Výhody: • detailně prostudovaný druh • snadný přenos DNA • vysoká účinnost transformace • k dispozici jsou R- mutanty • existuje řada expresních vektorů, s regulovatelnými promotory Nevýhody: • řadu cizorodých proteinů nevytváří ve funkční podobě • postrádá vedlejší metabolické dráhy • neexkretuje proteiny • nepatří k tradičním průmyslovým mikroorganismům Výhody a nevýhody klonování v E. coli • nedostatek vhodných vektorů • nízká účinnost přenosu DNA do buněk • negativní vliv RM-systémů • nízká exprese klonovaných genů i selekčních markerů • nízký počet kopií vektorů, jejich nestabilita Vhodné jsou vektory se širokým spektrem hostitelů: transpozony • stabilní začlenění do chromozomu • nezatěžují hostitele extrachromozomovou DNA (průmyslové kmeny) Poznatky z klonování v G- (jiných než E.coli) a G+ bakteriích Pomocný plazmid = Zdroj transponázy Micrococcus, Pseudomonas plazmid se širokým rozmezím hostitele Produkční kmeny Využití transpozonů jako vektorů s širokým rozmezím hostitele Deriváty Tn7 • gen lacZ spojen s různými vektory (deriváty pUC - vysoký počet kopií) • vnesení do buněk na sebevražedných vektorech (využití inkompatibility) Stabilní začlenění do chromozomu, následné vnášení nových genů do genu trpE Plazmidy Pseudomonas s degradačními vlastnostmi Dichlorofenoxyoctová kyselina Vývoj bakteriálního kmene s několika degradačními aktivitami CAM – kafr, OCT – octan, XYL – xylen, NAH - naftalen První patent udělený v USA GMO-mikroorganismu Použití integračních vektorů pro vnášení genů do chromozomu u Pseudomonas aeruginosa att pro fága φCTX P.a. Přenos z E. coli integráza fága φCTX selekční marker cílová místa pro Flp rekombinázu plazmid kódující Flp rekombinázu terminátory transkripce Flp stabilně začleněný gen MCS Flp-FRT recombination • produkují velká kvanta extracelulárních enzymů, které lze snadno izolovat z media • lze je snadno kultivovat a adaptovat na řadu podmínek kultivace • lze připravit celou řadu mutant, hyperprodukujících enzymy a jiné látky • jsou nepatogenní pro vyšší organismy • jsou modelem diferenciace prokaryotických buněk Výhody klonování genů v Bacillus spp. Itohiki-natto - národní potrava v Japonsku, fermentované sojové boby. Natto je tradiční japonská potravina, fermentovaná sója, která se používá v japonské kuchyni, ale i v tradiční medicíně. Má charakteristický, velmi nepříjemný zápach, způsobený přítomností vitamínu K2. Japonci se dožívají velmi vysokého věku, což je částečně připisováno i vysoké spotřebě sojových produktů a hlavně "natto". Využívá se přitom její jednoznačný trombolitický účinek. Mezi nejúčinnější komponenty "natto" patří fibrinolytický enzym "natokináza". Snižuje viskozitu krve a tím zabraňuje zpomalení toku krve a možnosti vytvoření trombu. Jeho antikoagulačně-fibrinolytický účinek je velmi vyrovnaný a zabraňuje možnosti nadměrného rozpouštění fibrínu. Kdy Natto NKCP pomáhá: při nutnosti zvýšit prokrvování mozkových cév, při potřebě zvýšit přítok krve v srdečních cévách, je prevencí infarktu, je součástí prevence vzniku trombóz v těhotenství, po operaci, při onkologických onemocněních, při cukrovce, při užívání antikoncepce apod., při problémech v oblasti dolních končetin (potrombotické stavy, bércové vředy, otoky, zvýšená pigmentace, nedokrvování končetin), je prevencí tzv. economy class syndromu (trombózy v průběhu dlouhých a častých letů letadlem), při arterioskleróze, při osteoporóze B. amyloliquefaciens - 90% průmyslově vyráběných enzymů • alfa-amyláza, celuláza • dextranáza, maltáza, pektátlyáza • esteráza, alkalická fosfatáza • proteázy (subtilizin) • lysozym • pektináza Cizorodé látky • interferon (myší, lidský) • proinzulin B. thuringiensis: δ-toxin Příklady látek připravovaných v druzích r. Bacillus 1. Transformace kompetentních buněk 2. Transformace plazmidovým vektorem nesoucím homologní sekvence („plasmid rescue“) 3. Transformace protoplastů Možnosti přenosu DNA do B. subtilis Transformace kompetentních buněk B. subtilis plazmidovou DNA (CCC forma) A. Monomerní heterologní plazmidová DNA B. Oligomerní plazmidová DNA C. Monomerní plazmidová DNA s částečnou homologií k chromozomové DNA B. subtilis. Oblasti homologie jsou znázorněny tučně. Hlavní výhoda: účinný přenos monomerních plazmidových molekul, nezávislý na rekombinaci – DNA je přijímána jako dsDNA Table 12.2 Comparison of the different methods of transforming B. subtilis Plazmidy r. Bacillus: • kryptické • značně veliké, nevhodné pro konstrukci vektorů • chybí vhodné selekční markery Izolace plazmidových mutant se zvýšeným počtem kopií (800-1000) Plazmidy S.aureus vhodné pro transformaci B. subtilis Plasmid Fenotyp hostitelské buňky Velikost pC194 Chloramphenicol-Resistenz 1,8.106 Počet kopií 20-50 pE194 Erythromycin-Resistenz 2,3.106 pSA0501 Streptomycin-Resistenz 2,7.106 pUB110 Kanamycin-Resistenz 3,0.106 pT127 Tetracyclin-Resistenz 2,9.106 Rozdíly v expresi markerů – transkripční a translační úroveň Konstrukce pendlujících vektorů pHV14 a pHV15 v E. coli ApR, CmR v B. subtilis CmR, ApS Chimerické pendlující vektory pro klonování v B. subtilis klonovací místo klonovací místo CAT – B. pumilus P 1. Nestabilita plazmidů (segregační a strukturní) 2. Restrikce exogenní DNA Table 12.4 B. subtilis – E. coli kyvadlové (shuttle) plasmidy Problémy: Recipient: B. subtilis 6GM15 – obsahuje lacZD15 napojený na G+, promotor + signály pro iniciaci translace Struktura vektoru pro přímou selekci v B. subtilis Translační fúze CAT z B. pumilis a lacZ z E. coli Selekce = CmR, EryR • transkripce: značný počet sigma-faktorů rozpoznávajících různé promotory • translace: • vyšší stupeň konzervovanosti oblastí mRNA vázajících se na ribozomy, • odlišnost iniciačního kodonu (UUG n. GUG namísto AUG, aj), • odlišné ribozomové proteiny zajišťující vazbu mRNA (nastavení SD- AUG na 30S) • odlišné využívání kodonů • transport: signální sekvence (stejná funkce jako u E. coli) Degradace proteinů vlivem silné proteolytické aktivity • nutnost používat indukovatelné promotory: CAT • snížení rozkladu přípravou proteáza-deficientních mutant (odstranění 6 exoproteáz: prodloužení poločasu rozpadu z 1,5 na 85 hodin) Faktory ovlivňující expresi klonovaných genů v B. subtilis Lokalizace proteinů u G+ a G- bakterií b) Gram-negative cell envelope a) Gram-positive cell envelope G+ G- Signální sekvence u Bacillus jsou delší než u G- bakterií a eukaryot Exprese cizorodých genů v B. subtilis s využitím sekrečního vektoru SS = signální sekvence alfa-amyláza z B. amyloliquefaciens p RBS SS Sekvence cizorodého genu Sekvence vektoru transkripce translace sekrece N C Štěpení signální peptidázou Exportovaný cizorodý polypeptid N C Odštěpení signální sekvence alfa-amylázy probíhá přesně za 31 aa Pre-α Zkrácení kódující oblasti alfa-amylázy Signální sekvence alfa-amylázy včetně promotoru Optimalizace spojení kódujících sekvencí Konstrukce plazmidového vektoru pro sekreci interferonu Místo štěpení Kódující oblastPre-α 31 aa Kódující sekvence Nekódující sekvence Plazmid nesoucí gen pro zralý IFNα2 1. Vytvoření oblasti homologie pro začlenění klonovacího vektoru 2. Klonování genu zájmu a jeho přenos do recipienta 3. Možná amplifikace začleněného genu – selekce na AntR První recipient Druhý recipient Plazmid typu pBR322 s naklonovaným genem Oblasti Homologie Oblasti homologie – sekvence pBR322 1. Plasmid Chromosom Rekombinace Plazmid obsahuje úsek homologní s chromozomem recipientní buňky Začlenění plazmidu do chromozomu za vzniku „lešení“ Vnášení heterologních plazmidů do B. subtilis s využitím „lešení“ („scaffolding“) Rekombinace KmR Amplifikace KmR až 30 kopií KmR 1. 3. 2. Vytváření delecí v chromozomu B. subtilis Selekce klonů CmR Začlenění reciprokou rekombinací Vyhledání homologních oblastí na chromozomu B. subtilis Náhodná linearizace DNA během transformace Vzájemně nesousedící oblasti chromozomové DNA B. subtilis vektor, který se v B. subtilis nereplikuje delece „vyprošťování“ genů Přenos chromozomových genů z B. subtilis do E. coli Klonování sekvencí chromozomu sousedících s místy začlenění plazmidového vektoru Klonování klastrů genů v požadovaném pořadí Rozpoznávací sekvence SfiI – vnitřní část (NNNN) je variabilní (vzácně štěpící enzym) Amplifikace genu A pomocí PCR s primery nesoucími v extenzích místa SfiI s vhodně navrženou vnitřní sekvencí PCR produkt s extenzemi SfiI PCR produkt po štěpení SfiI Klonovací vektor Vnitřní NNNNN má odlišnou podobu u každého z amplifikovaných genů Klonování klastrů genů v požadovaném pořadí – pokrač. Vzájemné spojení genů vybavených SfiI místy a jejich začlenění do vektoru Příklad: příprava kmene B. subtilis pro tvorbu hydrokortizonu postupným spojením 8 genů štěpení rekombinantních vektorů a jejich ligace přenos lineárních molekul do buněk B. subtilis transformací B subtilis lze transformovat lineárními DNA za předpokladu, že obsahují duplikace v buňkách se rekombinantní vektor cirkularizuje Analýza genů s neznámou funkcí v B. subtilis pomocí vektoru pMUTIN Vektor pMUTIN • vektor není schopen se replikovat v B. subtilis, což umožňuje provádět inzerční mutagenezu • reportérový gen lacZ usnadňuje sledovat expresi cílového genu • promotor Pspac umožňuje navodit expresi genů nacházejících se v témže operonu jako cílový gen Část genu s neznámou funkcí klonovaná ve vektoru Operon (geny orf1-3) v chromozomu B.s. orf2 je inzerčně inaktivován Reportérový gen je exprimován (vytvoří se transkripční fúze) exprese genů po směru transkripce od orf2 IPTG Pspac = PBS-pen + Olac Charakteristika promotoruCharakteristika promotoru Pspac K 3´ konci promotoru genu pro penicilinázu z B. licheniformis (PBSpen) byl připojen lac operátor z E. coli (Olac). Gen kódující lac represor z E. coli byl zařazen pod kontrolu bacilového promotoru a RBS umožňujících jeho expresi v B. subtilis Promotor je aktivní v řadě dalších G+ bakterií (stafylokoky, streptokoky…) Pspac = PBSpen + Olac hybridní promotor regulovatelný v bacilech pomocí IPTG • producenti antibiotik (60%) a extracelulárních proteinů (enzymy a inhibitory enzymů) • přenos transformací do protoplastů (PEG) • vektory odvozeny z plazmidů (SCP2) – charakter kyvadlových vektorů • selekční markery – antibiotika (thiostrepton, viomycin, neomycin nebo metylenomycin) • fágové vektory podobné lambda fágu (např. ΦC31) – přenos transformací do lyzogenů nebo má vektor sekvenci homologickou s chromozomem recipienta Přenos kompletní biosyntetické dráhy pro tvorbu antibiotik Klonování velkých úseků (40-100 kb) genomové DNA streptomycet ve vektorech BAC, pak přenos vektorů elektroporací do buněk streptomycet (nebo do protoplastů) a selekce klonů, v nichž se klonovaný úsek začlenil do chromozomu Klonování ve streptomycetách Izolace genů pro tvorbu antibiotik Princip mutačního klonování u streptomycet Promotor Kódující oblast Terminátor Vektory obsahující různé úseky genu X Výsledek začlenění vektoru homologní rekombinací (1 x CO) I. II. III. Postup mutačního klonování pro izolaci genů 1. Klonování chromozomového genu X (antR) do fágového vektoru (konstrukce genové knihovny) 2. Infekce buněk původního kmene exprimujícího gen X (AntR), selekce transduktantů na rezistenci k viomycinu (gen vph nesený na fágovém vektoru). Výsledkem začlenení vektoru homologní rekombinací je duplikace homologní sekvence, která vede k jedné ze 3 možností: • Vektor nese promotor (I) nebo terminátor (III), funkce genu zůstává zachována • Vektor nese kódující oblast genu (II), inzercí vektoru dojde k jeho inzerční inaktivaci (mutaci) → vyhledání klonů nesoucích mutaci hledaného genu Gen X na chromozomu Klonování genů v archeích • extremofilní organismy (T, pH, konc. solí) • jedinečné fyziologické vlastnosti (např. striktně anaerobní a metanogenní) Přenos genů: • elektroporace, nízká účinnost • transformace zprostředkovaná PEG • transformace zprostředkovaná lipozomy Vektory: používány jako kyvadlové, některé se integrují do chromozomu (inz. inaktivace) • plazmidy • viry Selekční markery: rezistence k antibiotikům (puromycin, novobiocin, thiostreptin, mevinolin) Reportérové geny: β-glukoronidáza, β-galaktozidáza, trehaláza Konjugativní přenos plazmidových vektorů z Escherichia coli do metanogenních archeií Methanococcus maripaludis Požadavky pro úspěšnou konjugaci: a) Přítomnost oriT v poloze cis na plazmidu, který je přenášen mobilizací, b) mobilizační funkce v donorové buňce (zajišťuje plazmid RP4) c) Donorové buňky musí být životaschopné d) Je vyžadován kontakt buněk e) DNáza nezabraňuje přenosu Závěr: dochází ke konjugativnímu přenosu genů z bakterií do archeí (další možnost vedle transformace pomocí PEGu) Struktura přírodních a hybridních isochromanchinonových antibiotik vytvářených streptomycetami po přenosu plazmidu přírodní hybridní Do buněk kmene streptomycet produkujícího určité antibiotikum se vnese transformací plazmid obsahující všechny nebo část genů kódujících příbuzné antibiotikum. Kmen pak vedle původního antibiotika vytváří nové antibiotikum, které je mírně odlišnou strukturní variantou toho původního.