Důvody pro klonování genů v eukaryotech A. Funkce charakteristické pro eukaryotické buňky, které se u baktérií nevyskytují: - lokalizace systému regenerujícího ATP v mitochondriích, - uspořádání DNA v chromatinu - způsob dělení buněk, mitoza a meioza - diferenciace buněk, buněčné komunikace, signální dráhy B. Rozdíly v expresi genů u eukaryot oproti bakteriím: - odlišnost regulačních sekvencí pro transkripci, translaci a export - specifické posttranslační modifikace Výhody kvasinek pro Gl • jednoduchá eukaryota s mikrobiálním charakterem (malý genom se známou sekvencí, krátká generační doba a vysoký počet potomstva, kultivace na definovaných půdách, řada mutant získaných a charakterizovaných klasickou i moderní genetikou • řada genů homologních vyšším eukaryotům, podobná buněčná biochemie a regulace genů • možnost stanovit dominanci a recesivitu alel (na haploidním pozadí) • vysoká frekvence homologní rekombinace - záměny genů • tradiční dobře definovaný a bezpečný biotechnologický organismus, možnost přípravy farmak pro humánní medicínu, • eukaryotické proteiny vytváří v aktivní podobě, lze dosáhnout sekrece do prostředí Životní cyklus kvasinek Zygotic diplophase Conjugation @ CQ Meiosis an d ion Ä , Haploid aO O3spores \ 0°O Haptophases © 3 °o Oa Oa tetrádová analýza Dva typy haploidních buněk: a a a Heterotalické kmeny - stabilní Homotalické kmeny - nestabilní, haploidní buňky spontánně revertují na opačný buněčný typ Molekulární struktura kvasinkového 2\i plazmidu REP2 Izomerní formy plazmidu 6,3 kb; 50-100 kopií REP - replikace FLP - rekombince STB - rozklad kointegrátu FRT site = FRT recombination target Flp recombinase = flippase Systém Flp/FRT ~ Cre/loxP Chimérické plazmidy vytvořené spojením plazmidu 2|u a pMB9 štěpených EcoRI, (dále pak vložení genu Ieu2 z kvasinkového chromozomu do místa Pstl na plazmidu) Kyvadlové vektory pro klonování genů v kvasinkách Přenos do kvasinek: transformace protoplastů elektroporace Základní typy kvasinkových vektorů integrující ~ pBR322 Amp ura3 Replikující se velký počet kopií, stabilní AmpR cirkulárnf 2^-DNA ura3 Epizomální, malý počet kopií, nestabilní ARS ura3 nesoucí centromeru (jediná kopie; stabilní) AmpR Amp ARS CEN3 ura3 Možnost eliminace bakteriálních sekvencí jejich ohraničením FLP Umělý kvasinkový chromozom (YAC) EcoRI CEN4 ARS2 TRPÍ AMPR EcoRI ARS2 URAZ BamHI BamHI Cut with EcoRI and BamHI AMP ori TEL BamHI CEN4 7RP1 BamHI TEL URA3 L--awMaa EcoRI Genomic DNA EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI Partial digest with EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI EcoRI DNA CEN4 7RP1 I Transform into ade , ura , trp yeast and select for red, URA+, TRP+ colonies Virům podobné částice odvozené z Ty elementů nesoucích kódující oblast HIV1 TAT Ty-element: 30-40 kopií v genomu S. cerevisiae, velikost 5,9 kb LTR - 334 bp, levá funguje jako promotor genů pro RT a integrázu Pseudovirion (virus like particle, VLP) obsahuje mRNA, dsDNA, RT a integrázu Promotor kvasinkových genů 2jliORI Transkript vloženého 8 (klonovaného) genu URA3 Struktura vysokokopiového plazmidu používaná pro začlenění modifikovaného Ty elementu nesoucího klonovaný gen do chromozomu kvasinky. pGAL a P jsou kvasinkové promotory, 5 (delta sekvence ) jsou LTR Table 13.1 Properties of different yeast vectors \/ E KT^D R Transformation Copy no./ non-selective Vector frequency cell medium Disadvantages Advantages integrující se Yip epizomální (ori 2 ja) replikující se (ars) YEp YRp centromerový YCp umělý chromozom yaC transpoziční Ty 10* 1 transformants per ^ig DNA transformants per ug DNA 10J transformants perug DNA 10" transformants per ,.g DNA Depends on vector used to introduce Ty into ceil 25-200 1-20 1-2 1-2 -20 Much less than 1% per generation 1 % per generation Much greater than 1 % per generation but can get chromosomal integration Less than 1% per generation Depends on length: the longer the YAC the more stable it is Stable, since integrated into chromosome 1 Low transformation frequency 2 Can only be recovered from yeast by cutting chromosomal DNA with restriction endonuclease which does not cleave original vector containing cloned gene Novel recombinants generated in wVoby recombination with endogenous 2-urn plasm id Instability of transiormants Low copy number makes recovery from yeast more difficult than thai of YEp or YRp vectors Difficult to map by standard techniques Needs to be introduced into cell in another vector 1 Of all vectors, this kind give most stable maintenance of cloned genes 2 An integrated Yip plasmid behaves as an ordinary genetic marker, e.g. a diploid heterozygous for an integrated plasmid segregates the plasmid in a Mendelian fashion 3 Most useful for surrogate genetics of yeast, e.g. can be used to introduce deletions, inversions and transpositions (see Botslein & Davis 1982) 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number 3 High transformation frequency 4 Very useful tor complementation studies 1 Readily recovered from yeast 2 High copy number. Note that the copy number is usually less than that of YEp vectors but this may be useful if cloning gene whose product is deleterious to the cell it produced in excess 3 High transformation frequency 4 Very useful (or complementation studies 5 Can integrate into the chromosome 1 Low copy number Is useful if product of cloned gene is deleterious to cell 2 High transformation frequency 3 Very useful for complementation studies 4 Al meiosis generally shows Mendelian segregation 1 Hig h- capac ity clon ing syst e m permitting DNA molecules greater than 40 kb to be cloned 2 Can amplify large DNA molecules in a simple genetic background Get amplification following chromosomal integration Selektovatelné markery u kvasinek Gen Enzym Selekce HIS3 Imidazole glycerolphosphate dehydratase histidine LEU2 p-lsopropylmalate dehydrogenase leucine LYS2 a-Aminoadipate reductase lysine TRP1 N-(5'-phosphoribosyl)-anthranilate isomerase tryptophan U R A3 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase uracil Pozitivní selekce na mediu bez příslušného faktoru G418 - rezistence k geneticinu (KanR) Využití genu LEU2 jako selekčního markeru II - Kolonie Ieu2~ / \ T Chromozomy -bez genu LEU2 (b) Použití LEU2 jako selektivního markeru Médium musí obsahovat leucin LEU2 Transformovat kvasinky Přežívají pouze transformované buňky Vektor - nese správný gen LEU2 h Minimální médium - bez leucinu Začleňování epizomálních plazmidů do chromozomu kvasinek YEp13 Slouží současně jako selekční marker LEU2 Jř///A V leu - — Chromozomální DNA kvasinek Rekombinace LEU2 leu Výhody dostupnosti různých typů kvasinkových vektorů • Všechny kvasinkové vektory mohou být použity k vytváření částečných diploidů nebo částečných polyploidů, přičemž genové sekvence zavedené do buňky mohou být buď začleněny do chromozomu nebo přetrvávat v extrachromozomálním stavu. • Do klonovaných genů mohou být zaváděny in vitro mutace a pozměněné geny lze pak vrátit do kvasinky a nahradit jimi alely standardního typu. Reportérové geny Gene Protein Size (amino acids) Original source Detection Reference cat Chroloamphenicol 219 E. coli Tn9 Acetylation of (Gorman, Moffat and acetyltransferase transposon chloroamphenicol using 14 C acetyl-CoA Howard, 1982) lacZ /J-galactosidase 1024 E. coli Conversion of colourless (Norton and Coffin, p ONPG to a yellow product; 1985) XGal blue-white screening gusA /(-glucuronidase 603 E. coli Conversion of MUG in a fluorometric assay; XGluc blue-white screening (Jefferson etal, 1986) lue Luciferase 550 Photinus pyralis (firefly) Oxidation of luciferin to produce light (de Wet et al.y 1987) GFP Green fluorescent protein 238 Aequoria victoria (jellyfish) Emits green fluorescence when exposed to blue or UV light (Chalfie etal, 1994) ONPG - o-nitrophenyl-^D-galactopyranoside. XGal - 5-bromo-4-chioro-3-indoly]-^-D-galactopyranoside. MUG - 4-methylumbelliferyl /8-D-glucuronide. XGluc - 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-/3-D-glucuronide. Exprese genů v kvasinkách • Pro účinnou expresi je žádoucí, aby klonované sekvence byly pod kontrolou kvasinkových promotorů - ty mají určitá specifika. Vektory proto mají promotory z kvasinek. • Poločas mRNA (1-100 min) je silně ovlivněn netranslatovanými sekvencemi na 5'a 3'konci - jejich odstranění poločas zvýší • Kvasinky mají jiné využívání kodonů než bakterie nebo vyšší eukaryota. Při chemické syntéze genů je třeba volit kodony, které jsou čteny (96% aminokyselin v kvasinkových proteinech je kódováno jen 25-ti z 61 možných kodonů) • Exkrece proteinů: signální sekvence jsou dlouhé 20-90 aa. Přesná pravidla nejsou známa - u některých proteinů se exkrece nedaří. Sekrece zabrání rozkladu proteinu v cytoplazmě - proteolýze lze zabránit též změnou aa na N-konci (zábrana ubiquitace) Exprese genů v kvasinkách - pokrač • Glykozylace - dochází ke glykozylaci cizích proteinů, ale struktura a sekvence oligosacharidů připojovaných na proteiny je odlišná než v přirozených hostitelích - to může mít důsledky pro stabilitu, imunogenitu a výslednou lokalizaci v tkáních (např. při terapeutickém používání) • Stabilita proteinů. Rychlá degradace proteinů po jejich syntéze nebo po rozbití buněk a purifikaci endoproteinázami, karboxypeptidázami a aminopeptidázami přítomnými ve vakuolách. Byla zkonstruována řada mutantních kmenů s pozměněnou aktivitou těchto enzymů. • Sestřih. Introny mají obecné rysy (5' GU - AG 3') a další konsenzuální sekvence. U kvasinek je před 3'místem sestřihu sekvence, která chybí u vyšších eukryot. Struktura kvasinkového promotoru 4 elementy: 1. TC(G/A)A a PuPuPyPuPu jsou u více než poloviny známých kvasinkových promotorů. Tyto sekvence nejsou u vyšších eukaryot, což ukazuje na rozdílný mechanismus jejich transkripčního aparátu. 2. TATA box, oblast 20-120 nukleotidů před místem iniciace. 3. Sekvence umístěné proti směru transkripce podílející se na regulaci genů: A. sekvence aktivující transkripci (UAS) - vazba pozitivního regulačního proteinu na UAS zvyšuje rychlost transkripce, zatímco delece UAS transkripci potlačí. Důležitým strukturním rysem UAS je přítomnost jedné nebo více oblastí s dvojitou symetrií. B. sekvence reprimující transkripci (URS). Vazba negativního regulačního proteinu na URS snižuje rychlost transkripce genů, které jsou regulovány negativně. 4. Sekvence umístěné uvnitř samotného genu, které se označují jako aktivující sekvence umístěné po směru transkripce (downstream activating sequences, DAS). Nízká množství heterologních proteinů odráží nízké množství mRNA jako důsledek nízkého stupně iniciace transkripce. Např. vložení aktivující sekvence umístěné po směru transkripce genu PGK obnovuje rychlost transkripce mRNA. Struktura typického kvasinkového promotoru TC(GA)A PuPuPyPuPu * I Initiator Nejsou u vyšších e u kary ot i UAS URS TATA Kódující[ ] sekvence U regulovaných genů 40-120 bp 20-400 bp Ovlivňuje rychlost iniciace transkripce 100-1400 bp I Vložení do sekvence cizího genu Příklady konstitutivních ADHI - alkoholdehydrogenáza kvasinkových promotorů _ PGK- fosfoglycerolkináza používaných v expresních PH05 - kyselá fosfatáza vektorech alfa-faktor (+ signální sekvence pro exkreci) Gal systém S. cerevisiae využitý pro expresi genů pgali Gal1 (galaktokináza) Gal4p + galaktóza (induktor) Transkripční aktivátor Gal1 Gen zájmu P*Gan = syntetický promotor obsahující více vazebných míst pro Gal4p + galaktóza (induktor) Gal4p GaM GAL4 Exprese genů indukovaná galaktózou A. Gal4p vytvářený z vlastního promotoru B. Gal4p vytvářený z promotoru Gali GAL4 nízká hladina Gal4p, málo cílového produktu GAL1 vysoká hladina Gal4p, hodně cílového produktu Promotorv S. cerevisiae vyuzivane v expresnich vektorech Promotor Podminky pro expresi Tvorba produktu Acid phosphatase (PH05) Phosphate-deficient medium Inducible Alcohol dehydrogenase I (ADHI) 2-5% Glucose Constitutive Alcohol dehydrogenase II (ADHII) 0.1-0.2% Glucose Inducible Cytochrome q (CYC1) Glucose Repressible Gal-l-P Glc-l-P uridy transferase Galactose Inducible Galactokinase (GAL1) Galactose Inducible Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD, GAPDH) 2-5% Glucose Constitutive Metallothionein (CUP1) 0.03-0.1 mM copper Inducible Phosphoglycerate kinase (PGK) 2-5% Glucose Constitutive Triose phosphate isomerase (TPF) 2-5% Glucose Constitutive UDP galactose epimerase (GAL10) Galactose Inducible Sekrece proteinů v kvasinkách Hlavní rysy sekretovaných proteinů: • jsou syntetizovány na endoplazmatickém retikulu • z ER jsou transportovány do Golgiho aparátu, kde jsou upraveny a zabaleny do sekrečních váčků • Fúze sekrečních váčků s plazmatickou membránou se děje konstitutivně nebo jako odpověď na externí signál • Nakonec jsou lokalizovány na buněčném povrchu nebo exportovány z buňky Proteiny přirozeně sekretované do růstového media a) párovací feromony (a-faktor, a-faktor) b) killer toxin (proteinový produkt dsRNA n. dsDNA plazmidu n. VLP); molekuly působící toxicky na jiné kmeny kvasinek). • Polypeptidy určené k sekreci mají hydrofobní N-konec, který je odpovědný za translokaci do endoplazmatického retikula. • N-konec je obvykle tvořen 20 aminokyselinami a odštěpen ze zralého proteinu uvnitř endoplazmatického retikula. Bylo dosaženo sekrece řady ne-kvasinkových polypeptidů z rekombinantních plazmidů, ale pravidla pro sekreci nejsou zcela jasná. Problémy při expresi některých proteinů v S. cerevisiae • nízká exprese klonovaných genů, nízký výtěžek proteinu • hyperglykozylace heterologních proteinů • pozměněný transport sekretovaných proteinů (zadržení v periplazmatickém prostoru) • tvorba vysoké koncentrace alkoholu, který usmrcuje buňky a snižuje výtěžek proteinů Cílení proteinů do jádra Jádro kvasinky obsahuje sadu proteinů, které jsou syntetizovány v cytoplazmě. Pro objasnění mechanismu týkajícího se lokalizace proteinů v buňce byly zkonstruovány hybridní geny fúzí kvasinkového Matalfa genu, kódujícího předpokládaný jaderný protein, a genu lacZ z E. coli. Segment genového produktu MATalfa, který byl 13 aminokyselin dlouhý, byl schopen usměrnit p-galaktozidázovou aktivitu do jádra. To bylo potvrzeno imunofluoroscencí. Podobné sekvence byly zjištěny u jiných proteinů a označeny jako nuclear localization signals (NLS) Podle současného modelu pro import jaderných proteinů jsou proteiny obsahující NLS rozpoznány specifickými receptory (nuclear transport receptors) v cytoplazmě. Komplex NLS-receptor se pohybuje k jaderným pórům, které otvírá reakcí vyžadující ATP a dovoluje, aby protein vstoupil do jádra. Klonování kvasinkových genů v buňkách E. coli s využitím komplementace Yeast cells Chromosomal DNA 30 % genů kvasinek se exprimuje v E. coli Získávání nových kvasinkových selekčních markerů IBJ2' gene Most cell: don't grow Four-base /'"sticky end" Bacterial origin of replication Genová knihovna kvasinky Transform ^jj^^^^fl^ Plate onto medium lacking leucine Přenos do mutantnich kmenů E. coli Cells contain plasmid with t£l/2 gene LEU2 gene functions in E coli hledaný gen Klonování kvasinkových genů na genetické komplementace Xts recipient: kvasinkový kmen nesoucí ts mutaci v genu X a mutaci v genu Ieu2 -roste jen při 30 °C <°>® (*°) Leu Q Plasmid library Yeast transformation Příprava genové knihovny z kvasinkového kmene s genem X(wt) ve vektoru obsahujícím jako selekční marker LEU2 Replica plate Incubate plate at 30°C Plate onto medium lacking leucine Incubate at 30°C (permissive temperature) Only cells that contain a plasmid grow All cells grow izolace klonu X+ Incubate plate at 37°C (nonpermissive temperature) Only cells that contain plasmid with wild-type gene X will grow at 37°C Isolate píasmid Determine DNA sequence of gene X J Translate to obtain protein, sequence encoded Začleňování genů homologní rekombinací Left half Right half oíURA3 YFG pUC of URA3 I / / Left half Right half flfWU URA3 pUC ofVTG / / / One chromosome contains VFG integrated at URA3 locus YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme One chromosome contains URA3 gene intergrated at YFG Linearizace plazmidu v místě homologie zvyšuje frekvenci začlenění asi 100x Vnášení genů do chromozomu kvasinek pomocí integrativních vektorů Amp' gene o/7E M GOl LEU2 A2 ^—I I—T H" RE" RE Restriction endonuclease Transformation GOI = gen zájmu A/, A2 = nesenciální geny Chromosome Recombination } L t HI D—E Chromosome Vyprošťovací replikující se vektor AmpR Ieu2 ARS plazmid obsahující divokou alelu MAT Xho\ Xho\ AmpF Ieu2 ARS i i i r-rr plazmid 5 mezerou MAT" I I mutovaná alela Linearizovaný plazmid se nereplikuje chromozóm kvasinky Část genu mat je vyštěpena, hraniční sekvence jsou ponechány -e kombinace a duplikace genu ■ 4-1 Amp" Ieu2 ARS TT~T plazmid nesoucí MAT se může replikovat v kvasince MAT- transformace E co// a vyhledáni plazmidů nesoucích Inzert s MAT" Homologní rekombinace a cirkularizace plazmidů, jejich izolace a přenos do E. coli, studium mutantnf alely M A T' Rekonstrukce plazmidu homologní rekombinací v kvasinkové buňce Vložení nového selekčního markeru do plazmidu, překlonování genu zájmu do jiného typu vektoru Plazmid, který se v kvasince nereplikuje společně přeneseny do kvasinky transformací Plazmid, který se v kvasince replikuje i Recombination Eco Selekce klonů na HIS3, případně na UR A3 Vytěsnění a záměna plazmidů piasmid shuffle Studium funkce mutantních a cizích genů Trojnásobný mutant TPK1-, TPK2-, TPK3- ura+, his-H, trp+, ade-, leu- Myší c AM P dependentní PK Yeas! cell 2(i ori\ O Transform into yeast Plate to select For Ade+, Leu+ transformants kinase gene Medium lacking -adenine and leucine All cells on piafe contain both plasmids Culture a colony in complete medium (YPD) Cells can lose one of the [wo plasmids Plate cells onto YPD medium Cells need at least one protein kinase gene to grow Replica plate Cells in colony contain only the piasmid with mouse protein kinase gene contain only the ŕ piasmid with TPKl I Hacking leucine Cell contains only the piasmid with IPKI Colony Fails to grow Umožňuje růst na mediu bez adeninu Zajišťuje životaschopnost buňky Selekce buněk obsahujících oba plazmidy - půda bez ade a Kultivace buněk za neselektivních podmínek Buňka si musí alespoň jeden z plazmidů s PK podržet Závěr: Gen pro myší proteinkinázu může nahradit gen TPK1- Dvouhybridní systém ke studiu interakce proteinů Hybridní protein Gal4p-X se váže na promotor, ale není schopen aktivovat transkripci re portérové ho genu Hybridní protein Gal4p-Y se není schopen vázat na promotor a tudíž není schopen aktivovat transkripci Interakce hybridních proteinů Gal4p-X::Gal4p-Y aktivuje transkripci UASG Plazmidy určené k vytváření fuzních proteinů s aktivačními doménami Gal4p (DBD a AD) Selekce plazmidů Vyhledání genů jejichž produkty interagují SNF1 a SNF4 asociují za vzniku produktu s protein-kinázovou aktivitou QFP funkčně aktivní TF se vytvořil spojením proteinů SNF1 a SNF4 - tj. tyto proteiny vzájemně interagují Genetický důkaz funkce U2 snRNA jo] Wild-type strain [strain A] U2 snRNA Medium Jacking histidine Cells make their own histidine and grow hi$4 mRNA spliced (b) Mutant strain (strain B) / Wild-type U2 gene Mutation kulant hhA gene (c) Mutant strain (strain 8) ^ Wild-type U2 gene i iMEllilflfllWI Mutant intron III I II Wild-type U2 snRNA / Mismatch destabilizes RNA hybrid '\ Medium lacking Cells foil to grow histidine hiU mRNA not spliced Introduce plasmid into cells by transformation mutant U2 gene LEU2 a UACAaIICA^ Mutant intron Tili i i i Mutant U2 snRNA Base-pairing restored Selection for cells containing plasmid Medium lacking histidine \ Replica plate Pokus prokazuje, že U2 RNA se při sestřihu páruje přímo s intronem. Mutant strain can now make histidine hisd mRNA spliced Náhrada chromozómového genu (gene knockout) pUC118 YFG = your favourable gene Disrupted gene replaces wild-type gene in one chromosome Plate onto medium lacking uracil YFG = gen zájmu, jehož funkci sledujeme, inaktivovaný genem URA3 / YFG )ther chromosome normal t Sporulate Dissect tetrads Characterize haploid cells Tetrádová analýza: sporulací dochází k separaci mutantní a standardní alely Diploid cell: Four haploid spore (''•jř^, cells encased by x55^ ascus wall One chromosome contains integrated URA3 gene at YFG Complete All colonies are Ura No growth Conclusion: YFG is an essential gene Pokud je funkce genu YFG nutná pro přežití, spory nebudou schopny růst na plotnách bez uracilu, neboť gen URA3 je součástí pouze přerušených (inaktivovaných) genů. Potvrzení inzerce URA3 do YFG VACCINES Hepatitis B virus surface antigen Malaria circumsporozoite protein HIV-1 envelope protein DIAGNOSTICS Hepatitis C virus protein HIV-1 antigens HUMAN THERAPEUTIC AGENTS Epidermal growth factor Insulin In sul in-1 ike growth factor Platelet-derived growth factor Proinsulin Fibroblast growth factor Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor oti antitrypsin Blood coagulation factor XHIa Hirudin Human growth factor Human serum albumin Figure 7.4 Recombinant proteins produced by S. cereviae expression systems. HIV-1, human immunodeficiency virus type 1. Kvasinka Pichla pastori s Má schopnost metabolizovat metanol jako jediný zdroj uhl a energie Metabolismus metylotrofů umožňuje vytvářet „single-cell" proteiny - krmivo pro dobytek bohaté na proteiny Heterologní exprese proteinů v metylotrofní kvasince - Píchla pastoris Další druhy: Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha 1. Jednoduché techniky pro genetickou manipulaci u Pichia, podobné jako u S. cerevisiae. 2. Kultivace za definovaných podmínek včetně velkokapacitní kultivace 3. Schopnost P. tvořit proteiny ve velkém množství, buď intra- nebo extracelulárně (samy tvoří jen málo vlastních exkretovaných proteinů) 4. Schopnost provádět eukaryotické posttranslační modifikace (glykozylace, tvorba disulfidických můstků a proteolytický procesing). 5. Dostupnost tohoto systému pro komerční účely. Vektory pro expresi v Pichia a) jsou kyvadlové (+ E. coli) b) mají markery pro E. coli a pro kvasinky (ura, his, ade atd) c) mají expresní kazetu odvozenou z genu AOX 5'-promotorové sekvence terminátor transkripce mezi promotorem a terminátorem je MCS d) u sekrečních vektorů jsou signály z kyselé fosfatázy (PHO) nebo alfa-MAT Hostitelské kmeny: nesou auxotrofní mutace pro selekci vektorů jsou proteáza deficientní Expresní vektory často inzertovány do chromozomu Vektory s vícenásobnou kopií cizorodého genu a) kopie genu uspořádány „hlava k patě" b) vektor obsahující gen kanR - amplifikace pomocí G418 Metabolizmus metanolu Metanol induktor Alkoholoxidáza AOX1 a AOX2 Buněčné komponenty Formaldehyd + peroxid H dehydrogenázy Formát + CO, energie Po indukci metanolem je 5 % transkriptů tvořeno genem pro alkoholoxidázu, která dosahuje až 30 % všech proteinů v buňce V přítomnosti jiných substrátů (glukóza, glycerol, etanol) je hladina AOX nízká Expresní vektor P. pastoris Geny jsou klonovány za silný methanolem indukovatelný promotor genu alkoholoxidázy (AOX1) vložený do expresních vektorů. Syntéza proteinu je spouštěna přidáním methanolu do média, které neobsahuje jiný zdroj uhlíku a metanol tak tvoří jediný zdroj uhlíku Konstrukce vektorů s kopiemi expresní kazety Insert BglII-BamHI Fragment into BamHI Site of pA0816 Začlenění genu klonovaného v integračním vektoru do specifického místa chromozomu P. pastoris 1 xCO Integrační vektor 5' AOX1 GOI TT HIS4 GOI = gene of interest Chromosome mutace bis4 5' AOX1 COI TT HIS4 I 2xCO RE L Rr 5' AOX1 COI TT I ■ H/S4 3' AOX1 Reštrikční fragment vyčleněný z vektoru 5' AOX1 Chromosome AOX1 3' AOX1 5' AOX1 GOI TT HIS4 3' AOX/ Chromosome Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Comments: mode, amount, Reference signal sequence Bacteria Bacillus, lickeniformis a-amylase S, 2.5 11~\ SUC2 [51,60) Bacillus siearothermophilus o-alanine carboxypeptidase S, 100 mg l-1, native [61] Bordetella pertussis pertussis pertactin (P69) I, 3 g 1"' [62] Clostridium botulinum neurotoxin (BoNT) serotype A and B I, 78 mg I"1 [63] Clostridium botulinum neurotoxin heavy chain fragment, serotype B I, 390 (ig g~' Clostridium botulinum neurotoxin serotype A binding domain I, 2.4 mg total Clostridium lettmi tetanus toxin fragment C Escherichia coli acid phosphataie/phytase (appA2) Escherichia coli ß-galactosidase Escherichia coli ß-lactamase Leishmania major cathepsin B-tike protease Staphylococcus aureus staphylokinase Streptococcus equisimilis streptokinase Streptomyces subtiltsin inhibitor Streptomyces tiridosporus T7A peroxidase, endoglucanase Toxoplasma gondii SAG1 antigen Vibrio cholerae accessory cholera enterotoxin (Acc) Fungi Alteritaria Alt 1 allergen Aspergillus awumori glucoamylase Aspergillus awamori glucoamylase catalytic domain Aspergillus fximigatus eaialase L Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase [V (DPP IV) Aspergillus fumigatus dipeptidyl peptidase V (DPP V) Aspergillus giganteus cc-sarcin ribotoxin Aspergillus niger phytase (phyA) Candida guilllermondii xylose reductase gene (xyll) Candida mgosa lipase i (CRL) , b, IJU U ml",a-J Fusarium soteini pectate lyase (peIC) - S, 1 mg l-1, PHOI [82] Fusarium lolani pectate lyase fpelD) S, native [83] Geotrichum candidum lipase isoenzymes >■ ■ • S, 60 mg 1"', a-MF [84] Phytophtkora cryptogea J3-cryptogcin S, 45 mg I-1, PHOI [Si] Rhisoptts tyj'Stfe lipase S, 60 mg I"1, a-MF [S6] Saccharomyces cerevislae invertase S, 2.5 g I-1, native [30] Saccharomyees ceretisiae Ktrlp S, 400 mg I-1; PHOI [S7] Saccharomyces cerevislae (a-1.2-mannosyltransferase) S, 40 mg PHOI [87] Schizophyltum commune vitamin B2-aldehyde-forming enzyme S, 120 mg I-1, a-MF [88] Trametes versicolor (white rot fungus) laccase (led) S, native and a-MF [89] Trichoderma Itarzianum p-(l-6)-glucanase S, 9.3 mg l_l [90] i, 12 $ r'. [66] S. 28.9 U mg"1 [67] 1, 2.0X10) U mg"1 [7] I [20] S, a-MF [68] S, 50 mg I-1, a-MF [69] I, 77. mg r1, ■. [70] s [71] S, 2.47 g l_l total protein, a-MF [72] S, 12 mg I-1, a-MF ■ 173] S, 7 mg I-1, a-MF [74] S,.a-MF. [75] S, 400 mg L"1, native [76] S, 400 mg I-1, PHOI [47] S, 2.3 g r1, PHOI [77] S, PHOI (78] S, 0.15 mg r1. PHOI [79] S, 1 mg-l"[, synthetic native, PHOI [43] S, 65 0" ml"1, a-MF [801 I, 0.65 U mg"1; S, 0.18 U mg"', a-MF [81] I = intracelulární, S = sekretovaný Table 3: Heterologous proteins expressed in P. pastoris Protein Protists Chondrus crispus red alga hexose oxidase Gracihriopsis lemanei/ormis red alga a-l,4-gluean lyase (GLql) Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 (MSP-l) Plasmodium vhu.v apical membrane antigen I (AMA-l) Reticulomyxa filosa (giant freshwater ameba) rx2, |}2 tubulin isoforms Trypanosoma thai acid a-mannosidase Plants Allium sativum (garlic) alliiri lyase Arabidopsis thaliuna NADH: nitrate reductase Barley (Hordeuin vulgare) sucrose fructan 6-fructosyl transferase Barley a-amylase 1 Barley a-amylase 2 Barley aleuronc tissue a-glucosidase Coffee bean a-galactosidasc Cynara cardimculus (cardoon) cyprosin Cynodon daciylon (Bermuda grass) Cyn d I Calanthus nivalis agglutinin Hevea brasiliensis hydroxynitrile lyase Hevea brasiliensis Hcv b 7 patatin-iike allergen Maize cytokinin oxidase Oat photochrome A, phA Oat phyiochrome A, phyA65 apoprotein Comments: mode, amount, Reference signa] sequence I [91] I [92] S..24 mg rl, a-MF [931 S, 50 mg r\ PHOl [94] r, 4oo'ug g-' . *. [95] S, 11.5 ug l-1, native ' [96] I, 2.167 U g_1 [97] li 18 ug g"! [98,99] S, a-MF [100] S, 50 mg I"1, native [48] S, 1 mg 1"', native [4S| S, a-MF [101] S, 400 mg r1, a-MF (102) S, 1 mg l-1, native [103] S, 1.5 g r1, PHOl [104,105] S, PHA-E [45] I, 22 g I"' [106] S, 10 mg r1, a-MF [107.108] S, native [109] I, 30 ug g"1 [110,111] 1, 20 ug g_l [112] I = intracelulární, S = sekretovaný