-8 6-8 pH pro kompetici 6-8 >8 <5 půda pro kompetici všechny typy půd dominují v suchých půdách s vysokým pH dominují v půdách s nízkým pH Snímek 5 •Příklad – mikrobiální společenstva půd – dominují tři skupiny mikroorganismů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Selekce a strategie Kritérium r - stratégové K - stratégové Růst společenstva Rychlý, vysoká reprodukce, „growers“ Mírný, konzervativní, „non-growers“ Ekologické zařazení Zymogenní, kolonizace nových prostředí, generalisti Autochtonní, přežívají v diverzifikovaném společenstvu, specialisti Využití substrátu vysoké nároky na živiny, nižší schopnost využití průměrné nároky na živiny, vyšší schopnost využití substrátu Strategie Růst, jinak ne příliš schopní kompetice Pečlivé využití zdrojů a specializace Substrátová diversita jednoduché, lehce dostupné komplexní různorodé substráty Dominantní morfologie malé buňky, rozptýlené mycelium, fenotypově plastické velké buňky, složitá, vyvinutá mycelia, fenotypově monomorfní Způsoby reprodukce jednoduchá, malá výměna genetické informace komplexnější výměna genetického materiálu Populační dynamika prudký nárůst, nezávislé na hustotě, vysoká míra migrace, časté nové kolonie prostorová kompetice, malá migrační tendence Tolerance k přesahu niky vysoká nízká Snímek 6 Hlavní hybatele evoluce: selekce, diverzita, sukcese Strategie a selekce: r a K stratégové Během studia mikrobiálních společenstev bylo prokázáno, že mikroorganismy praktikují buď jednu, či druhou stategii. Lze stanovit např.: - jejich podíly na substrátem indukované respiraci (SIR) - lze inhibovat r stratégy v pokusech s minimálním přídavkem substrátu (např. acetát) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biodiverzita Snímek 7 - je funkcí ekosystému (ekosystém má mnoho/málo nik ===> biodiverzita je velká/malá ) Nerovnováha: ekosystém má mnoho nik a ty nejsou zaplněny (např. ve zničených či stresovaných ekosystémech) Stabilita: stabilní vztahy mezi populacemi, uvnitř populací a mezi organismy a prostředím Stability je většinou dosaženo na konci sukcese (nebo pravdivěji v jejím subfinálním stádiu) Diverzita = rovnoměrnost rozložení jedinců do skupin = informace Větší diverzita = větší "pool" informací (strategií, enzymů, genomů ...) = menší energie nutná na udržení celku = vyšší stability Specifika mikroorganismů: různé druhy a rody mohou zastávat podobné funkce (větší smysl má tedy funkční než taxonomická diverzita) Vysoká diverzita zajišťuje stabilitu ekosystému Pokud je zásah, je tolerance vyšší u diverzifikovaného společenstva Často má inverzní vztah s produktivitou 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biodiverzita mikroorganismů Snímek 8 2 možné scénáře Hodně druhů Málo jedinců Vysoká Málo druhů Hodně jedinců Diverzita Nízká Pozn: uvažujeme zatím pouze druhovou diverzitu 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biodiverzita mikroorganismů Snímek 9 Malá druhová diverzita Úspěšně konkurenceschopné mikroorganismy Vysoké počty buněk Jen několik dominantních populací Vysoká produktivita Vysoká potřeba energie NESTABILNÍ + 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 10 Vysoká druhová bohatost (= je hodně druhů) Méně jedinců Komplexní struktura STABILNÍ SPOLEČENSTVO Menší energetické nároky Biodiverzita mikroorganismů Vysoká druhová diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Malá druhová diverzita – relevance k environmentálním zásahům Snímek 11 Upřednostněn je rychlý růst několika málo druhů Vysoká spotřeba energie Vývoj jednoduchého společenstva Čas Environmentální změna Druhy Biomasa Biodiverzita mikroorganismů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co kontroluje biodiverzitu? 1.Ekosystémy, kde jsou to fyzikálně – chemické faktory prostředí: např. kyselá rašeliniště, horké prameny, pouště, znečištěné půdy ... • •= specializované ekosystémy, kde je jeden faktor určující (tzv. variant) Snímek 12 Malá diverzita prostředí Adaptace Nejvyšší priorita = přežít Nízká druhová diverzita Biodiverzita mikroorganismů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Co kontroluje biodiverzitu? 2.Ekosystémy, kde jsou to biologické faktory • Snímek 13 Tolerantní prostředí Abiotický stres je redukován Společenstva druhově bohatá Vysoká druhová diverzita Biodiverzita mikroorganismů Přirozený stav pro mikrobiální společenstva je vysoká diverzita - je snižována stresem a negativními zásahy, kdy se „vyhraňují“ vlastnosti prostředí (ad 1) è biodiverzita mikroorganismů je ideální mírou biologické kvality systému 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Biodiverzita MO •vyjadřování diverzity •lze použít stejné indexy, jen místo druhů budou např. funkční skupiny mikroorganismů a místo jedinců biomasa ... Snímek 14 107 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 15 Biodiverzita taxonomická strukturální funkční genetická ?? interpretace ?? ?? kvantitativní míry ?? ?? vzájemné vztahy markerů ?? Biodiverzita mikroorganismů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Analýzy lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Analýza lipidů: biomarkery a diverzita Snímek 17 0027 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 18 - lipidy buněčných membrán jsou tak specifické, že mají povahu až biomarkerů ===> SLB - signature lipid biomarkers - každý mikroorganismus má charakteristický "pattern" složení lipidů, který může být užit jako diagnostický parametr Příklad: rod Micrococcus dle větvených nenasycených FA: C27,C28,C29 M. luteus C25,C26,C27 M. varians C30,C31,C32 M. sedentarius Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 19 - lipidy buněčných membrán jsou tak specifické, že mají povahu až biomarkerů ===> SLB - signature lipid biomarkers - jsou velmi diverzifikované: několik skupin a v rámci nich jsou lipidy s mnoha strukturními variacemi: 1) Jednu velkou skupinu tvoří mastné kyseliny vázané v původní makromolekule fosfolipidu esterovou vazbou (EL-PLFA): a) nasycených PLFA (SATFA - saturated fatty acids) b) mono-nenasycených (MUFA - mono-unsaturated fatty acids) c) vícenásobně nenasycených (PUFA - poly-unsaturated fatty acids) d) hydroxy-substituovaných (PLOH) 2) Druhou velkou skupinu tvoří mastné kyseliny vázané v původní makromolekule přes neesterovou vazbu (NEL-PLFA): a) UNSFA - nasycené i nenasycené mastné kyseliny a hydroxy-substituované (UNSOH) Konkrétní sloučeniny mastných kyselin jsou stanovovány stejné v obou frakcích, tedy EL-PLFA i NEL-PLFA. Liší se tedy pouze způsobem navázání v molekule fosfolipidu. UNSFA tedy zahrnují stejné molekuly jako SATFA+MUFA+PUFA, pouze místo karboxylového konce, mají jiné zakončení pocházející z hydrolýzy neesterové vazby. Analogicky totéž platí pro PLOH a UNSOH. Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 20 Analýzy lipidů - názvosloví - základní část vlastního názvosloví tvoří poměr X:Y, kde X je počet uhlíků v řetězci kyseliny a Y značí stupeň nenasycenosti, tedy počet dvojných vazeb v makromolekule - pozice dvojných vazeb je pak číslo v závorce s tím, že pokud je u něj c, respektive t, znamená to cis, respektive trans konfiguraci - písmeno n znamená normální nevětvený řetězec - zkratka br znamená rozvětvenou molekulu o methylovou skupinu - písmena i a a pak znamenají iso a anteiso pozici methylové skupiny - písmeno p či p následováno číslem znamená pozici methylové skupiny od karboxylového konce molekuly - cyklopropylové skupiny na PLFA mají v názvosloví zkratku cy - pozice hydroxy skupiny v řetězci je vyznačena jako a, b od karboxylového konce, či od alifatického konce řetězce symbolem w následovaným číslem, například w-1 - písmeno d znamená dikarboxylové mastné kyseliny Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 21 Analýzy lipidů - analýza - složitá separace a extrakce; esterifikace na FAME - analytická koncovka je GC-MS: na základě MS je identifikována mastná kyselina a na základě retenčního času pak již může být rutinně analyzována - existují knihovny FA pro MS MS spektrum methyl esteru trikosanové kyseliny Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 22 Analýzy lipidů - PLFA jako biomarkery - informují o složení mikrobiálního společenstva: - poskytují ale i další informace: Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 23 Analýzy lipidů - PLFA jako biomarkery 0028 Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 24 0021 Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 25 0022 Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 26 26 0014 [USEMAP] Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 27 Další indikátorové látky - biomarkery ergosterol - houby (HPLC) muramová a diaminopimelová kyselina - prokaryota (HPLC) lipopolysacharidový lipid A mastné kyseliny a kyselina teichoová - G- a G+ (GC/MS) hydroxy FA, plasmalogeny a sfingolipidy - anaerobní populace bakterií Analýza lipidů: biomarkery a diverzita 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Funkční diverzita - systém BIOLOG 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 29 - systém BIOLOG využívá jednoduchých uhlíkatých substrátů, které se většinou vyskytují přirozeně v půdním prostředí; tyto jsou v 96-jamkových mikrodestičkách spolu s barvivem a na základě schopnosti, či neschopnosti mikroorganismů využívat jednotlivé substráty vzniká specifický "fingerprint", který buď identifikuje mikroorganismus (identifikační přístup), nebo fyziologický potenciál společenstva (funkční diverzita - ekologický přístup) - v prvním případě je použita monokultura, která je po izolaci identifikována pomocí mikrodestiček s 96 uhlíkatými substráty (barvivo je TTC ---> TPF; λ=590 nm) - GN2 MicroplateTM a GP2 MicroplateTM - rutinní využití k identifikacím mikroorganimů v celé řadě oborů - druhý způsob využití, méně častý a poměrně nový, je přístup hodnocení diverzity mikroorganismů technikou fyziologické profilace na úrovni společenstva (CLPP - community level physiological profiles); pro tento účel byly vyvinuty BIOLOG EcoPlatesTM - mikrodestičky, které obsahují 3 krát 31 vybraných uhlíkatých substrátů a jejichž schopnost profilovat metabolický "fingerprint" společenstva je využitelnější zejména pro statistické hodnocení (méně "proměnných") 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 30 - systémem BIOLOG je možné rychle a laboratorně nenáročně získat širokosubstrátový "fingerprint" izolovaných kultur, který umožňuje s pomocí v současné době nejrozsáhlejších databází (zahrnují vice než 1900 mikroorganismů) jejich identifikaci - identifikaci obstarává několik typů software od firmy BIOLOG, které na základě metabolického "otisku" bakterie identifikují o který druh se jedná - systémy se liší cenou a vybavením - nejjednodušší verzí je MicroLog 1TM, který obsahuje pouze prohledávač databází "fingerprintů", které se objednávají zvlášť dle potřeby (GP, GN bakterie, kvasinky apod.) Srovnání: databáze BIOLOG pro gram negativní bakterie obsahuje 501 aerobních druhů × • Bio Mérieux API 20E® & NFT obsahuje asi 180 aerobních druhů • Bio Mérieux API 20E® GNI+ obsahuje 104 aerobních druhů databáze BIOLOG pro gram pozitivní bakterie obsahuje 318 aerobních druhů × • Bio Mérieux Vitek® GPI obsahuje 49 aerobních druhů • Bio Mérieux API® Staph, 20 Strep, & coryne asi 106 aerobních druhů Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 31 Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 32 120 Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 33 Funkční diverzita mikrobiálních společenstev BIOLOG mikrodestička EcoPlateTM byla vyvinuta speciálně pro účel studia funkční diverzity mikroorganismů a ekologie mikroorganismů Zaznamenává "fingerprint" metabolického potenciálu společenstva, založený na principu utilizace vybraných zdrojů uhlíku metabolický potenciál společenstva = funkční diverzita = blízký vztah k ekologické významům Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 34 Funkční diverzita mikrobiálních společenstev Studie byly publikovány ve všech oblastech enviromentalistiky, asi nejvíce je ovšem studium mikrobiální biodiverzity rozvinuto u půdních mikrobiálních společenstev BIOLOG systém byl úspěšně využit pro posouzení vlivu zemědělského managementu, degradace chemikálií, vlivu pH, vlivu zaplavování půdy pro půdní mikrobiální společenstva Funkční diverzita – systém Biolog Image Preston-Mafham et al., 2002. FEMS Microb Ecol 42,1. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 35 121 Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 36 0026 0026 Funkční diverzita – systém Biolog BiologWellsSmall 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 37 Soil sampling Sieving ? Freezing ? How long to store ? Laboratory test EXTRACTION: Optimal dilution: 105 - 108 cells ? 1 µg Cbio-SIR ? 10-2 - 10-4 ? What to use: NaCl, Ringers, buffer ? Centrifugation ? To use sediment or supernatant ? Inoculation Cultivation: when to read ? 15 - 28 °C ? Parameters ? Statistical analysis ? image_hand Abs = Abswell - Abst=0 167 RECOMMENDATION: The difficulties begin in the method procedure. Soil from the laboratory test can be analyzed immediately after the test (14 or 28 days), but soil sample from the field needs to be manipulate. Some references show that time from sample collection to inoculation of BIOLOG plates should be kept to a minimum, preferably within the same day. Soil storage, even in cold store or frozen, is not recommended, microbial populations can be dramatically affected. However, it cannot be fulfilled because one needs to measure soil dry weight, moisture and other things before the method. The most critical step of the method is extraction and inoculum preparation. No approach simply does not achieve a representative sample. There are differences in extraction medium, dilution ratios, separation of the soil particles from supernatant etc. Above all, it is not clear what density should be used for inoculum - this will be discussed further. Also conditions for the incubations are not uniform. And finally there is question how the absorbance data should be read, computed, analyzed and interpreted. I can recommend to relate all absorbances to reading in time zero rather than subtracting the control wells - you will achieve smaller variance in the data. Another issue is about BIOLOG method repeatability and reproducibility. What is replicate in the method? In my opinion several soil sub-samples should be analyzed as replicates with the whole procedure. Finally, also replication of the BIOLOG alone should be run as repeated inoculation of the same inoculum to more plates. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 38 Parameters considering 31 solely substrates - multivariate results: •Raw absorbances - A •Normalized absorbances (divided AWCD) - AN •Trapezoid areas (TA) •POS/NEG of substrates •Kinetic parameters - LAG, µ, K Parameters calculated from 31 substrates - univariate results: •AWCD - Average well color development •ATA - Average TA •Richness - number of POS substrates •Diversity - Shannon-Weaver index BIOLOG DATA = raw absorbances for N × 31 substrates repeatedly measured in time H = -S pi (ln pi) The overlook of possible BIOLOG parameters is presented here. The original datasets is for each sample, variants or soil N times repeated matrix of 31 substrates absorbances repeatedly read in time of incubation, usually after 12 or 24 hours for 4 or more days. They can be normalized by dividing by AWCD or areas under the curve can be computed by trapezoid rule. We also can check only positive or negative substrates with setting some level, e.g. 0,25 absorbance units for this. When 31 substrates are combined into single measure of AWCD we usually lose information about diversity. Richness show how many substrates were positive, omitting how evenly are they used. Finally, diversity indices, like Shannon-Weaver reveal information about richness and also evenness of the substrate usage. AWCD, Richness, Shannon-Weaver index parameters develop in time of incubation and appropriate reading time for comparison must be chosen. Also, comparison in fixed AWCD value or Richness can be done. As for statistical analysis, ANOVA can be used followed by multiple range tests, e.g. Newman-Keuls. It is suitable for univariate parameters. For multivariate parameters we can either make ANOVA for each substrate of enter multivariate statistics, especially cluster analysis or some kind of factor analysis. I hope that now everybody understand, that BIOLOG is not so easy approach. Few years ago we begun to measure with this method and up today we cannot say that it provide sensitive responses to soil contamination which could replace other methods. I would like demonstrate this on several case studies. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 39 Systém BIOLOG - hodnocení AWCD (average well color development) 122 Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 40 Systém BIOLOG - hodnocení Při vyhodnocení se často vytváří tzv. CLPP - community level physiological profile: - každá jamka mikrodestičky představuje potencionální mikrobiální funkci s výstupem ano/ne (reagovalo/nereagovalo) - tento výstup však nemá pravděpodobnostní charakter a pro jakékoliv statistické metody představuje problém - proto se při několikaterém zopakování vytváří hodnota ekologické abundance (pro každou jamku) - tedy např. pozitivní reakce 9 krát z 10 = 90% - vznikají pseudo spojitá čísla, se kterými se pak vstupuje do vícerozměrných analýz new-1 Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 41 Inoculum density Actual in situ activities Potential functions K/r strategists Represents all community members Synergistic or antagonistics effects Organic matter Measures of overall activity Measures of potential diversity It was discussed many times, that inoculum density affects essentially all BIOLOG results and also basically what is method about at all. Color development is affected by inoculum density - i.e. number of cells or inoculum catabolic activity. The reason for the high sample dilution is to dilute organic material from the soil, to be negligible as substrate in the wells. However, when the inoculum is diluted too much, there could be also critical losses of some community members, changes in proportion of K/r strategists in the wells and probability of interspecies relationships. On the other hand, when the inoculum low diluted, there can be strong effect of actual in situ activity, and physiological state of the microbes. Then we truly measure no functional diversity but actual catabolic activities. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 42 dark_brown_pr dark_brown_pr A B C Soil X Soil Y Overall activity Overall biomass Effective analysis of the multivariate profiles of carbon source utilization patterns strongly requires separation of the effects caused by differences in the inoculum density (i.e. average rate of color development) from the effects caused by differences in the types or activities of organisms present (i.e. relative color pattern, or carbon source utilization diversity). For illustration now few examples, because the situation is not simple. Imagine samples A and B that show communities which reveal same functional diversity, but different overall community size and also corresponding lower overall activity. If we want to use BIOLOG for measuring the functional diversity, method should be adjusted to reveal that these communities have the same diversity and the effects of different biomass or activity should be disregarded. Unfortunately, due to inoculum density effect this is not true, and BIOLOG results will ever include also artifacts of that differences. Imagine now sample C that has same biomass and activity as sample A, but different proportions of functional groups. I hope, this is ideal example, when BIOLOG could show results which can be well interpreted as diversity differences. However, real situation is rather as show Soil X and Y. Here is different diversity of the functional groups, plus different overall biomass, and moreover plus different physiological activity not always corresponding to biomass size. On this real situation example arise the most important questions of the BIOLOG method: Should we standardize the inoculum or not? If so, should it be standardized according to cell numbers or biomass or according to physiological activity? The answers can be given by the knowledge, what happen in the well after inoculation. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 43 growing (r) non-growing (K) Monod TPF time 3) enzyme concentration changes 4) different q and Y TPF time 1) K / r proportion ? 2) growth/maintenance Can be distinguished ? Timing of action ? Michaelis - Menten 5) different enzyme affinity 6) stress inhibition (activation) 63 Stenstrom et al., 1998. Ambio 27, 35. Unfortunately, there is no single theory what exactly happens when the microorganisms is inoculated into the wells. The only clear is, that more respiration activity in the well produces more color. However, what stands behind reducing power increase? Because we see only TPF as reduction product we don't know if the increase of the color means higher respiration of the same amount of cells or increase of the cell numbers with constant specific respiration activity. The contemporary papers conclude that both growth and activity comprises to color formation but growth is probably the main action overlaying any other processes in the wells. Growth should reflect classical growth curve according Monod equations. This ideal model is however biased by several complications: 1) Beside growing strategists, there are also microbes in the well that do not grow and only mineralize present substrate. Their occurrence and proportion will be affected by inoculum density as was noted already. Color is produced according enzyme kinetics which shows similar curve to growth curve and thus, hardly can be distinguished. 2) Carbon source is utilized both for growth and both for respiration, i.e. for maintenance, at the ratio which unknown and depends on many conditions e.g. on stress. 3) cells in different growth curve phases produce different amount of enzymes. 4) Moreover, different substrates can reveal different specific activity and growth yield. 5) Enzymes present can show different affinity to substrates 6) Finally, all factors like stress have impact on enzyme activity and also growth capabilities and will affect the final curve shape. The question is, if we are able and also if this is necessary to distinguish all these processes to make any solid interpretation of BIOLOG. This is point of further discussion. The inspiration can come from substrate induced respiration approach theoretically explained by Stenstrom et al. in 1998. Maybe it would be possible to use BIOLOG by two ways: 1) with dense inoculum as quick - several hourly assay of real actual functions or 2) with highly diluted inoculum as long time incubation assay for community physiological potential evaluation. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 44 HOW TO SOLVE THIS PROBLEM ? 1.Methodical standardization = inoculum of the same density (activity ?) 2. 2.Normalization of the data - dividing by AWCD 3. 3.Reading the data when AWCD reach e.g. 0,5 or 50% of the wells are positive 4. 4.Use of kinetic parameters like µ, lag or K It is evident, that there is no single solution of the inoculum density problem. One possibility is to standardize inoculum density according to cell numbers, biomass or according to activity. Both approaches have arguments, because Garland, Haack, and many others proved that color development is affected both inoculum density and also activity. Second possibility is omit inoculum standardization, dilute all samples the same way and to normalize measured data: dividing by AWCD or reading in fixed AWCD or richness value. Normalization by AWCD is basically very similar as data standardization prior to statistical analyses like PCA. It should avoid quantitative differences and show only qualitative differences between samples. Reading in fixed AWCD or richness cannot be recommended, because the exact value (e.g. 0,5 or 0,75) is usually not picked up, because color is not read continuously bur after e.g. 12 hours. In such cases this approach bring another source of variation in the data. The modern approach in several papers is calculation of kinetic parameters from Gompertz equation, which seems to be independent from inoculum density/activity effects. To conclude the problem with inoculum density: It is not appropriate to blindly transform the data to suppress the influence of inoculum density, without first recognizing whether density effects might be an important aspect of differences between the microbial communities under consideration. For example, differences in inoculum density might be a major distinguishing feture between communities which otherwise show no significant differences in the carbon which can be used. However, in such case we do not use BIOLOG for evaluation of the functional diversity. If we want to examine only functional diversity, i.e. potential function as opposed to actual function, it is important to take into account inoculum density. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 45 [USEMAP] WIND For the purpose of field case study, we used twelve sites in small natural area around cement works Mokrá. Consortium RECETOX-TOCOEN has monitored here soil contamination and microbiological properties since 1998. There are different soil types and vegetation covers (arable, grassland and forest) present and soils differ in organic matter content, pH and other properties. Some of these soils are contaminated with POPs: soil 11 is very heavy contaminated by DDT, which is not from plant, of course; it shows also increased level of PAHs; soil 6 is contaminated with dioxins and also has increased level of PAHs and cadmium. Our objective was to evaluate if the use of another biological assay - BIOLOG, is suitable for routine monitoring of these soils. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 46 Experimental design 1.Methodical standardization = 1 µg Cbio-SIR per well 2. 2.cca 10-2 in 0,85% NaCl agitated and centrifuged at 3000 g 3. 3.150 µl inoculated to EcoPlates; 27°C; readed for 5 days cca every 12 hours (590 nm) 4. 4.Raw absorbances back corrected against time = 0 5. 5.AWCD, AN, TA, ATA, S-W index computed 6. 6.Statistical analysis 7. 7.Comparison with soil characteristics [USEMAP] We used procedure as viewed here. Please notice low dilution ratio used, because we would like to see also actual physiological differences between localities rather than potential functions. Therefore, relatively low dilution was used. We standardized according overall microbial activity rather than inoculum density hoping that it would preferably omit inoculum density effect. Rest of the procedure was according usually described steps in the literature. We tried to use all possible analyses and parameters with the exception of kinetic parameters to compare them and show how the BIOLOG data should be evaluated in routine biomonitroing in such studies. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 47 [USEMAP] Here are presented results of overall measures of catabolic activity - ATA and AWCD in main reading points. Two plots bellow display parameters of richness and evenness. There are apparent three main conclusions: 1) we used only 3 replicates per soil and that is not enough, because high variability masked significance of differences between soils. More replicates allow to exclude extremes from the analysis. 2) Even inoculum was standardized, there are still differences in overall activities masking any differences in the diversity. The highest overall catabolic activity was in soil 7 and 8 and the lowest in soils 5, 9 and 10. 3) When ATA, AWCD and also richness show similar results. Thus, it seems that overall measures like ATA and AWCD reflect more positive substrates with more color. Evenness show a bit different results, even it seems that it is partially affected by results of ATA and richness. Especially soils 1 and 6 display completely other position than was according to AWCD. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 48 [USEMAP] ATA AWCD 48 S-W TA Rich 48 ATA AWCD 48 0,96 S-W TA -0,03 0,02 Rich 48 0,55 0,61 0,71 Cbio 0,87 0,83 -0,25 0,39 BR 0,39 0,28 -0,44 -0,19 PR 0,90 0,88 -0,02 0,62 pH(KCl) -0,47 -0,47 0,10 -0,25 Corg 0,95 0,89 -0,22 0,43 CEC 0,28 0,25 -0,30 -0,07 Clay -0,08 -0,07 0,08 0,05 Cd 0,99 0,95 -0,05 0,51 Pb 0,93 0,90 -0,21 0,39 Zn 0,35 0,38 -0,01 0,12 PAHs 0,59 0,41 -0,07 0,15 PCBs 0,90 0,82 -0,13 0,41 DDT -0,54 -0,58 -0,02 -0,49 PCDDs/Fs 0,09 -0,14 -0,60 -0,46 Spearman rank correlations (soil 8 and 10 excluded) Corg is driving factor responsible for overall color development Relationship with pollutants in soil is probably mediated by Corg Independency of richness and evenness = show new information (what ?) The relationships can be illustrated with Spearman rank correlation which also can reveal which from known soil properties corresponds with these results. As is shown with red numbers, ATA and AWCD are related. Richness adds some new information and determines partially evenness, which display information completely independent on ATA or AWCD. It is apparent that especially organic matter content in soil is driving factor responsible for results of overall color development. It is also correlated with potential respiration, even inoculum was standardized according to SIR. The relationships with pollutants in soil is probably mediated through organic matter content in soil, which support higher pollutant retention but also higher microbial status. Independency of richness and evenness on any soil property is promising that these parameters can show new information about soils that was unseen previously. However, what they can indicate remains unknown. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 49 Pearson parametric correlation Abs 72 0,87 AN 48 0,93 0,83 AN 72 0,81 0,95 0,87 TA 0,92 0,99 0,87 0,93 TAN 0,85 0,94 0,91 0,99 0,95 Abs 0,5 0,96 0,82 0,96 0,82 0,87 0,87 Abs 1 0,85 0,94 0,86 0,96 0,94 0,97 0,84 Abs 16 0,91 0,78 0,92 0,77 0,83 0,83 0,93 0,78 Abs 24 0,90 0,97 0,88 0,95 0,97 0,95 0,86 0,97 0,82 Abs 48 Abs 72 AN 48 AN 72 TA TAN Abs 0,5 Abs 1 Abs 16 several parameters show very similar information - effect of inoculum standardization ? time of reading is most important factor giving different results every parameter can be used in MV statistics and very distinct results are then obtained [USEMAP] Next step of the analysis is multivariate approach when we respect 31 substrates as variables and try to find any pattern similarities or dissimilarities. Firstly, let's see that several parameters show very similar information: it is apparent that all parameters are highly correlated which is possibly effect of inoculum standardization. However, detailed view shows, that time of reading is most important factor giving different results of the method. The 48th hour is too early for development of some wells and therefore parameters from this hour show different results than later readings or TA. Also reading in fixed AWCD or richness level basically corresponds with classical reading. For multivariate statistics, every parameter can be used and very distinct results are then obtained. The use of TA or Abs can be recommended when effects of different actual activities are under consideration. TAN or AN should be used when only qualitative differences, that is functional profiles, are to be compared. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 50 TA in principle component analysis •it seems that the main component binds main part of variance, caused especially overall activity differences •other components shows differences based on other patterns (diversity ?) •nearly half of the substrates on EcoPlates are redundant - to exclude them ? [USEMAP] Principle component analysis for TA revealed that especially 7. 8, 5, 9, 10, and 1 and 6 are different. This information is nothing more behind univariate statistics with ATA, AWCD, richness and diversity. However, it seems that the main component binds main part of variance, caused especially overall activity differences and other components remain to show differences based on other patterns, e.g. diversity. Moreover, I realized in all parameters, that nearly half of the substrates on EcoPlates are redundant. It is tempting to omit the group of the commonly used substrates from the further evaluation in order to increase the sensitivity of the assay to the differences between used soils. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 51 TAN for selected substrates (ANOVA p < 0.01) in PCA biplot of substrate loadings and soil scores (divided by 4) Funkční diverzita – systém Biolog [USEMAP] When we would like to see only differences of patterns normalized TAN is used. Moreover, only those substrates are included in analysis which revealed ANOVA with p < 0.01. Then PCA reveals differences between soils and also which substrates are responsible for them. However, only half of the total information is viewed on these pictures and it can be concluded, that with exception of soils 1, 6, 10 and 5 soils show similar patterns of these 11 substrate utilization. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Snímek 52 Conclusions 1. 1.Inoculum standardization helped to solve inoculum density effect but not totally 2. 2.ATA, AWCD described overall activity and S-W index and richness revealed another information 3. 3.Organic matter was driving factor for the results 4. 4.Use of BIOLOG in routine monitoring could be suitable only if the results would be properly evaluated 5. 5.Evaluating at least one not-normalized (e.g. TA) and one normalized parameter (e.g. TAN) is recommended keeping in mind that they reveal different information [USEMAP] Inoculum standardization helped to solve inoculum density effect but not totally ATA, AWCD described overall activity and S-W index and richness revealed another information Organic matter was driving factor for the results Use of BIOLOG in routine monitoring could be suitable only if the results would be properly evaluated Evaluating at least one not-normalized (e.g. TA) and one normalized parameter (e.g. TAN) is recommended keeping in mind that they reveal different information 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog Lokalita_04_05b Snímek 53 Experimental design of laboratory tests 1. Real uncontaminated agricultural soil (cambisol) with indigenous microflora: pHKCl = 7 – 7.5 Cbio = 400 – 700 µg.gd.w.-1 Corg = 1.5% BR = 0.5 – 0.7 µg CO2-C.h-1.gd.w.-1 sand = 70% • Test of effects on soil microflora according ISO, OECD, SETAC, BBA etc. guidelines: § incubation of the soil samples (10g per replicate) in aerobic conditions; 60% WHC; 22°C § tested substance is added dissolved in water or volatile solvent to get dose range in soil samples § controls are water and used solvents § after 14 and 28 days BIOLOG is measured [USEMAP] As the second utilization of the BIOLOG approach in soil ecotoxicology we tried to employ it as endpoint in laboratory toxicity tests. The design of these tests is derived from OECD, ISO and other guidelines. Simply, it is laboratory incubation of artificially contaminated soil, which originated from real locality of prescribed properties and contains indigenous microflora. Compounds unsoluble in water are dissolved in volatile organic solvent that is evaporated before the test. During the exposure time we measure the changes in BIOLOG results. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog [USEMAP] Snímek 54 1. toxicity of cadmium in concentration 0.01 – 10 000 mg.kg-1 was tested As for validation of toxicity test we used cadmium, which is known to be toxic for microorganisms. BIOLOG displayed satisfactory answer in parameters of overall catabolic activity: both ATA and AWCD were inhibited by cadmium from doses of 1 ppm, which is by the way acceptable environment concentration. EC50 values can be expected about 300 – 500 ppm. This is very similar to toxicity of cadmium in soil respiration test and more sensitive than is sensitivity of biomass to cadmium, where is EC50 about 2000 – 3000 ppm. With increasing cadmium concentration there was decrease of substrate richness in early hours of color development indicating increased lag in color development caused by cadmium. Shannon index is comparable with exception the highest concentration, which could be interpreted that cadmium causes decrease of color development in general without any apparent changes of evennes. Community step by step loses capability to utilize most of the substrates. This is first sign of the inoculum density/activity effect. This was also agreed by results for normalized parameters, which revealed no differences between concentrations. In conclusion, cadmium as known enzyme poison probably reduced overall community catabolic activity and this was reflected by BIOLOG. There arises question, if the BIOLOG method would be able in some tests for some compound detect separately effect on activity and functional fingerprint. 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 55 BIOLOG mikrodestička představuje ideální zminimalizovaný systém, kde můžeme paralelně sledovat průběh 31 až 95 biochemických reakcí: • jednoduchý kolorimetrický výstup • možnost vynesení křivek dávka odpověď 128 Kontaminace zinkem narůstá Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 56 56 Systém BIOLOG - využití pro hodnocení PICT (Pollution induced community tolerance) - je založeno na přirozené schopnosti mikroorganismů tolerovat do určité míry kontaminanty v prostředí - při působení kontaminantu na mikroorganismy se projevuje jejich mechanická, genetická a fyziologická adaptace na nové podmínky a dochází k odumření citlivějších společenstev 126 [USEMAP] Vlastnímu měření musí předcházet chemická analýza, která má za úkol zjistit, v jaké koncentraci a o jaký kontaminant se jedná. Poté se udělá extrakt z půdy a mikroorganismy se očkují do několika mikrodestiček s rostoucí koncentrací kontaminantu v jednotlivých destičkách. Hodnotí se vývoj barvy. Hodnota EC50 se odvozuje z typické reakce 85 – 90 různých pozitivních mikrobiálních reakcí v mikrodestičce, tedy koncentrace kontaminantu versus aktivita mikroorganismů. Hodnotí se posun křivek v jednotlivých ředěních a jejich rozložení. PICT tedy ukazuje míru toxického poškození společenstva v ekosystému. Před vlastním měřením musí být tedy prokázán toxický efekt kontaminantu na strukturu a funkci ekosystému. Funkční diverzita – systém Biolog 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 57 57 127 Funkční diverzita – systém Biolog [USEMAP] 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Funkční diverzita – systém Biolog •nejnovějším produktem jsou tzv. Phenotype MicroarraysTM Snímek 58 PMTechDisc chart_pmTecDes1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Molekulárně biologické techniky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Molekulárně biologické techniky Snímek 60 Díky rozvoji genetiky a molekulární biologie obrovský boom v minulých 20 letech Díky těmto metodám se zjistilo, jak obrovská je diverzita mikroorganismů v prostředí, např. v půdě – v gramu půdy je 1010 buněk a až 106 druhů !!! Primárně používány pro: -identifikaci předdefinovaných mikroorganismů, ale sekundárně využitelné i při: -hodnocení biodiverzity -jako biomarkery skupin mikroorganismů zastávajících určitou funkci -jako indikace existence nějaké metabolické funkce či dráhy Největší výhoda = odpadá nutnost kultivací a izolací mikroorganismů: -získáváme nezkreslenou, nelimitovanou představu o celé diverzitě – tzv. (meta)genomu celého společenstva -nejen aktuálně realizované funkce, ale i potenciální (uložené v genech, ale nyní „spící“) – dnešní techniky je dokáží rozlišit (sledování exprese, sledování mRNA …) -dnešní techniky dokáží sledovat s minimální mírou zkreslení „míru“ aktivit mikroorganismů bez nutnosti kultivace MO či env. vzorků v laboratoři 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •základem většiny genetických technik je klonování fragmentu DNA (není nutná kultivace), RNA se používá méně často (její extrakce a stabilita je horší) •na druhou stranu pro studium diverzity a taxonomického zařazení mikroorganismů (bakterií) je v současné době nejoblíbenější 16S rRNA respektive ji kódující úsek DNA - 16S rDNA •Sekvence 16S (18S) rRNA jsou považovány za ukazatele diverzity MO • •Důvody pro 16S (18S) rRNA: •univerzálně rozšířená •obsahuje vysoce konzervativní úseky potřebné k taxonomickému zařazení = je typická pro každý druh •obsahuje naopak i variabilní úseky k fylogenetickému srovnávání •přirozeně existuje v mnoha kopiích •dobře prozkoumána a databázována • •Nevypovídá ale o metabolických aktivitách daného kmene … • Snímek 61 Molekulárně biologické techniky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Molekulárně biologické techniky Snímek 62 Hodnocení genetické diverzity je založeno na hodnocení heterogenity DNA společenstva Obecné schéma: •extrakce DNA či RNA společenstva ze vzorku •purifikace NA •pokud se jedná o RNA, tak zpětné vytvoření DNA (je stabilnější) reverzní trankripcí (RT) •namnožení NA (amplifikace) pro zisk dostatečného množství (celého genomu, či jen vybrané části) •případně: separace na elektroforéze •dále následují jednotlivé techniky s cílem: a)detekce specifických organismů/funkcí (pomocí genových prób apod.) b)kvantifikace určitých skupin MO, či funkcí c)informace o diverzitě celého genomu či diverzitě určité skupiny d)sekvenace 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Molekulárně biologické techniky •Vztah s taxonomickou diverzitou, fylogenetikou •Využívá se izolace DNA ze vzorku, amplifikaci úseku kódujícího 16S rRNA (u prokaryot) či 18S RNA (u eukaryot) pomocí PCR, sekvenaci tohoto úseku a srovnání s databázemi, kladogramy • Snímek 63 http://itol.embl.de/ 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 64 108 Molekulárně biologické techniky – obecné schéma 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 65 35 Extrakce NA ze vzorků a)extrakce, promývání a frakcionace buněk gradientovou centrifugací, následuje homogenizace buněk, lýze a extrakce NA b) b)lýze buněk in situ, extrakce, separace NA od Corg (chromatografie, elektroforéza, srážení, extrakce, centrifugace) Pozn. u RNA, která je mnohem méně stabilní je potřeba cíleně inaktivovat všudypřítomné RNAzy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Extrakce NA ze vzorku •Metody lýze: •chemická: např. SDS (sodium-dodecyl-sulfate) •enzymatická: např. lysozym •fyzikální: např. zahřátí, rozbití buněk •kombinace: viz příklad Snímek 66 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 67 35 Extrakce NA ze vzorků = nižší výtěžek ruší jíly, huminové látky, těžké kovy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Re-annealing Snímek 68 Rychlost annealingu – odhad diverzity DNA: •extrakce DNA •čištění DNA •denaturace •měření času opětovného spojení řetězců (annealing) C0.t1/2 .... iniciální koncentrace nukleotidů v jednořetězcové DNA × čas, který je potřeba na reannealing poloviny Rychlost je spojena s podobností fragmentů: rychlý reannealing ==> malá diverzita Např. v půdě C0.t1/2 = 4600 odpovídá 4000 různých genomů (cca 200× vyšší diverzita než byla naměřena u stejné půdy izolačními technikami) 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Re-annealing Snímek 69 Rychlost annealingu – odhad diverzity DNA: [USEMAP] 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 70 PCR Amplifikace DNA PCR - polymerase chain reaction •dojde k amplifikování určitého fragmentu NA (nebo celé NA) •minimální nutné vybavení - termocycler •užití pro detekci specifických mikrobiálních skupin či při tvorbě „community fingerprintu“ • Princip: •2 primery •DNA polymeráza •směs nukleosidfosfátů •cykly inkubačních podmínek v termocycleru (disociace, annealing, extenze) •detekce na gelové elektroforéze po barvení ethidium bromidem 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 71 116 PCR01 PCR02 PCR Amplifikace DNA gel01 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Separace NA •Gelová elektroforéza (ELFO) •agarózová či polyakrylamidová, gradient teploty (TGGE) či chemický (DGGE) •na základě velikosti fragmentů (kilobáze) dojde k separaci (malé jsou nejrychlejší) – proužek (band) má stejnou velikost, ale různou sekvenci •porovnání proužků s markery o známé hmotnosti •určitý úsek lze eluovat a podrobit dalším postupům, např sekvenaci Snímek 72 fig5_33 multisubchoice400 f_s02gelelect agarose-gel-electrophoresis 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 73 117 Molekulárně biologické techniky RT-PCR reverse transcriptase - polymerase chain reaction) •zahrnuje enzym reverzní transkriptázu •vytvoří DNA kopii z RNA (complementary DNA - cDNA) •využitelná i při analýze mRNA, která dovoluje odhadnout míru metabolické aktivity – analýza exprese, tj. realizované genetické informace •použitím malých primerů dojde k reverzní traskripci RNA a poté je použita PCR • 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 74 110 próby DNA – identifikují druh bakterie v extraktu či u izolovaného druhu slouží k detekci specifické NA sekvence a ke kvantifikaci jejího množství DNA je po extrakci, izolaci a purifikaci a denaturaci fixována na membráně a hybridizována s DNA próbami próby jsou značeny radioaktivně (32P), digoxigeninem (DIG), biotinem či fluoresceinem apod. Genové próby 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •detekce přímá pomocí autoradiografie (fotografický obraz) nebo nepřímá navázáním protilátky či konjugátu a následné detekce fluorescence, chemiluminiscence či kolorimetricky Snímek 75 113 Genové próby 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 76 Colony hybridization aplikace pro celé kultury na agarových plotnách Princip: filtrační papír je otisknut na Petriho misce, takže dojde k adhezi buněk z kolonií následuje lýze buněk označení radioaktivními próbami a detekce 114 Genové próby 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 77 Southern blotting identifikuje DNA northern blotting identifikuje RNA Princip: NA jsou separovány gelovou elektroforézou po separaci jsou přemístěny (= blotting) na membránu hybridizace s próbami 114 Genové próby Professor Sir Edwin Southern 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 78 Southern Genové próby Southern blotting 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 79 Dot blotting technika hodnotící přítomnost dané sekvence NA bez přecházející separace na gelu Princip: identická množství NA jsou přeneseny na nitrocelulózový filtrační papír a následně próbovány 115 Genové próby 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 80 In situ hybridization - užívá próby, které přímo hybridizují s cílem uvnitř buněk, nejčastěji hybridizace na 16S rRNA, což je výhoda neboť rRNA je v buňkách mnoho (104) -> silný signál - síla signálu je úměrná počtu ribozómů a tím pádem idikuje růstovou rychlost mikroorganismů -signál detekován epifluorescenčním mikroskopem - FISH (fluorescent in situ hybridization) – fluorescenční in situ hybridizace - FISH-MAR(FISH-microautoradiography)–FISH-mikroautoradiografie - 120 Genové próby 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 81 Molekulárně biologické techniky nrmicro1888-f1 FISH 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Genetická diverzita MO Snímek 82 Nejčastější metody pro zisk „genetického fingerprintu společenstva“ ARDRA - amplifikovaná ribosomální DNA restrikční analýza RFLP - restrikční analýza mnohotvárnosti délky fragmentů T-RFLP - koncová restrikční analýza mnohotvárnosti délky fragmentů DGGE - denaturující gradientová gelová elektroforéza TGGE - teplotní gradientová gelová elektroforéza ARISA – automated ribosomal intergenic spacer analysis - různorodost délek mezi geny malé a velké ribozomální podjednotky Microarrays - mikročipy SIP (stable isotope probing) – značení stabilními izotopy 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif •extrakce, izolace a purifikace DNA •PCR amplifikace •fragmentace pomocí nespecifických restrikčních enzymů •rozdělení fragmentů pomocí ELFO Snímek 83 ARDRA nrmicro1789-i1 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 84 [USEMAP] 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 85 GENETIC FIGERPRINTING - AP-PCR (arbitrarily primed PCR) Princip: nespecifické primery (10 - 20 base pairs - bp) nespecifická amplifikaci genomu separace na gelové elektroforéze barvení a zisk fingerptintu 166 Molekulárně biologické techniky 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 86 - fragmentace pomocí restrikčních enzymů - srovnává délku fragmentů pro různé druhy; vychází s předpokladu, čím vzdálenější jsou fylogeneticky organismy, tím více se liší jejich sekvence DNA -lze výborně použít pro studium společenstva (studium genové heterogenity) Princip: fragmentace DNA na malé oligonukleotidy (4-6 bp); separace fragmentů na ELFO; hybridizace s próbami; barvení ethidium bromidem T-RFLP – využívá jen koncových úseků a značených primerů RFLP rflp 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 87 DGGE - denaturating gradient gel electrophoresis TGGE - temperature gradient gel electrophoresis Princip: • aplikace nespecifických primerů z oblasti 16S rDNA v PCR dá vznik amplifikované 16S rDNA • vznikají fragmenty téměř stejné délky (cca 500 bp) ale jiného složení • separace na gelové elektroforéze je pak založena na různé migraci v závislosti na lineárně se zvyšujícím gradientu DNA denaturantů (močovina/formaldehyd či teplota) • čím více je restrikčních proužků, tím vyšší je diverzita - vzniká charakteristický fingerprint Molekulárně biologické techniky pic012 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 88 124 • Autoři srovnávali tři půdy různě kontaminované rtutí: A - 7 µg/g, B - 28 µg/g, C - 511 µg/g. • • Počet DGGE proužků se významně lišil mezi půdami, nejvyšší byl v půdě A a nejnižší v půdě C. • • Vysoká koncentrace rtuti významně ovlivnila složení mikrobiálního společenstva. Molekulárně biologické techniky [USEMAP] 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Značení stabilními izotopy (SIP) •Dlouho se vědci snažili najít způsob jak sledovat aktivity mikroorganismů bez nutnosti jejich kultivace v laboratoři •Molekulárně – biologické techniky, zdá se, mají řešení jak popsat aktivity mikroorganismů tak, jak probíhají přímo v prostředí •Klasické hodnocení sekvencí (např. 16S, 18S rRNA) nedává odpověď na metabolickou aktivitu MO •SIP umožňuje detekovat MO aktivně se účastnící metabolického pochodu •SIP identifikuje MO, které jsou schopny využívat daný substrát (polutant …) a následně geny, které jsou do využití zapojeny •Využívá se 13C či 15N • • • • Snímek 89 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif SIP Snímek 90 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif logo_mu_cerne.gif Adobe Systems Inovace tohoto předmětu je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Srovnání všech přístupů Snímek 91 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 92 0029 Srovnání všech přístupů 1212569_21823227.jpg logo_mu_cerne.gif Snímek 93 0029 0029 Srovnání všech přístupů