Epigenetické procesy probíhající v buněčných jádrech. Eva Bártová Biofyzikální ústav AV ČR Brno What is epigenetics ? Epigenetics refers to heritable changes in the phenotype that occur irrespective of alterations in the DNA sequences. Berger et al., Genes Dev. (2009) Nucleosome 1. Buňka může existovat i bez významně redukovaného množství H1. 2. H1 varianty nejsou hlavní determinanty buněčného fenotypu. 3. Funkce H1 variant je nejenom při utlumení transkripční aktivity ale také při její aktivaci (může snižovat nebo i zvyšovat expresi specifických genů. 4. H1 hraje důležitou úlohu v kondensaci chromatinu. Spíše je důležitý pro stabilizaci nukleosomů než pro vlastní řízení kondenzace chromatinu. 5. Experimentálně navozená redukce H1 vede ke zkrácení linkerové DNA The linker histone H1 is involved in maintaining higher-order chromatin structures and displays dynamic nuclear mobility, which may be regulated by posttranslational modifications. H1 tail phosphorylation play in important role. Using the technique of fluorescence recovery after photobleaching, Contreres et al., 2003 observed that the mobility of a GFP-wild-type H1 fusion protein is dependent on Cdk2 activity. GFP-H1 mobility was decreased in cells with low Cdk2 activity but not in the cells with bloked phophorylation of H1. Decreased mobility of GFP-H1. Overexpression p21 GFP-H1b GFP-M1-5 Experiments of E. Meshorer Varianty histonů H1: varianty H1o, H5 a testis-specific varianta H1. varianty H1 se různě uplatňují během buněčného cyklu, diferenciace a vývoje. RA diferenciace myších F9 je doprovázena zvýšenou transkripci histonu H1o. H2A: H2A.X, H2A.Z, MacroH2A, H2A-Bbd, H2AvD, H2A.X. varianta H2A.Z je konzervativní během evoluce. Macro H2A se vyskytuje u Xi, zatímco H2A-Bbd u Xa chromosomu a autosomů. H2A.Z se vyskytuje v intergenických oblastech. H2B: nemá varianty, uplatňuje se při regulaci kondenzace chromatinu, represi transkripce a během gametogeneze, H2B je zodpovědný za uspořádání chromatinu u spermií – nahrazení histonů protaniny . Protamines (P1/P2) are small, arginine-rich, nuclear proteins that replace histones late in the haploid phase of spermatogenesis and are believed essential for sperm head condensation and DNA stabilization. However, in humans and maybe other primates, 10- 15% of the sperm's genome is packaged by histones thought to bind genes that are essential for early embryonic development. Almouzni and Probst, Nucleus (2011) H3K9me1 deposition in cytoplasm Pinheiro et al., Cell (2012) Varianty histonů H3: existují dvě hlavní Varianty H3.3 a centromerické varianty H3 (cenH3) = CENP-A-Z: jsou zodpovědné za vazbu kinetochoru a segregaci sesterských chromatid u eukaryot Varianty histonů H3: fosforylace CENP-A (Ser-7) je essenciální pro funkci kinetochoru. Overexprese CENP-A doprovází vznik aneuploidie u kolorektální karcinomů. Varianty histonů H4: většina genů kódujících hlavní histonové proteiny jsou exprimovány během S fáze buněčného cyklu. V případě H4, geny jsou konstitutivně exprimovány během buněčného cyklu. Pro H4 nejsou známy žádné varianty. Úpravy pre-mRNA histonů probíhají v Cajal bodies. Biochemické modifikace histonů • Dynamická struktura chromatinu je přímo ovlivněná post-translačními modifikacemi Nterminálních konců histonů • Typy histonových modifikací: a) acetylace, b) methylace, c) fosforylace, d) polyadenylace, e) ubiquitinace • Methylace histonů byla objevena již před 30 lety. Vztah mezi acetylací a metylací histonů: acetylace histonů je katalyzována histonovými acetyl-transferázami (HATs) a odstraňo-vána histonovými deacetylázami (HDACs). HDACs odstraní acetylskupinu, která je nahrazena methyl skupinou za účasti HMTs (Suv39H1human, Clr4 – S.pombe) 2004: Objev demethylace histonů za účasti aminové oxidasy LSD1 (KIAA0601) (Shi et al., Cell 2004). LSD1 specificky demethyluje H3 (K4), epigenetickou modifikaci zodpovědnou za transkripční aktivitu. HATs: HAT1, PCAF, CBP/p300, TFIIC90, ELP3, SRC1, CLOCK (see Allis et al., 2007). HDACs: Class I, II, III HMTs: SUV39H1, SUV39H2, G9a, MLL1, hSet 1, hSet 2, SUV4- 20H1, SUV4-20H2, EZH2 (PcG silencing) Demethylases: LSD1 (antagonizuje H3K4me-transcriptional activation), JHDM1b (H3K4me3), Jmjd2b (H3K9me3), JHDM2a, JMJ D2B (antagonizuje H3K9me2/me3 heterochromatin formation) MeCP2: Methyl-CpG binding Protein, specifically binds to to methylated DNA INAKTIVITY HP1 protein CD: protein-chromatin CSD: protein-protein HD: HP1-to-DNA and linker histones Lujsterburg et al. (2009) Experiments of Gabriela Galiová and Lenka Stixová HP1β protein in DSBs Experiments of Gabriela Šustáčková Misteli and Soutogou (2009) DNA repair Chou et al., PNAS (2010)Šustáčková et al., JCP, 2011 ATP depletion HP1 proteins •HP1 proteiny jsou hlavní složkou heterochromatinu a hrají důležitou úlohu při jeho tvorbě. HPs jsou mají vysokou afinitu k pericentromerickým a telometrickým oblastem chromosomů. • HPs interagují s HMTs jako je SUV39h1 a SUV39h2, která jsou zodpovědné za methylaci H3(K9). Hayakawa et al., 2003 HP1 proteiny – v lidských buňkách jsou 3 sub-typy HP1 proteiny u ECS HP1α HP1β HP1 protein a H3(K4) di-methylation and IC spaces HP1 Chadwick nad Willard, PNAS, 101, p.17450-17455 Inaktivace X chromosomu ve vztahu k epigenetickým modifikacím Inactivation of X chromosome in hESC Inaktivace X chromosomu ve vztahu k epigenetickým modifikacím IMPRINTING Myší embryo: samičí alela je zamethylována, nevyjadřuje se Dospělý jedinec: obě alely jsou demethylovány Gametogeneze: se obnoví původní stav Platí pro gen IGF II. ISSN1471-0056 1. Independent of the classical Mendelian inheritance. 2. Methylation and histone modifications in order to achieve monoallelic gene expression. Methylation state of telomeres (Cbx1=HP1β, Cbx3=HP1γ, Cbx5 = HP1α) Experiments of E. Bártová H3K27me3 H2AK119Ub K27 K27me3 H2AK119Ub1 Metody Metody vhodné ke studiu histonového kódu 1. imunofluorescence-konfokální mikroskopie 2. GFP-technologie 3. ChIP-PCR 4. ChIP-on-chip H3K9 acetylation in ARH77 cells Ukázkové experimenty Eva Bártová, Lenka Stixová, Soňa Legartová, Gabriela Galiová and Stanislav Kozubek Institute of Biophysics, the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Brno NUCLEAR ARRANGEMENT AND KINETIC PROPERTIES OF JMJD2B HISTONE DEMETHYLASE The involvement of demethylases in AR-mediated transcription. Cloos PA et al. Genes Dev. 2008;22:1115-1140 ©2008 by Cold Spring Harbor Laboratory Press H3K4me Phylogenetic tree of the JmjC family of demethylases. Cloos PA et al. Genes Dev. 2008;22:1115-1140 ©2008 by Cold Spring Harbor Laboratory Press JMJD2b histone lysine demethylase Mutant genetic background affects functional re-arrangement and kinetic properties of JMJD2b histone demethylase Dieter Egli, Garrett Birkhoff & Kevin Eggan (2008) Nature Reviews Molecular Cell Biology 9, 505-516 JMJD2b JMJD2b histone lysine demethylase Jmjd2b histone lysine demethylase SUV39h (wt) SUV39h (wt) Eva Bártová, Gabriela Šustáčková, Lenka Stixová, Soňa Legartová, Darya Orlova, Veronika Foltánková Institute of Biophysics, the Academy of Sciences of the Czech Republic, v.v.i., Brno Projects: Ministry of Education Youth and Sports of the Czech Republic; the research projects LC535, LC06027, and ME 919. The Academy of Sciences of the Czech Republic: AVOZ50040702 and AVOZ50040507 and the Grant Agency of the Czech Republic by grant no. P302/10/1022. European Union project COST TD09/05 and corresponding national COST-CZ project LC11020. Marie Curie project PIRSES-GA-2010-269156.