 Struktura chromatinu - kompartmentalizace interfazních jader  Morfologické a jaderně-topografické aspekty buněčné diferenciace.  Apoptóza a struktura chromatinu.  Cytoskelet a jaderná matrix - studium cytoskeletu pomocí mikroskopie s vysokým rozlišením.  BAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH techniku  Epigenetické procesy probíhající v buněčných jádrech.  Cytogenetické a jaderně-topografické změny u nádorových buněk.  Konfokání mikroskopie. Buněčné jádro Struktura chromatinu vyššího řádu Eva Bártová www.tqnyc.org 146bp 60 bp CHROMATIN: materiál jader eukaryotních buněk; nukleoproteinový komplex tvořený DNA vázanou na histony a další bílkoviny. V nedělícím se jádru lze rozlišit euchromatin, kde probíhá transkripce, a heterochromatin, který je transkripčně inaktivní. . HISTONY: skupina basických bílkovin v jádře eukaryotních buněk, kde vytvářejí reversibilní komplexy s DNA. Rozlišuje se pět typů histonů: H1, H2A, H2B, H3 a H4. Histony H2A, H2B, H3 a H4 tvoří vždy ve dvou kopiích oktamery, kolem nichž se obtáčí dvojšroubovicová DNA; tento útvar se nazývá nukleosom. Histon H1 je přítomen v menším množství než ostatní histony, a ačkoli je též vázán na DNA, není součástí nukleosomů. Histony se tak podílejí na uspořádání DNA v eukaryontním chromosomu do vlákna vyššího řádu. NUKLEOSOM Histone signature Brno nomenclature for histone modifications (Turner, 2005) CT-IC MODEL (T. Cremer) Chromatinové meziprostory T. Cremer group, Munich Struktura chromatinu a jederné procesy Pozdně a časně se replikující chromatin T. Cremer group, Munich Replikační ohniska Nuclear compartments: 1. Nucleolus 2. Splicing speckles 3. Cajal bodies 4. PML bodies 5. snRNP speckles Nuclear and cytoplasmic bodies involved in snRNP assembly. Liu J , Gall J G PNAS 2007;104:11655-11659 ©2007 by National Academy of Sciences Andersen et al., Nature, 2005 HP1 proteins Kondenzace chromatinu Figure 23-38, p. 1094, Molecular Cell Biology, 3rd ed., Lodish, et al., copyright 1995, Typy chromozomů: metasubmeta-, akrocentrické p q Transcriptome map (Caron et al., 2001) HSA 18 and 19 (positioning and gene density) T. Cremer group, Munich Telomeres (TTAGGG sequence and different proteins) Telomerase is composed of two subunits, Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT, the 'h' is for human) and hTR (Telomerase RNA). These two subunits are coded for by two different genes in the genome. Using hTR template, hTERT can add a six nucleotide repeating sequence, 5'-TTAGGG to the 3' strand of chromosomes. This repeating TTAGGG sequence is called the telomere. The template region of hTR is 3'-CCCAAUCCC - 5’. DNA repair foci TRANSKRIPCE: přepis, biosynthesa řetězce RNA podle templátového řetězce DNA, přičemž jednotlivé nukleotidy jsou připojovány na základě komplementarity (viz base nukleových kyselin). Klíčovým enzymem této synthesy je RNA-polymerasa. Transkripce probíhá ve třech stupních: a) iniciace (zahájení), kdy se RNA-polymarasa váže na specifickou sekvenci DNA (viz promotor) a přesunuje se k místu, kde začíná vlastní synthesa; b) elongace, kdy se RNA-polymerasa posunuje podél řetězce DNA, uvolňuje kódující řetězec a podle templátového řetězce postupně synthetisuje novou RNA tím, že na volnou 3´-OH skupinu ribosy připojuje komplementární nukleotidy, jejichž donorem jsou nukleosidtrifosfáty; vznikající RNA se postupně uvolňuje od komplexu s DNA a dvojitý helix DNA se samovolně obnovuje; c) terminace (ukončení synthesy a úplné uvolnění RNA) je signalisováno zvláštními sekvencemi ve struktuře DNA, které jsou rozpoznávány bílkovinami, tzv. terminačními neboli ρ (ro) faktory. Řízení transkripce jednotlivých genů patří k nejdůležitějším mechanismům regulace enzymové aktivity a diferenciace buněk. Alternative splicing is a form of epigenetic mechanism that enables a single gene to give rise to multiple, differentially spliced versions of a protein, increasing complexity without a change in the genome. A-type lamins Faktory sestřihu jsou v SC-35 doménách, dále snRNP U1-U6 jsou součástí faktoru sestřihu SF2/ASF Luco et al., Science (2010) Bartova group Note: Interleukin-1beta pre-mRNA splicing proceeds in cytoplasm of enucleated platelets (Denis M. et al., 2005). Volpi et al., 2000 MHC on HSA 6 Active / inactive chromatin T. Cremer group, Munich IMTERMINGLING Scheuermann et al., Exp. Cell Res. (2004) G1 G2 Rb1 gene Bártová et al., 2002 Genes in human embryonic stem cells Transcriptome map (Caron et al., 2001) Enterocytic cell differentiation and RIDGE/ANTI-RIDGE Center of nucleusto-gene distances Gene-to-gene distances Gene-center of nucleus-gene angles 100* i i CH CR CS = 100* 2/)( 21 21 CHCH RR SS + = 21 21 * * )cos( CRCR CRCR =α R1 R2 H2 H1 Gajdušková P. T. Cremer group Harničarová et al., 2005 HSA 8 and related structures Nucleolus NOR 400 (540) rDNA genů FIBRILÁRNÍ CENTRUM (FC): zodpovídá za změny v buněčné aktivitě DENSE FIBRILAR COMPONENT (DFC): místo syntézy ribozomálních podjednotek GRANULAR COMPONENTS: ukotvuje DFC a FC Tvorba ribozomů je komplexní proces zahrnující transkripci 45S prekurzorické rRNA, její vyzrávání, modifikaci a asociaci s ribozomálními proteiny a 5S rRNA, která se syntetizuje mimo jadérko. Vyzrávání rRNA probíhá v procesomu, který obsahuje mnoho komplexů a snRNA SUV39h-independent association of HP1β with fibrillarinpositive nucleolar regions Epigenetics of Nucleoli human mouse Fibrillarin/chromocenters Differencies between epigenetics of nucleoli and surrounding chromatin HP1β MEF cells Yuan et al. ( 2007) Bártová et al., JHC (2009) Epigenetics of nucleoli Experiments: Petra Sehnalová HP1β interacts with UBF FRET analysis Experiments: Petra Sehnalová HP1β – UBF FRET efficiency > 50% ZÁVĚR Struktura chromatinu hraje důležitou úlohu v regulaci jaderných procesů jako je replikace, transkripce, sestřih a DNA reparace.