doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D. bartosm@vfu.cz Přírodovědecká fakulta MU, 2013 1) Separační metody – izoelektrická fokusace, dvourozměrná elektroforéza, chromatografie 2) Plynová chromatografie v mikrobiologii 3) Identifikační metody - hmotnostní spektrometrie, využití protilátek, western blotting, imunoprecipitace, imunocytochemie a imunohistochemie 4) Průtoková cytometrie 2 3 Základní přednáška + odkazy na odborné publikace Kolekce proteinů v buňce = proteom 4 Dva výchozí postupy proteomiky  Proteom studuje proteomika  Poskytuje informace nedosažitelné studiem transkriptomu  Separace proteinů v proteomu  Identifikace jednotlivých proteinů po separaci Izoelektrická fokusace 5 Dvourozměrná elektroforéza  Pohyb proteinů v gradientu pH po aplikaci elektrického pole  Proteiny migrují do tzv. „izoelektrického bodu“  Separace izoelektrickou fokusací – na základě elektrického náboje  Separace elektroforézou – na základě velikosti Chromatografie  Separace na základě odlišné propustnosti proteinů náplní chromatografické kolony 6 Hmotnostní spektrometrie Detekce protilátkami  Na základě poměru hmotnosti a náboje ionizovaných molekul (MALDI-TOF)  Protilátky polyklonální  Protilátky monoklonální Další „imunologické“ metody  Western blot  Imunoprecipitace, imunocytochemie a imunohistochemie 7 ICAT Proteinové mikročipy  Isotope coded afinity tag  Srovnávání dvou proteomů po označení různými izotopy (např. normální H a deuterium)  Detekce na imobilizovaných markerech  Purifikace proteinů, stanovení expresních profilů nebo meziproteinových interakcí Průtoková cytometrie  Studium míry přítomnosti určitých antigenů v jednotlivých buňkách v závislosti na čase Aplikace elektrického pole napříč stabilním gradientem pH 9  proteiny mají specifický izoelektrický bod (pI), který odpovídá takovému pH, při kterém nemají ani pozitivní ani negativní náboj  Je-li pH vyšší než pI, pak protein nese negativní náboj  Je-li pH nižší než pI, pak protein nese pozitivní náboj Proteiny se v gradientu pH pohybují ta dlouho, dokud nedosáhnou pH odpovídající pI, pak se jejich pohyb zastaví 10 pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + 11 pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + - + + + + - + + + + + - - + + + - + + - - - - - - - + - + - - - 12 pH 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 + + + - + + - + + + + - + + + + + - - + + + - + + - - - - - - - + - + - - - + - + - - + + 7,5 + - - + + - + 6,8 + - - + + - + 8,5 + + - + - - + 5,0 + - + - + - + 9,8 13 14 Eukaryotické buňky provádějí izoelektrickou fokusaci ve vnitřním prostředí Flegr, J. (1990): "Does a cell perform isoelectric focusing?". BioSystems 24 (2): 127–133.  Slouží ke spuštění, zastavení nebo regulaci rychlosti metabolických reakcí difúzí enzymů a jejich substrátů  Buňky modifikují izoelektrický bod např. fosforylací nebo defosforylací 15  Střed buňky S. cerevisiae má pH=7,2, periferie pak pH=6,4  Střed tedy nese negativní náboj  Pozitivně nabité ionty jsou pumpovány do cisteren ER a odtud transportními vezikuly a kanály do extracelulárního prostředí  Výsledné pole je ovlivněno cytoskeletem a obsahem jednotlivých organel (lysozómy, mitochondrie, …) Všimněte si teoretické pozice proteinu o pI=6,8 1) V jednom směru jsou proteiny děleny izoelektrickou fokusací 2) Následuje ve druhém směru SDS-PAGE 16 + Izoelektrická fokusace Rozdělení podle izoelektrického bodu SDS-PAGE Rozdělení podle velikosti Specifické uspořádání proteinových skvrn ze vzorku 17 Záznam lze porovnat s jinými a tím 18  Identifikovat proteiny přítomné v jednom vzorku a ne ve druhém  Identifikovat proteiny, které se syntetizují v různé míře podle změn v okolních podmínkách nebo podle růstové fáze 2D elektroforézou lze rozlišit až 10 000 proteinových skvrn  Je souhrnné označení pro skupinu fyzikálně-chemických separačních metod  Slouží k separaci a analýze složitých směsí látek  Molekuly analyzované látky se u všech typů chromatografických separací rozdělují mezi tzv. stacionární a mobilní fázi  Dělení je založeno na rozdílné distribuci složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi 20  Metoda používána od 60. let 20. století  Použití k analýze produktů bakteriálního metabolismu 21 Rok 2001 Chapter 11 Mobilní fáze je plyn, pevná fáze pak kapalina zakotvená na pevném povrchu. Dělené látky se neustále rozpouštějí v pevné fázi a odpařují do mobilní fáze. 22  jako nosný plyn se používají plyny He, Ar, N2, H2, CO2  mobilní fáze je film kapaliny na vnitřní stěně kapiláry  jako mobilní fáze se používají polyethylenglykoly, polypropylenglykoly, polyethylenglykoladipáty, methylpolysiloxany a další 23 Komerčně dostupný systém je založen na analýze metyl esterů mastných kyselin (fatty acid methyl ester (FAME) analysis ) 24 Sherlock Microbial Identification System firmy Microbial ID, Inc, od roku 1991 Více najdete na http://www.midi-inc.com/pages/microbial_id.html  Metoda vychází z předpokladu, že některé mikroorganismy mají typické spektrum buněčných mastných kyselin  Toto spektrum se porovnává se spektrem u podobných druhů 25  Původní databáze pro identifikaci aerobních bakterií vyvinul M. Sasser v roce 1990 Více na http://natasha.eng.usf.edu/gilbert/courses/Biotransport%20P henomena/pdf/bacteria_gc_1.pdf 26 27 B. subtilis B. licheniformis B. circulans B. subtilis B. licheniformis B. circulans B. subtilis B. licheniformis Aerobacter aerogenes B. subtilis B. licheniformis E. coli podle Henis et al. 1966  Mastné kyseliny s krátkými řetězci (těkavé mastné kyseliny) k identifikaci anaerobních bakterií 28 Které to jsou ty těkavé mastné kyseliny? Kyselina octová, propionová, máselná, isomáselná, valerová, isovalerová, hexanová  Mastné kyseliny s krátkými řetězci (těkavé mastné kyseliny) k identifikaci anaerobních bakterií 29  Mastné kyseliny o délce 9-20 uhlíků pro nefermentativní Gramnegativní organismy  Na kapilárách s křemičitými kuličkami (umožňují dělit hydroxy-kyseliny a řadu izomerů) je metoda rozšiřitelná na celé spektrum čistých mikrobiálních kultur  Specifický postup přípravy vzorku  Sofistikovaný chromatografický systém 30 This system was developed for microbiologists and it does not require extensive knowledge of gas chromatography!  Subkultivace bakterií (celkem 2x) na pevném médiu = získání čisté kultury  Aerobní kultivace při 28 ºC po dobu 24 h  Kontrola čistoty kultury  Extrakce mastných kyselin 31  R1: NaOH v metanolu 32 Roztoky o vysoké puritě, nové sklo, kontakt s reagenciemi jen sklo a teflon  R2: 6N HCl v metanolu  R3: hexan v metyl tert-butyl eteru  R4: vodný roztok NaOH Mallet, A. I. (1985), Gas chromatography mass spectrometry; Applications in microbiology: Edited by G Odham, L Larsson and P-A Mardh. pp 444. Plenum Press, New York and London, 1984. 33 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/0307- 4412(85)90155-4/abstract http://www.jstor.org/disc over/10.2307/30102348?u id=3737856&uid=2129&ui d=2&uid=70&uid=4&sid= 50279540154377 34 Cherry a Moss (1969): The Role of Gas Chromatography in the Clinical Microbiology Laboratory. The Journal of Infectious Diseases 119 (6), pp. 658-662 Henis et al. (1966): Detection and Identification of Bacteria by Gas Chromatography. Applied Microbiology 14 (4), 513-524. 35 Fedorak a Westlake (1981): Microbial degradation of aromatics and saturates in Prudhoe Bay crude oil as determined by glass capillary gas chromatography. Canadian Journal of Microbiology, 1981, 27(4): 432-443 http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m81-066 Robertson (2006): Confirmation of ‘aerobic denitrification’ in batch cultures, using gas chromatography and 15N mass spectrometry. FEMS Microbiology Ecology 18 (2), 113-120. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574- 6941.1995.tb00168.x/abstract 36 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1472- 765X.1989.tb00278.x/abstract Richardson et al. (2008): Simultaneous determination of volatile and non-volatile acidic fermentation products of anaerobes by capillary gas chromatography. Letters in Applied Microbiology 9 (1), 5-8. Müller et al. (1998): Improved Identification of Mycobacteria by Using the Microbial Identification System in Combination with Additional Trimethylsulfonium Hydroxide Pyrolysis. Journal of Clinical Microbiology 36 (9), 2477-2480. 37 Metoda stanovení molekulové hmotnosti 41  Rozděluje proteiny (peptidy) podle poměru jejich hmoty a náboje  Molekula se nejprve ionizuje metodou MALDI nebo ESI (electrospray ionization)  Vzniklé ionty jsou vtaženy do analyzátoru elektrickým polem, kde se rozdělují podle poměru hmotnosti a náboje  Následuje počítačové zpracování dat matrix-assisted laser desorption ionization time-of- flight 42  varianta hmotnostní spektrofotometrie  peptidy jsou ionizovány a stanoví se poměr hmoty k náboji na základě doby letu (time-of-flight) k detektoru  vypočte se M a ta je specifická pro každou aminokyselinu 43 1) Není zapotřebí sekvenovat proteiny 2) Stačí jen znalost molekulové hmotnosti 44 1) Nelze analyzovat multimerní proteiny 2) Vzorky se izolují z SDS-PAGE 1) SDS-PAGE 2) Chemická modifikace – odbourání disulfidických můstků, karboxymetylace cysteinů 3) Štěpení proteázami 4) Extrakce peptidů acetonitrilem a vakuové vysušení 5) Rozpuštění ve vodě 6) Purifikace a úprava pro spektrometrii 45 46 47  Slouží ke studiu výsledků translace  Vznikají jako reakce organismu na antigen 48 Oblast antigenu rozeznávaná protilátkou se označuje jako epitop Lineární 49  Váží se na ně protilátky bez ohledu na konformaci  Rozpoznávají např. denaturované proteiny Konformační  Váží se na ně protilátky v závislosti na způsobu poskládání polypeptidového řetězce  Protilátky specifické pro konformační epitopy budou reagovat pouze s proteiny o přirozené konformaci Polyklonální 50  Heterogenní směs více protilátek získaných imunizací zvířete (králíka)  Jsou produktem různých klonů B-lymfocytů Monoklonální  Jediný druh molekul imunoglobulinu produkovaný jediným klonem B-lymfocytů  Nelze je produkovat přímo v těle zvířat  Produkují se v buňkách tzv. hybridomů slezina myelomové PEG selekce na HAT médiu Hybridní buňky rostou na selekčním HAT médiu 53  Obsahuje hypoxantin, ametopterin, tymin  Vyžaduje buňky s funkční hypoxantin-guanin fosforibozyltransferázou (HGPRT+)  Myelomové buňky nerostou, protože  Lymfocyty nerostou, protože jsou HGPRTv kultuře neproliferují  Antigen pro imunizaci nemusí být zcela čistý, vždy však získáme klon produkující žádanou protilátku  Metoda je šetrná pro pokusná zvířata  Zamražené hybridomy mají neomezenou životnost, přípravu není třeba opakovat 54  Kódující sekvence imunoglobulinu se naklonuje do expresního vektoru  Hostitelskou buňkou je savčí buňka  Transfektanti se chovají jako hybridomy 55  Identifikace polypeptidů protilátkami po rozdělení na denaturačním PAGE (alkalický pufr = proteiny získají negativní náboj  Rozpoznání neprobíhá v gelu, ale po přenesení polypeptidů na membránu jako u Southernova přenosu 56 Imunoblotting  rozdělení proteinů daného vzorku gelovou elektroforézou  přenos proteinů na membránu („westernblotting“)  inkubace membrány se specifickou protilátkou  inkubace membrány se sekundární značenou protilátkou  detekce navázané protilátky 57 58 SDS-PAGE směs proteinů přenesené proteiny navázání protilátky přenos na filtr inkubace filtru v roztoku protilátky specifické pro studovaný protein detekce navázané protilátky autoradiografií nebo barvením 59  Slouží k izolaci specifických proteinů z proteinových směsí prostřednictvím protilátek  Používá se ke studiu interakcí mezi proteiny 60 61 SDS-PAGE směs radioaktivně značených proteinů protilátka se váže na cílový protein inkubace se specifickou protilátkou Izolace komplexů antigen-protilátka na kuličky vázající imunoglobulin (např. protein G-agaróza) Rozbití komplexu varem, Gelová elektroforéza Detekce precipitovaného proteinu  Cílový protein se precipituje z buněčných extraktů za takových podmínek, které neničí vazby mezi proteiny  Proto se cílový protein sráží v komplexu s přirozenými partnery  Po oddělení vysrážených proteinů od ostatních složek buněčného extraktu se provede denaturace purifikovaných komplexů, SDS-PAGE a analýza společně srážených proteinů pomocí western-blottingu 62  Imunocytochemie slouží k analýze buněk  Imunohistochemie k analýze tkání 63  Obě metody jsou zaměřeny na určení buněk, ve kterých je lokalizován určitý protein jako produkt translace Oproti hybridizaci in situ  Jednodušší provedení  Riziko falešných artefaktů nižší  Určí lokalizaci proteinu, která je velmi specifická (a může naznačit funkci) oproti mRNA, které jsou většinou v blízkosti jádra  Identifikace enzymů (nitrogenáza u symbiotických bakterií s kapradinami rodu Azolla)  Využití specifických protilátek proti virům, bakteriím, houbám a parazitům pro identifikaci kauzálních agens infekčních chorob 64 1) Identifikace mikroorganismů, které lze nesnadno určit rutinním nebo specifickým barvením 2) Identifikace mikroorganismů přítomných v malém počtu jedinců 3) Identifikace špatně barvitelných mikroorganismů 4) Identifikace mikroorganismů špatně rostoucích nebo nekultivovatelných 5) Identifikace mikroorganismů s atypickou morfologií 65 Viry  HSV1 a HSV2  Virus Kaposiho sarkomu  Cytomegalovirus  EB virus  Adenoviry  Parvovirus B19 Bakterie  Helicobacter pylori  Mycobacterium  Bartonella  Streptococcus  Staphylococcus aureus  Clostridium 66 Houby  Candida  Aspergilus  Fusarium  Pneumocystis carinii  Penicillium  Cryptococcus Prvoci  Leishmania  Toxoplasma  Trypanosoma 67 Cervikální biopsie pacienta s HSV, barveno diaminobenzidinem na pozadí hematoxylinu 68 Lymfatická uzlina pacienta s Kaposiho sarkomem, lidský herpesvirus 8, barveno diaminobenzidinem na pozadí hematoxylinu 69 CMV u imunohandicapovaného pacienta, barveno diaminobenzidinem na pozadí hematoxylinu 70 Makrofág s CMV Respiračně-syncyciální virus v odlupujících se buňkách průdušek, barveno diaminobenzidinem na pozadí hematoxylinu 71 Helicobacter pylori v povrchové žaludeční sliznici, barveno diaminobenzidinem na pozadí hematoxylinu 72 Rickettsia rickettsii ve vaskulárním endotheliu plic, barveno aminoethyl karbazolem na pozadí hematoxylinu 73 Eduardo Eyzaguirre, MD; Abida K. Haque, MD (2008): Application of Immunohistochemistry to Infections, Arch Pathol Lab Med—Vol 132, pp. 424-431. 74 Metoda umožňující komplexní studium určitých parametrů v buněčných populacích 75  Poskytuje informace o jednotlivých buňkách, resp. jejich molekulách  NIKOLIV o buněčné populaci jako celku!  Počty analyzovaných jednotlivých buněk kolem 10 000  statistické zhodnocení  Sledování míry fluorescence jednotlivých buněk v populaci  Míra fluorescence odpovídá sledovanému parametru 76  Buňky nejsou při procesu poškozeny ani kontaminovány!  Míra přítomnosti určitých antigenů v jednotlivých buňkách a její závislost na čase  Studium obsahu DNA, která odpovídá fázi buněčného cyklu nebo apoptóze  Stanovení velikosti buněk, studium karyotypu, stupně granulace cytoplasmy (buněčné typy)  FRAKCIONACE buněk pomocí frakcionačního zařízení 77  Opatření sledované molekuly fluorescenční značkou (propidium jodid pro mrtvé, Hoechst 33324 pro živé, protilátky konjugované s fluorescenční značkou)  Buněčná suspenze se v trysce cytometru ultrazvukem rozdělí na malé kapičky – v každé jen jedna buňka  Kapičky procházejí detektorem s laserem – zachytí se signál z fluorescenční látky  Pro frakcionaci se kapička opatří elektrickým nábojem podle intenzity fluorescenčního signálu  Elektrickým polem lze kapičky izolovat 78 79 80 81 G1 = fáze před replikací, obsah 2N G2/M = obsah DNA 4N S = obsah DNA? 82 S = intermediární = fáze replikace = větší než G1, ale menší než G2/M Které fáze nelze průtokovou cytometrií rozlišit? G2 a M Více v 5. ročníku 83 1) Separační metody – izoelektrická fokusace, dvourozměrná elektroforéza, chromatografie 2) Plynová chromatografie v mikrobiologii 3) Identifikační metody - hmotnostní spektrometrie, využití protilátek, western blotting, imunoprecipitace, imunocytochemie a imunohistochemie 4) Průtoková cytometrie 84