Aplikace genového inženýrství – příprava farmakologicky nebo průmyslově významných látek • Hormony, • Růstové faktory • Vakcíny, • DNA-vakcíny • Protilátky, • Abzymy, • Imunotoxiny • Další biologicky aktivní látky (interferon, krevní srážecí faktory aj) Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin preprohormon proinzulin prohormon aktivní inzulin zralý hormon DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B Beta-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor Příprava lidského růstového hormonu (hGH) v bakteriích Met není u přirozeného hGH Příprava formy hGH sekretované v bakteriálních buňkách Příprava tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) P T Amplifikace genů tPA tPA Štěpení plazminogenu plazmin Degradace fibrinu – rozpouštění krevních sraženin Komerční výroba Příprava podjednotkové vakcíny viru HBV v kvasinkách Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu Product Company Therapeutic indication Date approved Příklady rekombinantních vakcín (vakcín obsahujících rekombinantní antigeny) Přehled hlavních typů vakcín A. vakcíny vyrobené tradiční technologií: - živá vakcína -- virulentní (dnes se již nepoužívá) -- heterologní -- atenuovaná - inaktivovaná vakcína -- celobuněčná -- toxoidová - subjednotková -- s purifikovaným antigenem -- se syntetickým antigenem -- ribozomální B. rekombinantní vakcíny: - subjednotková -- s deletovaným genem -- vektorová C. DNA vakcíny D. antiidiotypové vakcíny - Vakcína připravená z protilátek, které považují jiné protilátky za antigen a navážou se na ně. Antiidiotypové vakcíny mohou stimulovat organizmus k vytváření protilátky proti nádorovým buňkám Vazba na receptory mukózy vlastní toxin Struktura choleratoxinu Strategie pro vytvoření delece části peptidu A1 choleratoxinu – příprava kandidátního vakcinačního kmene Vyštěpení části sekvence kódující peptid A1 (klonované v plazmidovém vektoru) – vyštěpí se ~ 90% aminokyselin) Cirkularizace vektoru (připojení XbaI-linkeru, štěpení XbaI, ligace) Přenos vektoru do kmene, v němž je uvnitř genu pro A1 začleněn gen pro rezistenci k tetracyklinu (A1 je inaktivován, buňky jsou TetR) – potenciální reverze A1 vyčleněním tetR – proto není vhodný jako vakcína Vektor se po několika generacích spontánně vyředí Selekce buněk TetS, obsahujících deletovanou formu A1 – tyto buňky tvoří složku A2 a B, a jsou proto imunogenní – reverze není možná Vibrio cholerae Příprava podjednotkové vakcíny proti HSV v buňkách CHO (chinese hamster ovary) Glykoprotein D (gD) imunogenní složka HSV HSV – onkogenní virus, sexuálně přenosná onemocnění, encefalitida, infekce oka Membránově vázaná forma, Úprava genu pro plášťový glykoprotein (gD) HSV pro získání rozpustné formy gD Kompletní gen pro gD obsahující C-terminální úsek kódující transmembránovou doménu – tato forma gD je obtížně purifikovatelná V genu pro gD byla oblast kódující transmembránovou doménu deletována, výsledný produkt je rozpustný a lze jej snáze purifikovat Klonování a exprese genu v savčích expresních systémech (CHO) Využití patogenního druhu Shigella flexneri jako živého vektoru k přenosu DNA pro genetickou imunizaci do savčích epiteliálních buněk Exprese klonovaného genu v cytoplazmě (!euk. P), tvorba produktu, imunizace β-semialdehyd dehydrogenáza Perorální podání Buňky invadují do epiteliálních buněk, ale nemnoží se – vhodný vektor pro přenos DNA Patogenní bakterie – nelze použít k vnesení imunizační DNA ~ nepatogenní bakterie Bakterie není patogenní, nemnoží se, plazmid přechází do cytoplazmy host. buněk Plazmidová DNA s genem pro antigen Deleční mutant Struktura protilátky Fab (antigen binding fragment) Fc Fv Papain (hydrolýza) Stejný primer pro všechny Kombinace milionů klonů pro těžké a pro lehké řetězce Klonování cDNA pro přípravu rekombinantních protilátek Soubor cDNA pro těžké řetězce Lymfocyty získané z imunizované myši (přeskupené geny) Soubor degenerovaných 5´-primerů klonovaná cDNA pro těžký řetězec, stejným způsobem se klonuje cDNA pro lehký řetězec Příprava specifické protilátky Příprava milionů cDNA nesoucích informaci pro L a H řetězce Amplifikace genů pro L a H řetězce pomocí PCR, klonování do fágového vektoru Každý fág obsahuje náhodnou kombinaci L a H Soubor fágů představující kombinatorickou fágovou knihovnu Překlonování do expresního savčího nebo bakteriálního vektoru Miliony „monoklonálních“ protilátek Příprava kombinatorické knihovny VL- a VH- oblastí protilátek v E. coli ve vektoru lambda Lidské B-lymfocyty PCR cDNA H a L řetězců mají odlišná místa pro různé RE, což umožňuje jejich oddělené klonování Mnoho různých kombinací – každý „kombinatorický vektor“ obsahuje jednu kombinaci. selekce Využití v diagnostice/terapii Překlonování vybraných kombinací do plazmidu (fág buňky lyzuje a není možné získat větší množství produktu) Konstrukce kombinatorické knihovny Fv ve vektoru bakteriofága lambda cDNA řetězců L a H separátně klonované ve vektorech lambda (knihovny L-řetězců a H-řetězců) Ligace jednotlivých L a H řetězců a jejich klonování v lambda vektoru Vytvoření kombinatorické knihovny Fv protilátek ve vektoru fága M13 (fágemidech) Klonováním do genu 3 vzniká fúzní protein, který je lokalizován na povrchu fága Spojovací peptid Selekce (ELISA-like) • Lidské chromozomy v hybridomech vytvořených po fúzi lidských lymfocytů s myšími myelomovými buňkami jsou nestabilní, takže se takové hybridomy produkující monoklonální protilátky vytvářejí jen vzácně • Nejsou k dispozici linie lidských myelomových buněk, které by mohly nahradit myší myelomové buňky při tvorbě hybridomů • I kdyby bylo možné vytvářet lidské hybridomové buněčné linie, bylo by to proti lékařským etickým zásadám (injikování specifických antigenů do člověk za účelem jiným než terapeutickým, a odběr části sleziny pro získání lymfocytů) Transgenní myši s geny pro lidské imunoglobuliny v YAC (jejich vlastní geny pro Ig knokautovány, pak imunizace, např. tetanotoxinem – tvoří lidské protilátky) Důvod pro přípravu humanizovaných protilátek: obtížná příprava lidských monoklonálních protilátek konvenční hybridomovou technologií Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské CDRs -complementarity determining regions Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou scFv - single chain antibody variable region fragments (SCA) scFv – terapeutické agents – nové vazebné schopnosti, nižší imunogenicita v důsledku chybění Fc domény, snadnější penetrace do cílového místa (pevné nádory atp). Linker je nutný pro vytvoření konformace schopné vázat antigen Disulfidické můstky (glycin4serin)3 a) b) c) Imunotoxin = MAB s navázaným toxinem (ricin, difterický toxin aj) Date of approval Type of antibody Company Therapeutic use Some therapeutic monoclonal antibodies that have been approved for human use in either the United States or European Union Terapeutické protilátky Aktivace plazminogenu na plazmin, degradace fibrinu Figure 10.16 Structure of an immunotherapeutic thrombolytic agent. Antifibrin antibody, a monoclonal antibody that is specific for the fibrin found in blood clots, is coupled to plasminogen activator (PA). After the complex binds to the fibrin of a blood clot, the plasminogen activator causes plasmin to accumulate in the vicinity of the clot. The plasmin then degrades the clot. Struktura imunoterapeutické trombolytické protilátky. Antifibrinová protilátka (monoklonální protilátka specifická pro fibrin, který se nachází v krevní sraženině) je vázána s aktivátorem plazminogenu (PA). Když se protilátka naváže na fibrin, PA vede k akumulaci plazminu v blízkosti sraženiny. Plazmin (proteáza fibrinolyzin) pak degraduje krevní sraženinu. Schematické znázornění struktury „single-chain“ Fv imunotoxinů (scFv) Záměna peptidového linkeru za disulfidický můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití - exotoxin A Pseudomonas - difterický toxin - ricin Protinádorové působení (vazba na receptory a povrchové proteiny nádorových buněk) Např. fúzní protein HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1 A B human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product. 10-25 aa • An abzyme (from antibody and enzyme), also called catmab (from catalytic monoclonal antibody), is a monoclonal antibody with catalytic activity. Molecules which are modified to gain new catalytic activity are called synzymes. Abzymes are usually artificial constructs, but are also found in normal humans (antivasoactive intestinal peptide autoantibodies) and in patients with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus, where they can bind and hydrolyze DNA. Abzymes are potential tools in biotechnology, e.g., to perform specific actions on DNA. • Enzymes function by lowering the activation energy of the transition state, thereby catalyzing the formation of an otherwiseless-favorable molecular intermediate between reactants and products. If an antibody is developed to a stable molecule that's similar to an unstable intermediate of another (potentially unrelated) reaction, the developed antibody will enzymatically bind to and stabilize the intermediate state, thus catalyzing the reaction. Abzym (Ab-enzym) catmab (catalytic monoclonal antibody) Reaction course Energy Hydrolýza esteru Snížení aktivační energie enzymem nebo abzymem Fosfonátový ester Izolace celkové mRNA RT-PCR cDNA Amplifikace variabilních oblastí L a H řetězců Klonování a skríning Příprava protilátky s enzymovou aktivitou (abzymu) Konjugace analogu k nosičovému proteinu Přenos DNA: • biolistická metoda: rekombinantní plazmid (E. coli) nesoucí gen pro antigen pod kontrolou virového promotoru je vnesen např. do boltce myši • injekce velkých množství DNA (100 mg rek. plazmidu) přímo do svalů zvířat – účinnost přenosu až 70% • elektroporace Výhody: • antigen je správně posttranslačně upraven a není třeba jej purifikovat • na jednom plazmidu mohou být v jednom kroku přeneseny geny pro více antigenů Nevýhoda: • neznalost osudu přenesené DNA v buňkách, začlenění do genomu hostitele a přerušení genů – proto je výhodnější transientní exprese (extrachromozomální stav) Příklady virových antigenů: chřipka, HIV, bovinní HV, vzteklina, HBV, rotavirus, slintavka a kulhavka, aj. Bakteriální antigeny: Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Genetická imunizace - DNA vakcíny Gen kódující antigen je vnesen do buněk zvířete, v nichž je pak tento antigen produkován a zvíře vytváří protilátky. A. Využití mutageneze in vitro pro záměnu klíčových aminokyselin (bodové mutace) • zvýšení termostability proteinů (lysozym aj) • rezistence proteinů k oxidativnímu stresu • zvýšení bioaktivity proteinů druhá generace farmak s vylepšenou farmakokinetikou, strukturou, stabilitou a biologickou dostupností (inzulin – zvýšení schopnosti absorpce, tkáňový plazminogenový aktivátoru – zvýšení poločasu oběhu) Příklad: Subtilizin – hydrolýza proteinů, např. v detergentech prakticky každá vlastnost této serinové proteázy byla pozměněna/optimalizována: • rychlost katalýzy, • substrátová specifita, • tolerance k pH, • tolerance k oxidačním látkám, • termostabilita. • zvýšená stabilita v org. rozpouštědlech (změna konformace proteinu) Proteinové inženýrství Navrhování, vyvíjení a příprava proteinů s vylepšenými charakteristikami (pozměněné nebo zcela nové proteiny) • Klenowův fragment DNA polymerázy, který postrádá 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. • Přidání aminokyselin = stabilizace cizích proteinů v E. coli. • Zvýšení afinity proteinů k iontům kovů vložením sekvence His-X3-His do alfa-helixu – zvýšení rezistence k denaturaci. • Jeden gen je fúzován s druhým za vzniku kompletně nového proteinu. Varianty protilátek – jednořetězcové protilátky (SCA – single chain antibodies) jsou umělé protilátky složené z vazebných oblastí těžkého a lehkého řetězce, které jsou spojeny chemicky a vytvářeny v mikroorganismech pomocí expresních vektorů. • Příprava purifikovaných imunogenních složek v prokaryotických nebo eukaryotických systémech (vakcína proti hepatitidě B ve kvasinkách, vakcína proti Salmonella typhimurium – oslabení kmene vnesením mutace do genomu) • Nepatogenní mikroorganismy použité jako vektory pro expresi cizích genů zodpovědných za imunogenicitu (rekombinantní vakcíny, které stabilně exprimují cizí geny: u Vibrio cholerae byl připraven kmen s delecí v genu pro cholerový toxin – mutace byla vnesena rekombinací do standardního kmene. Výsledný kmen produkoval imunogenní, avšak netoxický „toxin“ (netoxickou B podjednotku toxinu). • viry jako vektory pro expresi imunologicky aktivních proteinů (virus vakcinie – rekombinantní vakcíny proti vzteklině) B. Makromodifikace proteinů Část genu se eliminuje vyštěpením restrikčního fragmentu nebo nahradí chemickou syntézou části genu. • Genetickou úpravou lze připravit bakterii, která by produkovala modré barvivo používané na džínovinu. Výroba barviva by byla mnohem ekologičtější nežli současná chemická syntéza, která ročně produkuje asi 16 000 tun tohoto barviva. • Podle evropské legislativy budou muset být takové džíny na viditelném místě označeny nápisem: "Vyrobeno z geneticky modifikovaných organismů".